專利名稱：沙門菌屬抑制組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含以來自乳酸菌發(fā)酵液的成分作為有效成份的沙門菌屬抑制組合物。更具體地講，本發(fā)明涉及可作為用于預防或治療沙門菌屬感染的飼料添加劑、醫(yī)藥或保健食品的組合物。
但是，這些方法中，抗生素有這樣一些問題容易產(chǎn)生抗菌性，清除生物體內發(fā)揮有利作用的正常菌群，抗生素移行、殘留到加工的畜產(chǎn)物中等問題(《飼料添加物在畜產(chǎn)物中的殘留》畜產(chǎn)手冊，姬野健太郎等編著，講談社，1984，pp.484-485)。
疫苗的問題是只對特定的病原菌有效，并且效果的持續(xù)時間也有限(《日本的畜產(chǎn)業(yè)》，預測日本畜產(chǎn)業(yè)的最新手冊，チクサン出版，1989，pp.21～35)。
各種生菌劑要冷藏保存，保存時間也短，價格高，除此之外，有必要大量施用給要建立腸內菌群的動物。
使病原菌凝集而抑制其附著于腸壁的甘露寡糖能使48％的病原性沙門菌屬凝集，抑制其腸壁附著，但問題是對殘余的病原性沙門菌屬無效。[清水干夫甘露寡糖的特征和有用性，養(yǎng)雞之友，6月，14～18(1996)]。
寡糖生息于動物的大腸，與其它細菌一起促進形成腸內菌群的雙尾菌的增殖，雖然有抑制沙門菌屬的效果，但價格高，且效果不確定。[例如，深田恒夫等，寡糖對雞沙門氏菌的感染抑制效果，雞病研報31，113～117(1995)]。
此外，這些抗生素，疫苗，各種生菌劑，凝集病原菌抑制其腸壁附著的甘露寡糖等寡糖，與其說它們自身不含有動物喜歡的香料成分，倒不如說由于它們含有動物討厭的臭味，作為飼料添加劑有其不利之處。
如上所述，以往的技術中涉及沙門菌屬抑制目的物質，起到一定的作用，但有異臭，不能提高動物對它們自身的嗜好性。所以，在作為飼料添加劑使用時，很難增大飼料的攝取量，增進動物的自身狀態(tài)。
因此本發(fā)明的目的是提供具有沙門菌屬抑制效果，同時提高動物嗜好的組合物。
本發(fā)明提供沙門菌屬抑制組合物，其有效成分是從明串珠菌(Leuconostoc)屬、鏈球菌(Streptococcus)屬及鏈桿菌(Streptobacterium)屬選擇至少1種乳酸菌屬的菌株，在含有蔗糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵，由發(fā)酵液而來的制備物。
另外，本發(fā)明的其它方案是提供沙門菌屬感染性疾病預防或治療的方法，該方法包括將有效量的預防或治療沙門菌屬感染性疾病的上述發(fā)酵液來源的制備物施與受試動物。
再者，本發(fā)明的其它方案提供上述發(fā)酵液來源的制備物在制造動物沙門菌屬感染癥預防或治療用組合物的有效成分中的使用。
能使上述菌發(fā)酵的含有蔗糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基包含單獨形式的蔗糖或者蔗糖作為一成分而包含在內的甘蔗屬，甜菜榨汁后的渣，或者從甘蔗屬、甜菜中制備砂糖時所產(chǎn)生的副產(chǎn)物-糖蜜、甜菜漿、甘蔗渣等作為蔗糖來源。除蔗糖以外向培養(yǎng)基中添加的成分是對動物基本上無害的物質或化合物，例如啤酒酵母提取物，蛋白胨，玉米漿，大豆蛋白，食鹽，HCl，K2HPO4等。
本發(fā)明的發(fā)酵通常是在上述培養(yǎng)基滅菌后接種適當?shù)娜樗峋?5℃左右，厭氧條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)時間要根據(jù)所使用的菌、溫度或培養(yǎng)基的組成有所變動，所以沒有限定，但是乳酸菌有必要選擇至少從對數(shù)增殖期到靜止期時間段的時間，培養(yǎng)時間過短有可能獲得對動物的沙門菌效果低的組合物。
如此從發(fā)酵液獲得的本發(fā)明的沙門菌抑制組合物含有的有效成份是發(fā)酵液自身，或者是用水混和的有機溶劑對該發(fā)酵液進行沉淀，除去沉淀物后的上清或由之而來的制備物作為有效成分。因而本發(fā)明中所說的制備物就是前面所講的發(fā)酵液自身或由發(fā)酵液而來的上清的濃縮物，后面所述的菌體去除物、及噴霧干燥物和冷凍干燥物等。得到上述的上清的通常適宜進行分級沉淀處理。進行分級沉淀處理時所應用的有機溶劑包括乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇等。進行分級沉淀處理時對應發(fā)酵液所應用的有機溶劑的量要根據(jù)所應用的有機溶劑的種類而進行最適量的變動，但使用乙醇時，通常1體積的發(fā)酵液對應0.7-4體積的有機溶劑。處理溫度為15～35℃，優(yōu)選環(huán)境溫度。
進行上述分級沉淀處理的前后或同時可從發(fā)酵液中去除菌體，包含去除菌體的制備物的沙門菌屬掏組合物也由本發(fā)明提供。菌體的去除可通過過濾或離心進行。如此所得的制備物的優(yōu)點是便于作為藥品或保健食品使用，作為飼料添加劑使用時也使用容易(例如，有效成分的均質配合等容易)。
如從上面的敘述可理解的，在本發(fā)明的組合物中作為有效成分所使用的來自上清的制備物是葡聚糖發(fā)酵副產(chǎn)物本身，或必要時除去菌體，再進行脫鹽，除去有機溶劑后，濃縮為7～17倍的純化濃縮物形式的物質，而以往制備葡聚糖時，不可避免的是它們作為副產(chǎn)物不被利用而直接被廢棄，所以該物質極為廉價。上述上清按使用的有機溶劑的種類或使用量，可提供基本上不含葡聚糖的物質，這樣的上清也可達到本發(fā)明所預期的目的。
本發(fā)明可提供，例如將上述制備物以液狀或漿狀(濃縮物)單獨溶解于水、生理鹽水溶液中的溶劑，或者與藥用賦形劑或載體或飼料原料配合的組合物。另外也可提供將液狀或漿狀制備物與醫(yī)藥領域和飼料領域常用的顆?；蚬绦位噭缗c顆粒狀葡萄糖、無水硅酸、殼物渣、面包屑、大豆渣、麩皮、可可豆皮等，配合的固形組合物。固形組合物的制備是將上述液狀或漿狀制備物進行冷凍干燥或噴霧干燥，或者將這樣制備的干燥物與上述顆?；噭┗蛘咂渌卺t(yī)藥、飼料領域內常用的賦形劑混合，制成本發(fā)明的沙門菌屬抑制組合物。以上的調配、配合及混合法可根據(jù)劑型使用本身已知的方法。
依照本發(fā)明，不受什么拘束，按照下面的作用程序就可推測出能達到目的效果的物質。將上述乳酸菌接種到蔗糖含有組合物中，培養(yǎng)時，蔗糖的構成糖葡萄糖和果糖中，葡萄糖聚合形成葡聚糖，另一方面，產(chǎn)生果糖的情況是在不同情況下，果糖在果糖基轉移酶的作用下聚合，以寡聚或多聚果糖的形式存在。此外，菌產(chǎn)生以乳酸、香味成分物質為代表的各種物質，所以能形成含有多種成分的發(fā)酵湯，推測多種成分中包含乳酸、果糖、甘露糖醇、明串珠菌二糖、用于發(fā)酵的乳酸菌菌體、及其它成分。該發(fā)酵液如上用有機溶劑進行分別沉處理后，上清部分中估測含有上述乳酸和香味成分，果糖、甘露糖醇、明串珠菌二糖、葡聚糖、寡聚多聚果糖、其它的培養(yǎng)液成分、以及不同情況下發(fā)酵中應用的乳酸菌菌體，所以可很便利地提供本發(fā)明的制備物?？梢酝茰y，這些成分組合起來無害，提高動物的嗜好性，并且在雞的沙門菌屬攻擊試驗中降低糞便的pH、有腸粘膜侵襲的抑制效果及沙門菌屬定居抑制效果，并且在熱應激中通過死亡率的抑制作用和降低糞便pH作用，增加動物的體格狀態(tài)，發(fā)揮生產(chǎn)出無沙門菌的雞蛋、肉、牛奶的優(yōu)良效果。
本發(fā)明的沙門菌屬抑制組合物中所包含的作為有效成分的制備物的使用比率要根據(jù)使用目的進行變動，例如按藥用、保健食品用或飼料添加物用時最適量有所變動，其量不能限定，但是該領域的專業(yè)人員可參照后述的實施例中的作用效果進行決定。一般情況下，例如用作配合飼料添加物，使用濃縮了12倍的濃縮物時，占總組合物重量的0.01～10.0％重量，優(yōu)選0.05-5.0％。
所講沙門菌屬抑制組合物可用于雞及火雞等家禽，以及牛、馬、豬、狗、貓等家率或寵物，其它動物、人中沙門菌屬感染的預防或治療，并且有增進飼料攝取量的作用。
以下通過實施例對本發(fā)明的沙門菌屬抑制組合物進行更具體地說明，但本發(fā)明并不限定于此。實施例1以蔗糖為主原料時上清液濃縮物的制備將乳酸菌中的腸膜明串珠菌菌(Leuconostoc mesenteroides)ATCC10830(NRRL B-512)接種到以蔗糖為主原料的具有下述組成的培養(yǎng)基中，25℃、24小時，厭氧條件下發(fā)酵后，向1體積的發(fā)酵加入1體積的乙醇，收集其上層澄清液。將上清液過濾，除去菌體，約80℃、減壓下(540～580mmHg)下除去乙醇，將液量濃縮到約1/12，制備出上清液的濃縮物。所制備的濃縮物的性狀和液相色譜圖(參照

圖1)如下。培養(yǎng)基的組成蔗糖 15.01％磷酸氫二鉀0.5％啤酒酵母提取物0.2％pH7.0濃縮物的性狀外觀淡褐色至褐色粘稠液香味有酸甜香味，無異味臭味糖度(Bx)65°
pH 5.4干燥減重31.6％果糖42.0％寡糖*23.2％*從圖1的結果預測包含明串珠菌二糖、甘露糖醇、寡聚至多聚果糖及葡聚糖。液相色譜的操作條件(對應圖1)上樣量2.0(重量/體積)％液80μl柱G2000PW×2(東ソ一社)洗脫液0.1MNaCl水溶液流速1.0ml/分溫度25℃壓力90kg/cm2檢測器RI×1紙速0.5cm/分實施例2以糖蜜為主原料時上清液濃縮物的制備將乳酸菌中的一種牛鏈球菌(Streptococcus bovis)ATCC33317(NCDO597)接種到向1體積糖蜜中加入2體積蒸餾水的如下組成的培養(yǎng)基中，25℃、24小時，厭氧條件下發(fā)酵后，向1體積發(fā)酵液中加入1體積乙醇，收集其上層澄清液。將上清液過濾除去菌體，80℃、減壓下(540-580mmHg)去除2醇，將液量濃縮到1/12左右，制備出上清液的濃縮物。所制備的濃縮物的性狀和用液相色譜進行的測定值如下。培養(yǎng)基的組成糖蜜 15.0％磷酸氫二鉀0.1％pH 6.2濃縮物的性狀外觀淡褐色至褐色粘稠液香味有酸甜香味，無異味臭味糖度(Bx)62°pH 5.2
干燥減重33.5％果糖39.6％寡糖22.9％實施例3以上清液的濃縮物為原材料制備混合飼料使用顆粒狀葡萄糖(グルフアイナル、日本資糧工業(yè)社)作為粉末化試劑，向其9kg中加入1kg實施例1中制備的濃縮物，用橫形漿式混合機混合5分鐘，制備出混合飼料。所制備的混合飼料(也叫做組合物)的性狀如下。
外觀淡黃色粉末香味有甜酸香味、無異味臭味干燥減重9.5％葡萄糖 79.0％果糖4.0％寡糖2.5％實施例4以上清液的濃縮物為原材料制備混合飼料使用硅酸(和光純藥工業(yè)社制)作為粉末化的賦形劑，向其9kg中加入1kg實施例2中制備的濃縮物，用橫型漿式混合機混合5分鐘，制備成混合飼料。所制備的混合飼料(也叫做組合物)的性狀如下。
外觀淡黃色粉末香味有甜酸香味、無異味臭味干燥減重9.1％硅酸80.5％果糖4.2％寡糖2.8％實施例5采卵雞種·沙門菌屬定居抑制試驗方法用初日齡的白色來享雞(♂)，30只一組分3組。
1)對照組給予實驗用幼雛飼料，直到實驗終了2)組合物組從孵化日開始到實驗終了，給予添加了0.3％實施例3組合物的飼料3)CE劑組按說明書溶解生菌劑中的CE劑*，于初日齡強制給予0.2ml*雞盲腸內容物培養(yǎng)飼料
1周齡時給所有的雞經(jīng)口施予腸膜明串珠菌(S.enteritidis食物中毒由來的噬菌體型ファ一ジタイプ4型)約107個。
施用腸膜明串珠菌的第2天、1周后和2周后進行解剖檢查，檢查1g盲腸內容物中的腸膜明串珠菌數(shù)。結果1g盲腸內容物中腸膜明串珠菌數(shù)(表-1)給予腸膜明串珠菌的第2天，組合物組與對照組相比，腸膜明串珠菌的數(shù)目約減少2級(オ一ダ一)，統(tǒng)計學上有顯著性差異。
給予腸膜明串珠菌后第7天，組合物組與對照組相比，腸膜明串珠菌數(shù)目顯著性減少。
給予腸膜明串珠菌后第14天，各組中分離出的菌數(shù)均減少。
表-1給1周齡的雛雞施用腸膜明串珠菌時1g盲腸內容物中的腸膜明串珠菌數(shù)

*P＜0.05a)腸膜明串珠菌數(shù)對數(shù)值均值±標準誤差b)腸膜明串珠菌陽性雞數(shù)/所用雞數(shù)*5％的顯著水平，與對照組比有顯著的差異實施例6肉用仔雞·沙門菌屬攻擊試驗方法1周齡的肉用仔雞(Arbor Acres)，1組30只，準備2組，進行如下分組、處置。
1)對照組給予肉用仔雞用飼料，直到實驗終了2)組合物組給予添加了0.3％實施例3中組合物的肉用仔雞用飼料，直到實驗終了兩組從1日齡～19日齡，均是自由攝取配合飼料和水，分另于第13日、第18日經(jīng)口給予腸膜明串珠菌，次日解剖，測定腸粘膜的侵襲程序和盲腸糞的pH。結果1)腸粘膜的侵襲(表-2)14日齡，經(jīng)腸膜明串珠菌攻擊后，對照組中26/30只(86.6％)、組成群中15/30只(50％)。
19日齡，經(jīng)腸膜明串珠菌攻擊后，對照組25/30只(83.3％)，組合物組16/30只(53.3％)。
14日齡，19日齡時，與對照組相比組合物組均能顯著性抑制腸粘膜的侵襲。
2)盲腸糞的pH(表-3)14日齡，經(jīng)腸膜明串珠菌攻擊，對照組為6.5±0.3，組合物組為5.6±0.2。
19日齡時，經(jīng)腸膜明串珠菌攻擊，對照組為6.6±0.5，組合物組為5.7±0.3。
與對照組相比，組合物組于14日、19日齡均能顯著性降低盲腸糞pH。表-2腸粘膜的侵襲

*P＜0.05表-3盲腸糞的pH

*P＜0.05實施例7雞·沙門菌屬攻擊時死亡率的改善效果方法體重40g左右的雞，1組45只，用3組，進行如下分組、處置。
1)對照組給予雞用飲料直至實驗終了
2)組合物組 給予添加了0.1％實施例3中組合物(添加0.1％) 的雞用飼料，直至實驗終了3)組合物組 給予添加了0.3％實施例3中組合物(添加0.1％) 的雞用飼料，直至實驗終了3組是在實驗開始10日后經(jīng)口給予2.7×1011CFU的腸膜明串珠菌，2、4、6周后檢測糞便中的沙門菌數(shù)。
觀察6周后的死亡率及便的pH(6只)。
另外，從實驗開始到結束的6周期間，3組均是自由攝取上述飼料和水。結果1)糞便中的沙門菌數(shù)6周后糞便中的沙門菌數(shù)是對照組2、4、6周后為0.95、0.34、0.20×10，組合物組(10.1％添加)2、4、6周后為0.6、0.29、0.10×10，組合物組(0.3％添加)2、4、6周后為0.48、0.21、0.00×10，具有抑制傾向。
2)死亡率6周后的死亡率，對照組為17.78％，組合物組(0.1％添加)11.11％，組合物組(0.3％添加)為6.67％，具有抑制傾向。
3)便pH6周后的便pH，對照組為7.17，組合物組(0.1％添加)為6.22，組合物組(0.3％添加)為6.05，有顯著性差異。表-4沙門菌菌數(shù)、死亡率及便pH

*有顯著性差異實施例8熱應激死亡率的改善效果方法體重40g左右的雞，1組45只，準備3組，進行如下分組、處置。
1)對照組 給予雞用飼料直到實驗終了2)組合物組給予添加了0.1％實施例3中組合物的雞(0.1％添加) 用飼料，直到實驗結束3)組合物組給予添加了0.3％實施例3中組合物的雞(0.3％添加) 飼料，飼料直到實驗結束從實驗開始到結束6周期間，3組的熱應激飼養(yǎng)均是1天內12小時的溫度為40±1℃，溫度75±5％，剩余的12小時在24～26℃飼養(yǎng)。
另外，從實驗開始到結束6周間，3組均是自由攝取水和上述飼料。
檢測6周后的死亡率和便pH(表-5)結果1)死亡率6周后的死亡率，對照組為33.33％，組合物組(0.1％添加)為17.78％，組合物組(添加0.3％)為11.11％，有這樣的抑制傾向。
2)便pH6周后的便pH，對照組為7.12，組合物組(0.1％添加)為6.28，組合物組(0.3％添加)為6.23，有顯著性差異。表-5死亡率和便pH

*有顯著性差異產(chǎn)業(yè)上利用的可能性。
向出生后至幼期、及成體動物的配合飼料中添加上述制備物0.01-10％，優(yōu)選0.05-5.0％，經(jīng)口給予后，可預防和治療盲腸便中的沙門菌感染和腸粘膜侵襲，可以進行畜產(chǎn)物的無沙門菌屬生產(chǎn)。因此，本發(fā)明可用于，如養(yǎng)雞業(yè)。
權利要求
1.沙門菌屬抑制組合物，以在含有蔗糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基中使至少1種選自明串珠菌(Leuconostoc)屬、鏈球菌(Streptococcus)屬、鏈桿菌(Streptobacterium)屬的乳酸菌屬菌珠發(fā)酵，由所得發(fā)酵液而來的制備物。
2.權利要求1的組合物，其中由發(fā)酵液而來的制備物是用水混合性有機溶劑對發(fā)酵液進行分級沉淀處理后而得到的上層澄清液。
3.權利要求1或2的組合物，其中明串珠菌屬的乳酸菌為腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。
4.權利要求1或2的組合物，其中鏈球菌屬的乳酸菌為牛鏈球菌(Streptococcus bovis)。
5.權利要求1或2的組合物，其中前面所說的制備物是經(jīng)過去除菌體的物質。
6.權利要求2的組合物，它是通過與顆?；瘎┙M合而形成的固形化產(chǎn)物。
7.用于預防或治療家禽或家畜沙門菌屬疾病的組合物，其有效成分是，在含有蔗糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基中使至少1種選自明串珠菌(Leuconostoc)屬、鏈球菌(Streptococcus)屬、鏈桿菌(Streptobacterium)屬的乳酸菌屬菌株發(fā)酵，由所得發(fā)酵液而來的制備物。
全文摘要
沙門菌抑制組合物,其有效成分為:用含有蔗糖的培養(yǎng)基使屬于明串珠菌(Leuconostoc)屬、鏈球菌(Streptococcus)屬、鏈桿菌(Streptobacterium)屬的乳酸菌發(fā)酵,得到的發(fā)酵液自身,或者是用水混合性有機溶劑進行分級沉淀處理后,由所得上清而來的制備物。
文檔編號A61K35/66GK1328468SQ9981381
公開日2001年12月26日 申請日期1999年11月25日 優(yōu)先權日1998年11月26日
發(fā)明者深田恒夫, 小川孝雄, 廣瀨公男, 鬼頭恭二 申請人:名糖產(chǎn)業(yè)株式會社