專利名稱：沙門菌分離、鑒定的試劑盒、制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明針對腸道病原菌中沙門菌屬(包括傷寒、副傷寒和非傷寒、副傷寒沙門菌)的同步分離和鑒定方法，特別涉及利用多種選擇性分離培養(yǎng)基對應(yīng)生長的典型菌落形態(tài)、簡易生化和特異性酶-底物反應(yīng)組合試驗鑒定包括傷寒、副傷寒和非傷寒、副傷寒沙門菌在內(nèi)的所有沙門菌(血清型)的試劑盒、制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
沙門菌目前已經(jīng)明確的分類包括2個模式種，6個亞種，近2500個血清型，和人類有關(guān)系的主要為傷寒、副傷寒和非傷寒、副傷寒沙門菌(多屬于亞種I )，由于傷寒和副傷寒沙門菌的致病特征、生物學(xué)性狀與大多數(shù)的非傷寒、副傷寒沙門菌存在較大的差異，造成許多實驗室在實際工作中無法通過一種簡單的微生物常規(guī)分離方法達到同時分離所有沙門 菌病原(血清型)的預(yù)期效果，反而受制于所用培養(yǎng)基的批間質(zhì)控要求繁瑣、敏感性和特異性低以及多次對疑似菌落篩選和鑒定所用自動化生化反應(yīng)試劑材料帶來的昂貴費用，既費工又費時；其次，從不同技術(shù)屬性和分工的實驗室能力要求角度考量，存在對沙門菌(即包括傷寒、副傷寒和非傷寒、副傷寒沙門菌)有著不同側(cè)重、兼而有之的技術(shù)要求和方法的敏感性要求。中國專利申請201010550372. 3公開了 “沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒、制備和應(yīng)用”，具體說是一種對沙門菌和志賀菌同時進行分離、檢測和鑒定的程序，可應(yīng)用于食品和其它糞便類樣品中沙門菌和志賀菌的同步檢測。但是該方法篩選病原菌的檢測流程還存在一定局限性，無法滿足不同類型實驗室的專業(yè)實驗室的特殊的技術(shù)要求；在處理不同類型的標本上沒有使實驗室的材料與方法的績效比達到預(yù)期效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種一次可同步分離傷寒和非傷寒沙門菌的試劑盒、制備和應(yīng)用。主要解決現(xiàn)有沙門菌分離方法存在的漏檢率高、鑒定步驟繁復(fù)且成本較高、篩選結(jié)果不夠直觀的技術(shù)難題。本發(fā)明針對不同性質(zhì)實驗室(臨床實驗室和公共衛(wèi)生實驗室)需求對不同類型標本分別使用I種或2種不同選擇性增菌液及2種可選擇的專一性分離平板配合簡單的糖生化發(fā)酵反應(yīng)模式和細菌特異性酶-底物反應(yīng)特征建立一套行之有效的分離和特異性鑒別試驗，達到對傷寒、副傷寒和(或)非傷寒、副傷寒沙門菌同步篩選分離和簡易鑒定的效果，反之，若單純僅需分離非傷寒、副傷寒沙門菌的實驗室可根據(jù)推薦針的分離程序產(chǎn)生的績效比更好。本發(fā)明的技術(shù)方案為沙門菌分離、鑒定的試劑盒，包括
I、通用型非選擇性增菌液胰酪胨大豆胨肉湯(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3. Og,氯化鈉5. 0g, K2HPO4 2. 5g,葡萄糖2. 5g,蒸懼水1000ml,加熱溶解后矯正pH至7.3±0.2 (按冷卻至25°C后測量值為標準)。經(jīng)15磅壓力15分鐘(121°C )滅菌后分裝225mL/瓶備用。2、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液胰酪胨大豆胨肉湯(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17. Og,植物蛋白胨3. Og,氯化鈉5. 0g, K2HPO4 2. 5g,葡萄糖2. 5g,蒸懼水100ml,加熱溶解后矯正pH至7. 3±0. 2 (按冷卻至25°C后測量值為標準)。經(jīng)15磅壓力15分鐘(121°C)滅菌后分裝IOmL/瓶備用。3、亞硒酸鹽磺綠-磺胺增菌液(SBG):成分酵母浸出物5. 0g，蛋白胨5. 0g, D-甘露醇5. Og,?；撬徕cI. Og,磺胺抑制劑0. 5g，亞硒酸鈉4. 0g, KH2P042. 65g，K2HPO4L 02g,磺綠
5.Omg，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至7. 2±0. 2 (按冷卻至25°C后測量值為標準)。煮沸3次后分裝9mL/無菌試管備用。其外觀為淡綠色透明液體，適用于傷寒、副傷寒和非傷寒、副傷寒沙門菌的增殖培養(yǎng)。4、改良羅伯特增菌液(RVS):成分氯化鎂13. 58g，氯化鈉7. 2g，5. 0g，木瓜酶消化大豆胨4. 5g, KH2PO4L 26g, K2HPO4O. 18g，孔雀綠36mg，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至 5.2±0.2(按冷卻至251后測量值為標準)。煮沸3次后分裝9mL/無菌試管備用。其外觀為藍綠色透明液體，適用于非傷寒、副傷寒沙門菌的復(fù)蘇和增殖培養(yǎng)。5、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板(XLD):成分瓊脂13. 5g，乳糖7. 5g，蔗糖7. 5g,硫代硫酸鈉6. 8g, L-賴氨酸5. Og,氯化鈉5. Og,木糖3. 5g,酵母浸出物3. Og,脫氧膽酸鈉2. 5g，枸櫞酸鐵銨0. 8g，酚紅0. 08g，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至7. 5±0. 2(按冷卻至25°C后測量值為標準)。經(jīng)15磅壓力15分鐘(121°C)滅菌后傾注無菌平皿置冰箱中，備用。6、沙門菌酶顯色瓊脂平板(CAS):成分瓊脂17. 0g，胰化酪蛋白胨10. 0g，蛋白胨10. Og,酵母浸出物3. Og,氯化鈉5. Og, 5-溴-4-氯-3-吲哚-3 -D-吡喃半乳糖苷250mg，辛酸鹽250mg,磺胺抑制劑0. 5g,蒸懼水1000ml。酶顯色瓊脂平板配方的配制取瓊脂粉5g、胰蛋白胨10g、蛋白胨10g、酵母粉3g、氯化鈉5g置990ml蒸餾水中加熱溶解煮沸2次后，稱取5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于5mlTri. HCl (pH8. 0)，稱取辛酸鹽250mg溶解于5ml蒸餾水中，待加熱培養(yǎng)基冷卻至50°C—并加入酶底物溶液后混勻，調(diào)整pH至7.2 (按冷卻至25°C后測量值為標準)。傾注無菌平板置冰箱中，備用。7、沙門菌生化鑒定管配方
第一管成分瓊脂14. Og,牛肉膏2. Og,酵母浸出物2. Og,葡萄糖I. Og,蛋白胨15. Og,甘露醇10. 0g，尿素10. 0g，重量百分濃度為0. 2%的麝香草酚藍溶液10ml，重量百分濃度為0. 2%的溴麝香草酚藍溶液12. 5ml,重量百分濃度為0. 2%的甲酚紅溶液4ml，蒸餾水IOOOrnl ；
第一管配制
I)、取瓊脂14. 0g、牛肉膏2. Og及蒸餾水1000ml，混合后加熱溶解，并用數(shù)層紗布過濾。2)、再取酵母浸出粉2. 0g、葡萄糖I. 0g、蛋白胨15. 0g、甘露醇10. Og及尿素10. 0g，混入已溶解的瓊脂中。充分搖勻，使全部溶解。再加入重量百分濃度為15%的氫氧化鈉約I. 5ml，矯正pH至7. I (按冷卻至25°C后測量值為標準)。3)、然后加入指示劑重量百分濃度為0. 2%的溴麝香草酚藍溶液12. 5ml、重量百分濃度為0. 2%的甲酚紅溶液4ml、重量百分濃度為0. 2%的麝香草酚藍溶液10ml。4)、混合后,充分搖勻。分裝于13X IOOmm的試管內(nèi)，每管約3ml。5)、置高壓滅菌器內(nèi)，經(jīng)10磅壓力10分鐘的滅菌。6)、滅囷后,制成斜面,底部宜厚。待凝固后，直于冰箱中，備用。
表I指示劑所需量及其配制
權(quán)利要求
1.沙門菌分離、鑒定的試劑盒，包括通用型非選擇性增菌液、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液、亞硒酸鹽磺綠-磺胺增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板、沙門菌酶顯色瓊脂平板、沙門菌生化鑒定管、硫化氫濾紙條和吲哚濾紙條，其特征是還包括改良羅伯特增菌液，組成成分氯化鎂13. 58g，氯化鈉7. 2g，5. 0g，木瓜酶消化大豆胨4. 5g，KH2PO4L 26g，K2HPO4O. 18g，孔雀綠 36mg，蒸餾水 1000ml。
2.權(quán)利要求I所述沙門菌分離、鑒定的試劑盒的制備方法，包括通用型非選擇性增菌液、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液、亞硒酸鹽磺綠-磺胺增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板、沙門菌酶顯色瓊脂平板、沙門菌生化鑒定管、硫化氫濾紙條和吲哚濾紙條的制備，其特征是還包括改良羅伯特增菌液制備 改良羅伯特增菌液成分氯化鎂13. 58g，氯化鈉7. 2g，5. 0g，木瓜酶消化大豆胨4. 5g，KH2PO4L 26g, K2HPO4O. 18g，孔雀綠36mg，蒸餾水1000ml，加熱溶解后按冷卻至25°C后測量值為標準，矯正PH至5. 2±0. 2，煮沸3次后分裝9mL/無菌試管備用。
3.權(quán)利要求I所述試劑盒在水中沙門菌分離、鑒定中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述試劑盒在食品中沙門菌分離、鑒定中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及沙門菌分離、鑒定的試劑盒、制備和應(yīng)用，主要解決現(xiàn)有沙門菌分離方法存在的漏檢率高、鑒定步驟繁復(fù)且成本較高、篩選結(jié)果不夠直觀的技術(shù)難題。本發(fā)明試劑盒，包括通用型非選擇性增菌液、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液、亞硒酸鹽磺綠-磺胺增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板、沙門菌酶顯色瓊脂平板、沙門菌生化鑒定管、硫化氫濾紙條和吲哚濾紙條，其特征是還包括改良羅伯特增菌液，組成成分氯化鎂13.58g，氯化鈉7.2g，5.0g，木瓜酶消化大豆胨4.5g，KH2PO41.26g，K2HPO40.18g，孔雀綠36mg，蒸餾水1000ml。本發(fā)明主要針對腸道病原菌中沙門菌屬(包括傷寒、副傷寒和非傷寒、副傷寒沙門菌)的同步分離和鑒定。
文檔編號C12Q1/04GK102796801SQ201210268520
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月1日
發(fā)明者許學(xué)斌, 袁政安, 金匯明 申請人:上海市疾病預(yù)防控制中心