專利名稱：調(diào)節(jié)NF－kB的人遍在蛋白連接酶E3的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明在總體上涉及用于調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)活化的組合物和方法。本發(fā)明具體地涉及調(diào)節(jié)磷酰化IκBα和/或IκBβ的遍在蛋白化的物質(zhì)，以及與NF-κB活化相關(guān)的疾病的治療方法。本發(fā)明所使用的調(diào)節(jié)劑包括E3遍在蛋白連接酶、其部分及其變體。
背景技術(shù)：
NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，它在針對(duì)免疫、炎癥及急性期的應(yīng)答基因(包括白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素8、腫瘤壞死因子和某些細(xì)胞粘附分子)所觀察到的基因表達(dá)的高特異模式中起關(guān)鍵作用。如同轉(zhuǎn)錄激活因子Rel家族的其他成員，NF-κB以非活化形式被隔離在大多數(shù)細(xì)胞類型的胞質(zhì)中。包括促細(xì)胞分裂原、細(xì)胞因子、抗原、應(yīng)激誘發(fā)劑、UV光和病毒蛋白在內(nèi)的多種細(xì)胞外刺激物引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，該途徑最終導(dǎo)致NF-κB的釋放和活化。
重要的NF-κB活化調(diào)節(jié)劑是抑制劑蛋白IκBα和IκBβ(在此稱作IκB)，它們與未受激細(xì)胞的胞質(zhì)中的NF-κB結(jié)合(并因此失活)。在發(fā)生信號(hào)引導(dǎo)的IκB磷?；?，發(fā)生NF-κB的活化和核易位，這導(dǎo)致經(jīng)遍在蛋白途徑發(fā)生蛋白質(zhì)的水解。對(duì)于IκBα，刺激誘發(fā)的在第32和36位絲氨酸上的磷?；顾鲆种苿┏蔀樵诘?1和22位賴氨酸上遍在蛋白化的目標(biāo)靶，而這將導(dǎo)致降解。與之相似，IκBβ在第19和23位絲氨酸上的磷?；顾鲆种苿┏蔀樵诘?位賴氨酸上遍在蛋白化的目標(biāo)靶。然而，還沒(méi)有鑒定出介導(dǎo)IκB識(shí)別的遍在蛋白系統(tǒng)的成分。
蛋白經(jīng)遍在蛋白途徑的降解通過(guò)兩個(gè)非連續(xù)和連續(xù)步驟進(jìn)行(a)多個(gè)遍在蛋白分子共價(jià)附著到蛋白底物上，和(b)通過(guò)26S蛋白體復(fù)合物降解靶蛋白。遍在蛋白途徑包含了多種成分，這些成分以分級(jí)方式共同發(fā)揮作用(綜述參見(jiàn)Ciechanover，Cell 7913，1994；Hochstrasser，Curr.Op.Cell.Biol.7215，1995；Jentsch and Schlenker，Cell 82881，1995；Deshaies，Trends Cell Biol.5428，1995)。單一E1酶是一個(gè)這樣的成分，它進(jìn)行遍在蛋白的激活。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物和酵母中分析表征了一些主要的E2酶。E2酶可能與連接酶E3結(jié)合(Reiss andHersko，J.Biol.Chem.2653685，1990；Dohmen et al.，Proc.Natl，Acad，Sci.USA 887351，1991)，似乎每種E2酶都能與一種或多種E3蛋白作用(Nuber et al.，J.Biol.Chem.2712795，1996；Orian et al.，J.Biol.Chem.27021707，1995；Stancovski et al.，Mol.Cell.Biol.157106，1995；Gonen et al.，J.Biol.Chem.271302，1996)。
已經(jīng)被描述過(guò)的E3酶(遍在蛋白連接酶)很少。哺乳動(dòng)物E3α(酵母中的UBR1)和E3β通過(guò)它們的游離N端氨基酸殘基來(lái)識(shí)別蛋白底物(“N末端規(guī)則”；Varshavsky，Cell 69725，1992；Hershko and Ciechanover，Ann.Rev.Biochem.61761，1992)。Cdc53可能是一種參與靶向磷酰化G1細(xì)胞周期蛋白的E3(Willems et al.，Cell 86453，1996)。E6-AP參與對(duì)p53的識(shí)別(Scheffner et al.，Cell 75495，1993)，已經(jīng)鑒定了一系列獨(dú)特的E6-AP同源蛋白(Huibregtse et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA922563，1995)Nedd4參與上皮Na+通道的降解(Staub et al，Embo J.152371，1996)，RSP5(NIP1)參與通透酶Gap1和Fur1的示蹤(Hein et al.，Mol.Microbiol.1877，1995)，而Pub1靶向Cdc25(Nefsky and Beach，EMBO J.151301，1996)。最近分離的一些其他E3酶似乎參與肌蛋白c-Fos的降解，并參與NF-κB前體p105的加工(Orian et al.，J.Biol.Chem.27021707，1995；Stancovski et al.，Mol.Cell.Biol.157106，1995；Gonenet al.，J.Biol.Chem.271302，1996)。因此看來(lái)，所述連接酶是個(gè)大的且其中大部分未闡明的酶家族，并且，除了“N末端規(guī)則”連接酶(E3α和E3β)的識(shí)別方式之外，尚沒(méi)有鑒定出遍在蛋白系統(tǒng)的所有其他已知底物的識(shí)別基元。
因此，本領(lǐng)域需要提高對(duì)IκB經(jīng)遍在蛋白途徑降解的理解，并需要鑒定出此降解過(guò)程的調(diào)節(jié)劑，以將其用于治療與NF-κB活化相關(guān)的疾病。本發(fā)明滿足了這些需要并進(jìn)一步提供其他有關(guān)優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明概述簡(jiǎn)要地說(shuō)，本發(fā)明提供通過(guò)調(diào)節(jié)磷?；疘κBα和/或IκBβ的遍在蛋白化而調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)活化的組合物和方法。一方面，本發(fā)明提供了分離的人E3遍在蛋白連接酶多肽。這些多肽可包括SEQ IDNO16所示的人E3遍在蛋白連接酶序列、其部分或者其變體，所述變體的區(qū)別在于一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、插入、缺失和/或添加，以致多肽(a)增強(qiáng)了磷?；疘κB的遍在蛋白化作用或者(b)與磷?；疘κB結(jié)合并抑制磷?；疘κB的遍在蛋白化作用。在某些實(shí)施方案中，這樣的一個(gè)多肽可具有SEQ ID NO16或所示的序列其變體，該變體的區(qū)別在于在不超過(guò)20％的SEQ ID NO16氨基酸殘基上發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或替換，以致多肽增強(qiáng)了磷酰化IκB的遍在蛋白化作用。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，這樣的一個(gè)多肽可包括人E3遍在蛋白連接酶的一部分或這一部分的變體，其中所述部分與磷酰化IκB結(jié)合并抑制磷?；疘κB的遍在蛋白化作用。
另一方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供分離的編碼上述多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，這樣的多核苷酸可編碼上述人E3遍在蛋白連接酶的一部分或這一部分的變體。也提供了包含與所述多核苷酸互補(bǔ)的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的反義多核苷酸。進(jìn)一步提供了包含所述多核苷酸的表達(dá)載體以及用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供包含與生理上可接受的載體相結(jié)合的上述多肽或多核苷酸的藥物組合物。
此外，本發(fā)明提供分離的抗體及其抗原結(jié)合片段，它們和具有SEQID NO16所示序列的人E3遍在蛋白連接酶相結(jié)合。這樣的抗體可以是單克隆抗體。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供包含與生理上可接受的載體相結(jié)合的上述抗體或片段的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供調(diào)節(jié)患者NF-κB活性的方法，包括給患者施用上述藥物組合物。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供治療患有與NF-κB活化相關(guān)的病癥的患者的方法，包括給患者施用治療有效量的上述藥物組合物，由此治療與NF-κB活化相關(guān)的病癥。所述病癥包括炎癥、自身免疫性疾病、癌癥和病毒感染。
本發(fā)明進(jìn)一步提供調(diào)節(jié)NF-κB活性的物質(zhì)的篩選方法，包括以下步驟(a)使候選物質(zhì)與人E3遍在蛋白連接酶多肽接觸，其中多肽包含SEQ ID NO16所示序列或者其部分或變體，所述變體的區(qū)別在于一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、插入、缺失和/或添加，以致多肽增強(qiáng)了磷?；疘κB的遍在蛋白化作用，該接觸條件和時(shí)間足以使多肽和候選物質(zhì)相互作用；和(b)隨后評(píng)價(jià)相對(duì)于預(yù)先確定的在不存在候選物質(zhì)時(shí)多肽增強(qiáng)磷?；疘κB的遍在蛋白化作用的能力，多肽增強(qiáng)磷?；疘κB的遍在蛋白化作用的能力；由此識(shí)別出調(diào)節(jié)NF-κB活性的物質(zhì)。用于此篩選的候選物質(zhì)包括但不僅限于組合文庫(kù)中的小分子。
參照以下具體說(shuō)明和附圖，本發(fā)明的上述方面及其他方面將變得很明顯。如同每篇文獻(xiàn)分別引入一樣，所有在此公開(kāi)的文獻(xiàn)以全文引入作為參考。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1D是放射自顯影圖，其描繪了在各種IκB E3識(shí)別基元存在或不存在的條件下進(jìn)行的遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)的SDS-PAGE分析結(jié)果。除非另外指明，底物是35S-標(biāo)記的、以HA示蹤的IκB多肽，該多肽是經(jīng)磷酰化的并與NF-κB復(fù)合物結(jié)合。
在圖1A中，泳道1顯示在32和36位置上含有丙氨酸殘基的IκBα多肽(S32/36A；SEQ ID NO13)的遍在蛋白化作用，泳道2顯示未磷?；囊吧虸κBα多肽(SEQ ID NO12)的遍在蛋白化作用。在泳道3-14中，遍在蛋白化底物是野生型IκBα多肽(SEQ ID NO12)。在泳道3中，在ATP不存在的條件下進(jìn)行遍在蛋白化；在泳道4-14中，在ATPγS存在的條件下使用(泳道5-14)或不使用(泳道4)IκB E3識(shí)別基元或其他肽進(jìn)行反應(yīng)。所示肽為400μM c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道5)；400μM第32、36位絲氨酸被替換為丙氨酸的IκBα肽(pp21S/A(SEQ ID NO11)，泳道6)；40μM二磷?；腎κBα肽(pp21(SEQ ID NO9)，泳道7)；400μM未磷酰化的IκBα肽(p21(SEQ ID NO9)，泳道8)；100μM單磷?；腎κBα肽(ppS32(SEQ ID NO9)，泳道9；ppS36(SEQID NO9)，泳道10)；和40μM較短的、二磷?；腎κBα肽(pp19(SEQID NO8)，泳道11)；pp15(SEQ ID NO7)，泳道12；pp11(SEQ ID NO6)，泳道13；pp7(SEQ ID NO5)，泳道14)。
在圖1B中，遍在蛋白化底物是游離的野生型IκBα(SEQ IDNO12，泳道1-3)或游離的S32/36A替換的IκBα(SEQ ID NO13，泳道4-6)。在ATPγS不存在(泳道1和4)或存在(泳道2、3、5和6)的條件下進(jìn)行反應(yīng)。將40μM二磷?；腎κBα肽(pp21(SEQ ID NO9)加入泳道3和6所示樣品的偶聯(lián)反應(yīng)混合物中。
在圖1C中，顯示在HeLa提取物中大量細(xì)胞蛋白的遍在蛋白化。泳道1顯示在ATP不存在的條件下的遍在蛋白化，泳道5顯示在ATP存在的條件下的遍在蛋白化。在泳道3-5中，加入了IκB E3識(shí)別基元或其他肽40μM二磷?；腎κBα肽(pp21(SEQ ID NO9)，泳道2)；400μMc-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道3)；和400μM未磷酰化的IκBα肽(p21(SEQ ID NO9)，泳道4)。
在圖1D中，遍在蛋白化底物是磷酰化(泳道2-7)或未磷?；?泳道1)的野生型IκBβ(SEQ ID NO14)。在ATPγS不存在(泳道2)或存在(泳道1，3-7)的條件下使用(泳道4-7)或不使用(泳道1-3)IκB E3識(shí)別基元或其他肽來(lái)進(jìn)行反應(yīng)。所示肽為40μM二磷?；腎κBα肽(pp21(SEQID NO9)，泳道4)；400μM c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道5)；40μM二磷酰化的IκBα肽(pp19(SEQ ID NO8)，泳道6)；和400μM未磷?；腎κBα肽(p21(SEQ ID NO9)，泳道7)。
圖2是放射自顯影圖，其描繪了使用受激HeLa細(xì)胞提取物進(jìn)行的體外遍在蛋白依賴型降解實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在SDS-PAGE的每個(gè)泳道中，顯示的是在降解實(shí)驗(yàn)后磷?；?上帶)和未磷?；?下帶)的以HA示蹤的IκBα多肽(SEQ ID NO12)的水平。泳道1顯示這些多肽在不使用ATP進(jìn)行的降解實(shí)驗(yàn)后的水平。在泳道2-6中，在反應(yīng)混合物中包括了ATP。將40μM候選調(diào)節(jié)劑加入泳道3-6所示的反應(yīng)二磷?；腎κBα肽(pp21(SEQ ID NO9)，泳道3)；二磷?；腎κBα肽(pp19(SEQ IDNO8)，泳道4)；c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道5)；和未磷酰化的IκBα肽(p21(SEQ ID NO9)，泳道6)。
圖3A是放射自顯影圖，其描繪了使用HeLa細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的分級(jí)流通級(jí)分進(jìn)行的遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)的SDS-PAGE分析結(jié)果，所述HeLa細(xì)胞溶胞產(chǎn)物經(jīng)調(diào)節(jié)劑柱進(jìn)行分級(jí)分離。在所有情況下，底物是35S-標(biāo)記的、以HA示蹤的IκBα多肽(SEQ ID NO12)，該多肽是經(jīng)磷?；牟⑴cNF-κB復(fù)合物結(jié)合。泳道1顯示使用未分離提取物的遍在蛋白化水平。在泳道2-9中，提取物經(jīng)肽-瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行分級(jí)分離。使用的肽為c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道2)；第32、36位絲氨酸被替換為丙氨酸的IκBα肽(pp21S/A(SEQ ID NO11)，泳道3)；二磷?；腎κBα肽(pp21(SEQ ID NO9)，泳道4-6)；二磷?；腎κBα肽(pp19(SEQ ID NO8)，泳道7-9)。另外，將網(wǎng)狀細(xì)胞的級(jí)分II(160μg)加入泳道5和8所示的遍在蛋白化反應(yīng)中，將級(jí)分I(160μg)加入泳道6和9中的反應(yīng)。
圖3B是放射自顯影圖，其顯示了在HeLa細(xì)胞中大量細(xì)胞蛋白的遍在蛋白化作用。泳道1顯示在ATP不存在的條件下的遍在蛋白化，泳道2顯示在ATP存在但無(wú)候選調(diào)節(jié)劑的條件下的遍在蛋白化。在泳道3-6中，加入了候選調(diào)節(jié)劑40μM二磷?；腎κBα肽(pp19(SEQ IDNO8)，泳道3)；400μM c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO10)，泳道4)；400μM第32、36位絲氨酸被替換為丙氨酸的IκBα肽(pp21S/A(SEQ IDNO11)，泳道5)；40μM二磷?；腎κBα肽(pp21(SEQ ID NO9，泳道6)。
圖4A-4F是顯微照片，其顯示了候選調(diào)節(jié)劑對(duì)的核NF-κB易位的影響。在圖4A-C中，pp21(圖4A和4B)或ppFos(圖4C)被顯微注射入HeLa細(xì)胞的胞質(zhì)中。接著立即用TNFα激活細(xì)胞并用抗p65的抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。在圖4D-F中，pp21(圖4D)或ppFos(圖4F)被注射入人血管上皮細(xì)胞(HUVEC)的胞質(zhì)中。接著立即用TNFα活化細(xì)胞并用抗E-選擇蛋白的抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。圖4E是圖4D的相差顯微照片。在每個(gè)顯微照片中，注射的細(xì)胞用大箭頭標(biāo)出。在圖4D和4E中，未注射的E-選擇蛋白陰性細(xì)胞用小箭頭標(biāo)出。
圖4G和4H呈現(xiàn)圖4A-4F所示顯微注射實(shí)驗(yàn)的概略。在圖4G中顯示了表現(xiàn)出核p65染色的HeLa細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。使用pp21和ppFos分別顯微注射90和42個(gè)細(xì)胞。圖4H顯示了表現(xiàn)出E-選擇蛋白染色的HUVEC的百分?jǐn)?shù)。使用pp21和ppFos分別顯微注射160和36個(gè)細(xì)胞。對(duì)于每一張圖，柱1顯示在IκBE3識(shí)別基元或其他肽以及TNFα活化不存在時(shí)的水平。柱2-4顯示了在肽不存在(柱2)或者pp21存在下(柱3)或ppFos存在下(柱4)在TNFα激活后的水平。
圖5是放射自顯影圖，其描繪了Western印跡分析結(jié)果，該Western印跡分析顯示來(lái)自TNFα活化細(xì)胞的pIκBα相關(guān)性遍在蛋白-連接酶活性的免疫沉淀。將pIκBα/NF-κB復(fù)合物從蛋白體受抑制的、受TNFα刺激的或未受激的HeLa細(xì)胞中免疫沉淀出來(lái)，并通過(guò)遍在蛋白、ATP-γS和以下成分的加入進(jìn)行體外的遍在蛋白化，所述成分為泳道1，UBC5C；泳道2，UBC5C和E1；泳道3，無(wú)；泳道4-6，UBC5C和所標(biāo)示的E1；泳道7，UBC5C、E1和pIκBα-肽；泳道8，UBC5C、E1和絲氨酸被替換的IκBα肽；泳道9，受TNFα刺激的HeLa溶胞產(chǎn)物樣品。細(xì)胞刺激示于TNFα行。在圖的左邊、底部和頂部標(biāo)出了單體及與遍在蛋白偶聯(lián)的IκBα。
圖6是放射自顯影圖，其說(shuō)明當(dāng)IκBα在DSGLDS(SEQ ID NO8和19)位點(diǎn)發(fā)生IKK磷酰化后，遍在蛋白-連接酶和IκBα/NF-κB復(fù)合物的相關(guān)性。從未活化的細(xì)胞中免疫純化出35S標(biāo)記的IκBα/NF-κB復(fù)合物。該復(fù)合物用IKK-2EE磷?；?在上方用+標(biāo)出)，作為E3源與未活化的HeLa溶胞產(chǎn)物一起溫育，洗滌，并在ATPγS、遍在蛋白、E1、UBC5C(除非被排除的成分由Abst Ub-Enz指明)的存在下在體外進(jìn)行遍在蛋白化。泳道2-7顯示由IKK產(chǎn)生的磷酰化；泳道1和3-7顯示與HeLa溶胞產(chǎn)物一起溫育的影響；在泳道4中，在與HeLa溶胞產(chǎn)物一起溫育的過(guò)程中加入了pIκBα肽；在泳道5中，在HeLa溫育的過(guò)程中加入了絲氨酸被替換的IκBα肽；在泳道6中，將E1從遍在蛋白化階段中省去；在泳道7中，在遍在蛋白化過(guò)程中將UBC5C省去。
圖7A和7B說(shuō)明與遍在蛋白-連接酶活性相關(guān)的IκBα結(jié)合蛋白的識(shí)別。圖7A顯示SDS-聚丙烯酰胺凝膠樣品的膠體藍(lán)染色，所述樣品為含有IκBα/NF-κB和相關(guān)蛋白的經(jīng)免疫純化的級(jí)分。IκBα/NF-κB復(fù)合物用IKK-2EE磷?；?泳道2、3)或模擬磷?；⒂糜谖絹?lái)自HeLa溶胞產(chǎn)物的遍在蛋白-連接酶(泳道1、2)。在右邊指出了分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物(kD)。在左邊指出了通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定的蛋白。在左側(cè)用括號(hào)標(biāo)出對(duì)應(yīng)于與遍在蛋白-連接酶活性相關(guān)的帶(p54和p58)的凝膠位置。圖7B足吸附到pIκBα/NF-κB上的蛋白的放射自顯影圖，其中所述pIκBα/NF-κB來(lái)自35S標(biāo)記的HeLa細(xì)胞。放射性標(biāo)記的HeLa溶胞產(chǎn)物與IKK磷酰化的、抗體固定化的IκBα/NF-κB復(fù)合物一起溫育。然后，洗滌免疫復(fù)合物，進(jìn)行洗脫，用SDS-PAGE和放射自顯影方法對(duì)其進(jìn)行并分析。泳道1顯示與HeLa溶胞產(chǎn)物一起溫育的未磷酰化的IκBα/NF-κB復(fù)合物；泳道2-4顯示在不存在(泳道2)或存在pIκBα肽(泳道3)或絲氨酸被替換的IκBα肽(泳道4)的條件下與HeLa溶胞產(chǎn)物一起溫育的磷?；疘κBα/NF-κB復(fù)合物。在左邊指出的是分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物(kD)、RelA和IκBα帶；在右邊指出的是四個(gè)與pIκBα相關(guān)的帶，其中三個(gè)用pIκBα肽展示(箭頭)。
圖8A-8D顯示與遍在蛋白-連接酶相關(guān)的p54的質(zhì)譜分析結(jié)果。圖8A顯示未分離的胰蛋白酶肽混合物的納電子噴射質(zhì)譜(nanoelectrospray mass spectrum)，其中所述混合物來(lái)自從連接酶陽(yáng)性泳道(等價(jià)于圖7B中的泳道2)切下的54kD凝膠帶。將箭頭所標(biāo)的峰打碎并將其鑒定為由β-TrDP衍生的肽。橫條指示在C中放大的區(qū)域。圖8B和8C顯示與遍在蛋白-連接酶活性相關(guān)(C)或不相關(guān)(B)的54 kD帶的納電子噴射譜的比較。選擇m/z為714.38的肽測(cè)序。圖8D為在圖8C中鑒定的肽的碎片譜。從一系列二價(jià)碎片離子中裝配出序列標(biāo)志，在nrdb數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相符的模式。將針對(duì)檢索到的β-TrCP序列AAVNVVDFDDKYIVSASGDR(SEQ ID NO20)而計(jì)算出的碎片質(zhì)量與全部碎片譜比較，以證實(shí)二者相符。用圓圈標(biāo)出與預(yù)期碎片離子相符的峰。
圖9A和9B表示編碼人E3遍在蛋白連接酶的多核苷酸序列(SEQID NO15)。
圖10表示人E3遍在蛋白連接酶蛋白序列(SEQ ID NO16)。
圖11A-11C是Western印跡，其說(shuō)明E3遍在蛋白連接酶家族成員的結(jié)合特異性和遍在蛋白化特異性。在這些圖中，mβ-TrCP指小鼠β-TrCP，hβ-TrCP指人β-TrCP，Δβ-TrCP指缺失了F盒區(qū)域的人β-TrCP，Slimb指果蠅Slimb蛋白。圖11A說(shuō)明與pIκBα的選擇性結(jié)合。利用FLAG抗原決定簇將蛋白從被轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中免疫沉淀出來(lái)，將該蛋白與經(jīng)免疫純化的IκBα/NF-κB復(fù)合物一起溫育，所述復(fù)合物已進(jìn)行過(guò)指定處理(-/+IKK)，并利用所指明的抗體通過(guò)Western印跡來(lái)分析已結(jié)合的物質(zhì)。該圖的上部顯示特異性pIκBα結(jié)合；中部顯示10％底物流通；下部為經(jīng)免疫沉淀的蛋白的印跡；在左邊指出了分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物(kD)。圖11B顯示，β-TrCP-pIκBα的結(jié)合被磷酸肽廢除，所述磷酸肽為pIκBα降解基元1(pp10)，而不被有關(guān)的未磷酰化肽(pS/A)廢除。圖11C說(shuō)明由E3家族成員蛋白產(chǎn)生的pIκBα體外遍在蛋白化。將經(jīng)免疫純化的以FLAG示蹤的蛋白與35S標(biāo)記的IκBα/NF-κB復(fù)合物一起溫育，進(jìn)行指定處理(-/+IKK)并在ATPγS、遍在蛋白、E1、UBC5C的存在下進(jìn)行遍在蛋白化。在左邊指出了IκBα底物(由全長(zhǎng)的兩個(gè)降解產(chǎn)物組成)、pIκBα-多遍在蛋白偶聯(lián)物和分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物。
圖12A和12B說(shuō)明Δβ-TrCP的過(guò)度表達(dá)對(duì)IκBα降解和NF-κB活化的抑制，Δβ-TrCP是一種顯性陰性分子。圖12A顯示在受P/I刺激的Jurkat細(xì)胞中的κB依賴型熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中所述Jurkat細(xì)胞是用κB-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒和指明的表達(dá)載體(即，從左至右分別是僅載體、編碼人β-TrCP的載體、缺失了F盒區(qū)域的編碼人β-TrCP的載體以及編碼果蠅Slimb蛋白的載體)轉(zhuǎn)染的。NF-κB活性顯示為相對(duì)(倍數(shù))的熒光素酶活性，并以未受激的空FLAG載體作為參照(單倍)。圖12B顯示IκBα的Western印跡分析結(jié)果，其中IκBα為佛波酯和受Ca+[P/I]刺激和未受激Jurkat細(xì)胞的IκBα，且所述Jurkat細(xì)胞是用空FLAG載體或Δβ-TrCP轉(zhuǎn)染的。圖中指出了刺激后的間隔(分鐘)。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明總體上涉及有效用于調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)活化和治療與NF-κB活化相關(guān)的疾病的組合物和方法。本發(fā)明具體地涉及調(diào)節(jié)磷?；疘κB(即，IκBα和/或IκBβ)遍在蛋白化的物質(zhì)。該遍在蛋白化導(dǎo)致NF-κB的釋放和活化。
本發(fā)明部分基于對(duì)一種人E3遍在蛋白連接酶的鑒定和表征，該人E3遍在蛋白連接酶識(shí)別磷?；暮团cNF-κB相關(guān)的IκB。多肽(包括人E3遍在蛋白連接酶以及其一部分或其他變體)可用于調(diào)節(jié)NF-κB在體外和在患者中的活性。這樣的多肽可用于例如對(duì)可用于調(diào)節(jié)NF-κB活性的物質(zhì)(如小分子)進(jìn)行識(shí)別，以及用于治療與異常的NF-κB活化相關(guān)的疾病。人E3遍在蛋白連接酶多肽和多核苷酸在本發(fā)明中，已發(fā)現(xiàn)作為54kD蛋白遷移的人E3遍在蛋白連接酶與磷酰化IκBα(磷?；疘κBα在此也叫做pIκBα)結(jié)合，并增強(qiáng)其遍在蛋白化。在圖9和SEQ ID NO15中提供了編碼人E3遍在蛋白連接酶的多核苷酸的序列；在圖10和SEQ ID NO16中提供了全長(zhǎng)人E3遍在蛋白連接酶的蛋白序列。在本發(fā)明中還發(fā)現(xiàn)，人E3遍在蛋白連接酶是F盒/WD蛋白家族的成員，該家族包括β-TrCP(Margottin et al.，Mol.Cell 1565-574，1998)和果蠅Slimb蛋白(參見(jiàn)Jiang and Struhl，Nature 391493-496，1998)。如下所具體描述，此家族的其他成員共同具有E3的某些特性，并可在使用E3的本發(fā)明方法中使用這樣的蛋白及其變體。
本發(fā)明所述人E3遍在蛋白連接酶包括天然的人E3遍在蛋白連接酶(在本文中也稱作“E3”)以及其一部分或其他變體。E3變體與天然E3可在序列上存在差別，該差別可以源自一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、缺失、添加和/或插入，如本發(fā)明所述，只要所述變體能與本發(fā)明所述IκB多肽結(jié)合并增強(qiáng)其遍在蛋白化。優(yōu)選E3變體包含在不超過(guò)20％、優(yōu)選不超過(guò)15％、更優(yōu)選不超過(guò)10％的SEQ ID NO16所示殘基上發(fā)生的氨基酸替換。變體進(jìn)一步包括截短的多肽和含有附加氨基酸序列的多肽，這些附加氨基酸序列對(duì)所述多肽活性的影響極小。人E3遍在蛋白連接酶多肽可以具有任何長(zhǎng)度，其條件是它保留所述特性。換言之，這樣的多肽可以是寡肽(即由相對(duì)較少的通過(guò)肽鍵連接的氨基酸殘基構(gòu)成，例如具有8-10個(gè)殘基)、全長(zhǎng)蛋白(或其變體)或具有中等大小的多肽(例如20、50、200或400個(gè)氨基酸殘基)。
某些變體包含保守替換。在“保守替換”中，是用一個(gè)氨基酸替換另一個(gè)具有相似性質(zhì)的氨基酸，從而肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)測(cè)出多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性實(shí)質(zhì)上未改變。通?？苫跉埢跇O性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性上的相似來(lái)進(jìn)行氨基酸的替換。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有不帶電荷的極性頭部基團(tuán)(具有相似親水性值)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？纱肀Ｊ匦愿淖兊钠渌被峤M包括(1)丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸；(2)半胱氨酸、絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸；(3)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；(4)賴氨酸、精氨酸、組氨酸；和(5)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸。變體也可(或作為一種選擇)包含非保守變化。也可(或作為一種選擇)通過(guò)例如對(duì)多肽的免疫原性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性影響極小的氨基酸的刪除或添加來(lái)對(duì)變體進(jìn)行修飾。
如上所述，某些E3多肽可在氨基和/或羧基末段含有附加的氨基酸序列。例如，可將E3序列偶聯(lián)到位于蛋白N末端的信號(hào)(或前導(dǎo))序列上，該信號(hào)(或前導(dǎo))序列以共翻譯方式或以翻譯后方式指導(dǎo)所述蛋白的轉(zhuǎn)移。也可(或作為一種選擇)將多肽偶聯(lián)到接頭或其他序列上，以易于進(jìn)行多肽(如多組氨酸)的合成、純化和鑒定，或者用于增強(qiáng)多肽和固相載體的結(jié)合。例如，可將多肽連接到免疫球蛋白的Fc區(qū)。
使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的任何結(jié)合實(shí)驗(yàn)，可容易地確定E3多肽與磷?；疘κB結(jié)合的能力。例如，可將IκBα/NF-κB復(fù)合物與固定的E3多肽一起溫育，并(例如在Western印跡中)使用抗IκBα的抗體評(píng)價(jià)IκBα的結(jié)合水平。在這樣的實(shí)驗(yàn)中，E3多肽應(yīng)可測(cè)地結(jié)合IκBα；優(yōu)選相對(duì)于天然人E3，所述E3多肽的結(jié)合水平基本上沒(méi)有減少。換言之，相對(duì)于天然多肽，變體可測(cè)地結(jié)合磷酰化、復(fù)合化的IκBα的能力可以增強(qiáng)或不變，或者，相對(duì)于天然多肽，發(fā)生少于50％、優(yōu)選少于20％的降低。很明顯，可在這些實(shí)驗(yàn)中用其他合適的底物替換pIκBα/NF-κB復(fù)合物。
正如本發(fā)明所述，E3多肽增強(qiáng)磷?；疘κB遍在蛋白化的能力可通過(guò)以下步驟進(jìn)行評(píng)估使多肽與IκBα/NF-κB復(fù)合物、ATPγS、遍在蛋白E1、遍在蛋白E2一起溫育，利用IκBα的特異性抗體通過(guò)Western印跡測(cè)定緩慢移動(dòng)的IκBα-遍在蛋白偶聯(lián)物。通常，在這一實(shí)驗(yàn)中，E3多肽應(yīng)產(chǎn)生可測(cè)水平的遍在蛋白化；優(yōu)選相對(duì)于由近似量的天然人E3產(chǎn)生的遍在蛋白化水平，上述遍在蛋白化的水平基本上沒(méi)有減少。
本發(fā)明還涉及包含了E3的一部分或其他變體的多肽，所述E3的一部分或其他變體保留了與磷?；疘κB結(jié)合的能力，但未保留增強(qiáng)IκB遍在蛋白化的能力。使用本發(fā)明提供的結(jié)合實(shí)驗(yàn)和遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)可容易地識(shí)別該多肽，且通?？蓪⑵溆糜谝种艻κB的遍在蛋白化。這樣的多肽包括缺失了F盒區(qū)域(即與遍在蛋白級(jí)聯(lián)物的一種或多種成分相互作用的蛋白區(qū)域)的多肽。通常可功能性地識(shí)別F盒區(qū)域(即，由F盒區(qū)域缺失所形成的蛋白導(dǎo)致在遍在蛋白機(jī)制中補(bǔ)充了合適的成分)，它通常是建立在F盒區(qū)域共有序列的基礎(chǔ)上(參見(jiàn)Patton et al.，Trends inGenet.14236-243，1998)。某些所述的多肽包含了SEQ ID NO16的氨基酸122-168的缺失。在某些實(shí)施方案中，E3的一部分可包含SEQ IDNO16所示序列的10-374個(gè)，優(yōu)選50-250個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼所述E3多肽的多核苷酸。本發(fā)明包括任何編碼本發(fā)明所述多肽、其一部分或變體的多核苷酸。這些多核苷酸可以是單鏈的(編碼或反義多核苷酸)或雙鏈的，可以是DNA分子(基因組DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。在本發(fā)明的多核苷酸中可以但不必須存在有附加的編碼或非編碼序列，可以但不必須將多核苷酸連接到其他分子和/或載體上。
可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的各種雜交或擴(kuò)增技術(shù)中的任一技術(shù)來(lái)分離編碼人E3或其一部分的天然DNA序列。在這些技術(shù)中，可基于本發(fā)明提供的E3序列來(lái)設(shè)計(jì)探針或引物，并可購(gòu)買或合成這些探針或引物?？珊Y選來(lái)自任何合適組織的文庫(kù)。接著可利用熟知的技術(shù)使用已擴(kuò)增的一部分或部分的cDNA分子從基因組DNA文庫(kù)或從cDNA文庫(kù)中分離全長(zhǎng)基因。另外，可由多個(gè)PCR片段構(gòu)建全長(zhǎng)基因。本發(fā)明具體包括包含這些序列的一部分或全長(zhǎng)多核苷酸、全長(zhǎng)多核苷酸的其他部分以及與這些全長(zhǎng)分子的全部或一部分互補(bǔ)的序列。此外，本發(fā)明具體涉及了來(lái)自其他物種的同源體，并通常如本發(fā)明所述制備這些同源體。
具有所述序列的多核苷酸變體與天然E3多核苷酸的區(qū)別在于一個(gè)或多個(gè)替換、缺失、插入和/或添加。優(yōu)選的變體包含在不超過(guò)20％、優(yōu)選在不超過(guò)10％的核苷酸位置上的核苷酸替換、缺失、插入和/或添加。某些變體基本上與天然基因或其部分同源或互補(bǔ)。這樣的多核苷酸變體能夠在中等嚴(yán)格的條件下雜交到天然存在的編碼E3蛋白的DNA序列(或互補(bǔ)序列)上。合適的中等嚴(yán)格的條件包括在由5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA組成的溶液(pH8.0)中預(yù)洗滌；在50-65℃下在5X SSC中雜交過(guò)夜；接著在65℃用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC中各洗滌兩次，每次20分鐘。這樣的雜交DNA序列也屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的普通技術(shù)人員將意識(shí)到，作為遺傳密碼簡(jiǎn)并的結(jié)果，編碼本發(fā)明所述多肽的核苷酸序列是許多的。這些多核苷酸中的一些與由任何天然基因構(gòu)成的核苷酸的同源性極小。雖然如此，本發(fā)明仍具體包括由于密碼子使用的不同而變化的多核苷酸。
如上所述，本發(fā)明進(jìn)一步提供反義多核苷酸和具有任何上述序列的部分。通?？衫萌魏伪绢I(lǐng)域公知的方法制備這些多核苷酸，包括例如固相的氨基磷酸酯化學(xué)合成法。另外，也可通過(guò)DNA序列在體外或體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄來(lái)產(chǎn)生RNA分子，所述DNA序列被引入載體，使之位于合適的RNA聚合酶啟動(dòng)子(例如T3、T7或SP6)的下游。如本文所述，也可將多核苷酸的某些部分用于制備被編碼的多肽。另外，多核苷酸的一部分也可作為探針(例如用于測(cè)定E3在樣品中的表達(dá))，并可利用各種報(bào)告基團(tuán)如放射性核素、熒光染料和酶標(biāo)記此部分。這些部分的優(yōu)選長(zhǎng)度為至少10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，作為探針使用的部分包含E3基因特有的序列。也可將與編碼序列互補(bǔ)的序列(即反義多核苷酸)的一部分用作探針或用于調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。也可將可被轉(zhuǎn)錄成反義RNA的DNA構(gòu)建體引入細(xì)胞或組織中，以便產(chǎn)生反義RNA。
可以進(jìn)一步修飾任何多核苷酸以增加體內(nèi)穩(wěn)定性?？赡艿男揎棸ǖ幌抻?，在5’和/或3’末端添加側(cè)翼序列；在骨架中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶連接；和/或包括非傳統(tǒng)堿(如肌苷、queosine和wybutosine)以及乙?；⒓谆?、硫代和其他修飾形式的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
可使用已知的重組DNA技術(shù)將本文所述的多核苷酸連接到各種其他核苷酸序列上。例如，可將多核苷酸克隆進(jìn)多種克隆用載體中的任一種中，所述克隆用載體包括質(zhì)粒、噬菌粒、λ噬菌體衍生物和裝配型質(zhì)粒。特殊目的載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針生成載體和測(cè)序載體。通常，載體將含有在至少一種生物體中起作用的DNA復(fù)制起始點(diǎn)、便利的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和一種或多種可選標(biāo)志。也可存在附加的起始、終上和/或間插DNA序列，其例如方便易于表達(dá)的載體的構(gòu)建?？少?gòu)得或利用本領(lǐng)域熟知的方法從所述序列組裝得到合適的載體。在載體中可能存在的其它元件取決于所需用途，這些元件對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
通?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的方法將此處所述的載體轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。這些方法包括磷酸鈣沉淀、電穿孔和顯微注射。
通常，可使用標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化合成技術(shù)來(lái)制備E3多肽，或者利用編碼目的多肽的重組DNA的表達(dá)來(lái)制備這些多肽?？墒褂靡氚被岷?或氨基酸類似物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)合成肽。在合成過(guò)程中，可以根據(jù)需要，使用例如叔丁基二碳酸酯(t-butyldicarbonate，t-BOC)基團(tuán)或芴基甲氧羰基(FMOC)來(lái)保護(hù)氨基酸和/或氨基酸類似物的活性基團(tuán)。氨基酸和/或氨基酸類似物可以商業(yè)購(gòu)得(例如，Sigma Chemical Co.；AdvancedChemtec)或通過(guò)本領(lǐng)域公知方法合成。肽可以使用固相方法來(lái)合成，其中肽被附著到樹(shù)脂上，例如4-methylbenzhydrylamine(MBHA)、4-(羥甲基)-苯乙酰氨基甲基-和4-(羥甲基)-苯氧甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)(Wang樹(shù)脂)等樹(shù)脂上(所有這些均可商業(yè)購(gòu)得)；或附著到對(duì)硝基苯基苯甲酮肟聚合物上(肟樹(shù)脂)，其可如De Grado和Kaiser所述(J.Org.Chem.473258，1982)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到氨基酸和/或氨基酸類似物的選擇將部分取決于所需的特定物理、化學(xué)或生物學(xué)特性?？赏ㄟ^(guò)給藥方法和患者體內(nèi)的靶位點(diǎn)來(lái)部分地確定這些特性。
肽反應(yīng)基團(tuán)的選擇性修飾還可以產(chǎn)生有利的特性?？梢栽陔娜愿街跇?shù)脂上的同時(shí)對(duì)它進(jìn)行處理，以獲得N端修飾的化合物如乙?；碾?，或使用氟化氫或等價(jià)的切割劑將肽從樹(shù)脂上切下，然后對(duì)其修飾?？稍趶臉?shù)脂上切下之后或有時(shí)在溶液相合成之前，對(duì)合成的含有C端羧基的化合物(Wang樹(shù)脂)進(jìn)行修飾。肽的N端或C端修飾方法是本領(lǐng)域所熟知的，包括例如N端的乙?；駽端的酰胺化。類似地，氨基酸或氨基酸類似物側(cè)鏈的修飾方法是肽合成領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。對(duì)肽反應(yīng)基團(tuán)的修飾的選擇取決于所需特性。
E3多肽也可以是環(huán)肽?？梢酝ㄟ^(guò)在例如肽的N端的氨基基團(tuán)與C端的羧基基團(tuán)之間誘導(dǎo)共價(jià)鍵的形成來(lái)獲得環(huán)肽。也可以通過(guò)在末端反應(yīng)基團(tuán)與反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈之間或在兩個(gè)反應(yīng)側(cè)鏈之間形成共價(jià)鍵來(lái)獲得環(huán)肽。根據(jù)所需特性選擇環(huán)肽對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。例如，環(huán)肽可以在體內(nèi)使穩(wěn)定性增加、溶解性增加、免疫原性降低或者清除率降低。
可使用例如反相高效液相色譜(RP-HPLC)的方法或其他基于大小或電荷的分離方法來(lái)純化新合成的肽。而且，可使用這些方法或其他已知方法來(lái)表征經(jīng)純化的肽，其他已知方法例如有氨基酸分析和質(zhì)譜分析法。
另外，也可使用熟知的技術(shù)由目標(biāo)多肽的編碼核酸來(lái)制備多肽。可使用分離的cDNA來(lái)制備內(nèi)源性蛋白。為制備變體多肽，可使用標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)，例如寡核苷酸定向的位點(diǎn)特異性誘變，并可除去DNA序列的片段以制備截短的多肽。
通常，可將任一種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的表達(dá)載體用于表達(dá)本發(fā)明的重組多肽。表達(dá)可在任何適宜的被表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中完成，其中所述表達(dá)載體含有編碼重組多肽的DNA序列。合適的宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母、桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。在表達(dá)后，可首先使用商業(yè)可得的濾膜來(lái)濃縮來(lái)自宿主/載體系統(tǒng)的上清液，所述宿主/載體系統(tǒng)將蛋白或多肽分泌到培養(yǎng)基中。在濃縮后，可將濃縮液施用到合適的純化基質(zhì)中，純化基質(zhì)例如為親合性基質(zhì)或離子交換樹(shù)脂?？墒褂靡徊交蚨嗖椒聪郒PLC，以進(jìn)一步純化重組多肽。
通常，本文所述多肽和多核苷酸是分離的。“分離的”多肽或多核苷酸是被從其原始環(huán)境中取出的。例如，如果將天然形成的蛋白從自然體系的一些或全部共存物質(zhì)中分離出來(lái)，則所獲得的天然形成的蛋白是分離的。優(yōu)選將本發(fā)明提供的多肽分離到純度為至少80％(按重量計(jì))，更優(yōu)選分離到純度為至少95％(按重量計(jì))，最優(yōu)選分離到純度為至少99％(按重量計(jì))。通常，可使用例如標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)硫酸銨分級(jí)分離、SDS-PAGE電泳和親合層析來(lái)完成該純化。如果例如將多核苷酸克隆到并非自然環(huán)境一部分的載體中，則認(rèn)為該多核苷酸是分離的?？贵w本發(fā)明進(jìn)一步提供與E3多肽特異性結(jié)合的抗體和其抗原結(jié)合片段。如果本文使用的抗體或抗原結(jié)合片段(例如在ELISA中)以可測(cè)水平與多肽反應(yīng)且不與無(wú)關(guān)蛋白發(fā)生可測(cè)的反應(yīng)，則稱這些抗體或抗原結(jié)合片段與多肽“特異性結(jié)合”。抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。優(yōu)選的抗體是在本發(fā)明所述遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)中抑制或阻斷E3活性的抗體。其他所選的抗體(其可用于例如免疫激酶實(shí)驗(yàn)中)是免疫沉淀活性E3的抗體，所述活性E3使用任何標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)(例如本發(fā)明提供的實(shí)驗(yàn))進(jìn)行檢測(cè)。
可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的各種技術(shù)制備抗體(參見(jiàn)，例如Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，1988)。在一種這樣的技術(shù)中，一開(kāi)始將包含多肽的免疫原注射到合適的動(dòng)物體內(nèi)(例如小鼠、大鼠、兔、綿羊和山羊)，優(yōu)選按照預(yù)定的包括了一次或多次加強(qiáng)免疫的時(shí)間表進(jìn)行注射，對(duì)動(dòng)物定期取血。接著，通過(guò)例如親合層析并使用偶聯(lián)到合適固相載體上的多肽，從這些血清中純化出多肽的特異性多克隆抗體。
單克隆抗體的制備例如可使用Kohler和Milstein的技術(shù)(Eur.J.Immunol.6511-519，1976)及其改進(jìn)方法。簡(jiǎn)言之，這些方法包括制備能產(chǎn)生具有所需特異性(即，與目的多肽的反應(yīng)性)的抗體的無(wú)限增殖細(xì)胞系。這些細(xì)胞系可從例如上述免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞中得到。接著，通過(guò)例如和骨髓瘤細(xì)胞融合，優(yōu)選和與免疫動(dòng)物同系的骨髓瘤細(xì)胞融合，來(lái)無(wú)限增殖該脾細(xì)胞。例如，脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞可與非離子型去垢劑結(jié)合數(shù)分鐘，然后以低密度接種到選擇性培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基支持雜交細(xì)胞的生長(zhǎng)，而不支持骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選的選擇技術(shù)使用HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)選擇。充足的時(shí)間通常約為1-2周。在這之后，觀察到雜交細(xì)胞群落?？蛇x擇出單一的群落并檢測(cè)其針對(duì)多肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。
單克隆抗體可從生長(zhǎng)中的雜交瘤克隆的上清液中分離。另外，可使用多種技術(shù)來(lái)提高產(chǎn)量，例如將雜交瘤細(xì)胞注射入合適的脊椎動(dòng)物宿主如小鼠的腹膜腔中。然后，可從腹水或血液中收獲多克隆抗體?？衫贸Ｒ?guī)技術(shù)將雜質(zhì)從抗體中去除，所述常規(guī)技術(shù)例如為層析、凝膠過(guò)濾、沉淀和提取。
在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用抗體的抗原結(jié)合片段。這些片段包括Fab片段，其可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制得。簡(jiǎn)言之，可通過(guò)A蛋白珠柱的親合層析將免疫球蛋白從兔血清中提純(Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白以得到Fab和Fc片段。Fab和Fc片段可通過(guò)例如A蛋白珠柱上的親合層析得以分離。遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)如上所述，E3多肽調(diào)節(jié)磷酰化IκB遍在蛋白化的能力可通過(guò)以下途徑得以評(píng)估將多肽與IκBα/NF-κB復(fù)合物(或其他合適的底物)、ATPγS、遍在蛋白E1、遍在蛋白E2一起溫育，并通過(guò)例如Western印跡使用IκBα的特異性抗體來(lái)檢測(cè)IκBα-遍在蛋白偶聯(lián)物。用于此處所述遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)的IκB多肽可以是天然人IκBα(SEQ ID NO1)或IκBβ(SEQ ID NO3)，或者可以是天然蛋白的變體。通常對(duì)IκB的多肽變體進(jìn)行修飾，以便使該變體在此處所述遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)中被磷?；捅樵诘鞍谆哪芰旧蠜](méi)有降低。可標(biāo)記IκB多肽。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過(guò)在體外多肽在35S-蛋氨酸存在下的翻譯，可將35S引入IκB多肽。
通常，可使用體外系統(tǒng)如麥芽提取物，通過(guò)DNA在培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中的表達(dá)或通過(guò)翻譯，從編碼該多肽的DNA制備IκB多肽。如果使用宿主細(xì)胞，該細(xì)胞優(yōu)選是細(xì)菌、酵母、桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)，可將重組DNA克隆進(jìn)任何適合在所述宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體中。通?？砂凑罩圃焐痰闹甘荆M(jìn)行多肽的體外翻譯。
在體外翻譯后，無(wú)需純化即可使用表達(dá)的IκB多肽。多肽也可以是以基本上純的形式分離的?？蓪κB多肽分離到純度為至少80％(按重量計(jì))，更優(yōu)選分離到純度為至少95％(按重量計(jì))，最優(yōu)選分離到純度為至少99％(按重量計(jì))。通常，可使用例如本文所述的典型純化方法或者硫酸銨分級(jí)分離、SDS-PAGE電泳和親合層析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)完成該純化。
某些遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)可使用細(xì)胞E3去表征E3活性的調(diào)節(jié)劑。在這些實(shí)驗(yàn)中，可在體外將來(lái)自受激或未受激Jurket、HeLa、THP-1或內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞提取物與IκB多肽一起在ATP和磷酸酶抑制劑岡田軟海綿酸的存在下溫育。通?？砂凑誂lkalay等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210599，1995)制備細(xì)胞提取物。溫育的條件應(yīng)足以導(dǎo)致IκB多肽(在IκBα及其變體的絲氨酸32和36上)的磷酰化以及磷?；嚯?pIκB)與細(xì)胞衍生的NF-κB復(fù)合物之間的結(jié)合。例如，IκB多肽可與HeLa或Jurket的細(xì)胞提取物、ATP和岡田軟海綿酸一起溫育。在30℃下溫育90分鐘已足以使IκB多肽磷?；?。在此溫育之后，可如Alkalay等人所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210599，1995)，用例如抗p65的抗體免疫純化pIκB/NF-κB復(fù)合物，并在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行pIκB/NF-κB復(fù)合物的體外遍在蛋白化。接著，可先使用熟知的SDS-PAGE技術(shù)并隨后使用放射自顯影技術(shù)，來(lái)評(píng)定遍在蛋白化水平。
在這些條件下，野生型35S-pIκBα多肽在ATPγS的存在下產(chǎn)生多個(gè)遍在蛋白化的類別(參見(jiàn)圖1A，泳道4)。35S標(biāo)記的IκBαS32/36A突變體(泳道1)和未磷?；囊吧?5S-IκBα(泳道2)均不能發(fā)生遍在蛋白化。然而，突變體或野生型IκBα的游離形式易于發(fā)生偶聯(lián)(圖1B)。與之相似，可使游離的(而不是與復(fù)合物結(jié)合)IκBα第21、22位賴氨酸突變體在體外遍在蛋白化。因此，不同于使用游離IκB多肽進(jìn)行的遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)，此處提供的遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)只靶向與復(fù)合物結(jié)合的且已適當(dāng)磷?；腎κB多肽。
上述遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)可用于識(shí)別調(diào)節(jié)IκB遍在蛋白化的物質(zhì)。調(diào)節(jié)劑可包括抗體(例如單克隆抗體)、肽、小分子(例如來(lái)自組合文庫(kù))和其他刺激或優(yōu)選抑制IκBα和/或IκBβ多肽遍在蛋白化的藥物。通常，可通過(guò)將候選調(diào)節(jié)劑包括在遍在蛋白化反應(yīng)中并評(píng)價(jià)它對(duì)遍在蛋白化水平的影響，來(lái)識(shí)別所述的調(diào)節(jié)劑，所述遍在蛋白化的反應(yīng)可如上所述另外進(jìn)行。候選物質(zhì)用于這一實(shí)驗(yàn)的合適濃度為約0.1μM-約1mM。對(duì)于肽候選物質(zhì)，可加入肽酶抑制劑，例如苯丁抑制素(40μg/ml)，優(yōu)選的肽量為約10μM-約1mM。對(duì)遍在蛋白化水平產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的影響的候選物質(zhì)包括在本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑范圍之內(nèi)。
可通過(guò)將物質(zhì)(例如約5mg/ml的肽物質(zhì))顯微注射到合適的細(xì)胞(例如HeLa細(xì)胞或初級(jí)人血管內(nèi)皮細(xì)胞)中，進(jìn)一步評(píng)價(jià)該物質(zhì)。在顯微注射之后，可(例如用TNFα)刺激細(xì)胞，并溫育細(xì)胞以使NF-κB活化。在HeLa細(xì)胞中，TNFα誘發(fā)NF-κB快速核易位至細(xì)胞核中，這可用p65的特異性抗體通過(guò)染色進(jìn)行檢測(cè)。調(diào)節(jié)劑引起NF-κB易位的統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的降低，并可將此易位降低至不可測(cè)的水平。
通過(guò)受NF-κB調(diào)控的粘附蛋白在表面上的表達(dá)，初級(jí)人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)對(duì)TNFα刺激產(chǎn)生響應(yīng)，所述粘附蛋白例如為ICAM-1、V-CAM-1和E-選擇蛋白(Read et al.，Immunity 2493，1995；Chen et al.，J.Immunol.1553538，1995)。E-選擇蛋白特別是NF-κB依賴性的，它是主要可誘導(dǎo)的內(nèi)皮粘附分子，最初貼附于嗜中性粒細(xì)胞上并在活化了的內(nèi)皮上滾動(dòng)。受激細(xì)胞可被固定并染色，以檢測(cè)一種或多種受NF-κB調(diào)控的粘附蛋白的表達(dá)。多肽或其他調(diào)節(jié)劑的顯微注射對(duì)該表達(dá)產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的抑制，但不影響NF-κB非依賴型粘附蛋白如ICAM2的表達(dá)。治療應(yīng)用如上所述，本文所述的某些E3多肽、多核苷酸、抗體和其他物質(zhì)通?？捎米髡{(diào)節(jié)劑以特異性地抑制或增強(qiáng)細(xì)胞NF-κB的功能。調(diào)節(jié)劑也可用于調(diào)節(jié)患者體內(nèi)IκBα和/或IκBβ的遍在蛋白化，由此在體內(nèi)調(diào)節(jié)NF-κB的細(xì)胞功能。此處使用的“患者”可以是包括人在內(nèi)的任何哺乳動(dòng)物，其可以患有與NF-κB活化相關(guān)的疾病，或者未患有可測(cè)的疾病。因此，治療可以是針對(duì)現(xiàn)有疾病的或者是預(yù)防性的。與NF-κB活化相關(guān)的疾病包括但不限于，炎癥、自身免疫性疾病、癌癥和病毒感染。
治療是指本文所述調(diào)節(jié)劑的給藥。為給藥至患者，通常將一種或多種所述化合物配制成藥物組合物。藥物組合物可以是無(wú)菌的水溶液或非水溶液、混懸液或者乳劑，其另外還包含生理上可接受的載體(即不干擾活性成分的活性的無(wú)毒材料)?？蓪⒈绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的任何合適的載體用于本發(fā)明的藥物組合物中。典型載體包括生理鹽水、明膠、水、醇類、天然或合成的油、糖溶液、乙二醇、注射用有機(jī)酯如油酸乙酯或者這些材料的組合?？扇芜x地，藥物組合物另外還可含有防腐劑和/或其他添加劑和/或其他活性成分，所述添加劑例如有抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和/或惰性氣體。
此外，藥物組合物還可包含與生理上可接受的載體相結(jié)合的編碼調(diào)節(jié)劑的多核苷酸(從而使調(diào)節(jié)劑在原位生成)。在該藥物組合物中，多核苷酸可存在于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的各種傳遞系統(tǒng)(包括核酸、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng))和膠體分散系統(tǒng)(包括脂質(zhì)體)中的任何一種系統(tǒng)中。適宜的核酸表達(dá)系統(tǒng)包含了對(duì)在患者體內(nèi)表達(dá)所必需的多核苷酸序列(例如合適的啟動(dòng)子和終止信號(hào))。正如例如Ulmer等人所述，DNA也可以是“裸露的”(Science 2591745-1749，1993)。
可用來(lái)將核酸序列導(dǎo)入目標(biāo)患者細(xì)胞中的多種病毒載體包括，但不限于，牛痘或其他痘病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒。將DNA導(dǎo)入這些載體的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是鼠類或鳥(niǎo)類逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物，包括但不限于莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMuLV)、哈維鼠類肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠類乳腺瘤病毒(MuMTV)和勞斯肉瘤病毒(RSV)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可另外轉(zhuǎn)移或摻入作為可選標(biāo)志的基因(以有助于被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的識(shí)別或選擇)和/或一特定靶細(xì)胞上受體的配體的編碼基因(以使載體具有靶特異性)。例如，可通過(guò)插入編碼糖、糖脂或蛋白的核苷酸序列，使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是靶特異的。也可使用抗體經(jīng)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法來(lái)完成靶向。
病毒載體一般是非病原性的(缺陷性的)可復(fù)制病毒，它們需要幫助以產(chǎn)生傳染性的載體顆粒。例如，可通過(guò)使用含有質(zhì)粒的輔助細(xì)胞系來(lái)提供此幫助，所述質(zhì)粒在LTR中的調(diào)控序列的控制下編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒的所有結(jié)構(gòu)基因，但這些質(zhì)粒不含能使裝配機(jī)構(gòu)識(shí)別出用于包裝的RNA轉(zhuǎn)錄物的核酸序列。這樣的輔助細(xì)胞系包括(但不限于)ψ2、PA317和PA12。可對(duì)引入所述細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行裝配，產(chǎn)生載體病毒體。接著，可將用此方法產(chǎn)生的載體病毒體用于感染組織細(xì)胞系如NIH 3T3細(xì)胞，以產(chǎn)生大量嵌合的逆轉(zhuǎn)錄病毒體。
另一針對(duì)多核苷酸的靶向傳遞系統(tǒng)是膠體分散系統(tǒng)。膠體分散系統(tǒng)包括高分子復(fù)合物、毫微囊、微球體、珠和基于類脂的系統(tǒng)，基于類脂的系統(tǒng)包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。在體外和體內(nèi)用作傳遞工具的優(yōu)選膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體(即人工膜囊泡)。業(yè)已顯示，大小為0.2-4.0μm的單層大囊泡(LUV)可封裝絕大部分的含有高分子的緩沖水溶液?？蓪NA、DNA和完整的病毒體封裝在含水的內(nèi)部，并將它們以生物活性形式傳遞到細(xì)胞中(Fraley，et al.，Trends Biochem.Sci.677，1981)。除了哺乳動(dòng)物細(xì)胞之外，脂質(zhì)體還可用于將多核苷酸傳遞到植物、酵母和細(xì)菌的細(xì)胞中。為使脂質(zhì)體成為有效的基因轉(zhuǎn)移工具，以下特征必須存在(1)對(duì)目的基因進(jìn)行高效封裝而同時(shí)不危及其生物活性；(2)與非靶細(xì)胞相比，優(yōu)先且主要與靶細(xì)胞結(jié)合；(3)高效地將囊泡的含水內(nèi)容物傳遞到靶細(xì)胞的胞質(zhì)中；和(4)準(zhǔn)確并有效地表達(dá)遺傳信息(Mannino，et al.，Biotechniques 6882，1988)。
脂質(zhì)體的尋靶可基于解剖學(xué)和機(jī)械因素進(jìn)行分類。解剖學(xué)分類建立在選擇性的基礎(chǔ)上，其可以是例如器官特異的、細(xì)胞特異的和/或細(xì)胞器特異的。機(jī)械尋靶可基于其是被動(dòng)還是主動(dòng)來(lái)進(jìn)行區(qū)分。被動(dòng)尋靶利用了脂質(zhì)體傾向于分布到器官的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)細(xì)胞中的自然傾向，其中所述的器官含有竇狀毛細(xì)血管。在另一方面，主動(dòng)尋靶涉及通過(guò)將脂質(zhì)體偶聯(lián)到特異性配體上導(dǎo)致的脂質(zhì)體變化，或通過(guò)改變脂質(zhì)體組成或大小導(dǎo)致的脂質(zhì)體變化，所述特異性配體例如為單克隆抗體、糖、糖脂或蛋白，所述改變脂質(zhì)體組成或大小是為了實(shí)現(xiàn)向器官和細(xì)胞類型尋靶，而不靶向天然形成的局部位點(diǎn)。
給藥的途徑、頻率和劑量隨患者的不同而不同。通常，藥物組合物可經(jīng)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腔內(nèi)或透皮給藥。每天可給藥1至6次。合適的劑量應(yīng)足以改善患與NF-κB活化相關(guān)的疾病患者的癥狀。這樣的改善可通過(guò)監(jiān)測(cè)炎性反應(yīng)(例如水腫、移植排斥、超敏性)或通過(guò)與所述疾病相關(guān)的臨床癥狀的改善來(lái)得以檢測(cè)。通常，存在于一劑中的調(diào)節(jié)劑或由一劑中的由DNA原位產(chǎn)生的調(diào)節(jié)劑的量為約1μg-約100mg/kg宿主。合適的劑量大小隨患者的大小而變，但一般為約10mL-500mL/10-60kg動(dòng)物。
提供以下實(shí)施例作為說(shuō)明而非限制。實(shí)施例實(shí)施例1使用遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)鑒定IκB E3識(shí)別基元本實(shí)施例說(shuō)明一典型遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)以及該實(shí)驗(yàn)在評(píng)價(jià)肽抑制IκB遍在蛋白化的能力上的應(yīng)用A.體外遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)按照制造商的指示(Promega，Madison，WI)，在麥芽提取物中，在35S-蛋氨酸的存在下，在體外翻譯以HA示蹤的IκBα或以HA示蹤的IκBβ cDNA(Haskill et al.，Cell 651281-1289，1991)。為了磷酰化IκBα或IκBβ，1μl含有標(biāo)記蛋白的提取物在終體積為30μl的反應(yīng)混合物中在30℃溫育90分鐘，所述反應(yīng)混合物為100μg HeLa或Jurkat細(xì)胞提取物(如Alkalay et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210599，1995所述進(jìn)行制備)、2mM ATP和1μM岡田軟海綿酸。在此溫育過(guò)程中，標(biāo)記的IκB多肽在絲氨酸32和36上發(fā)生磷?；?，并與內(nèi)源性NF-κB復(fù)合物結(jié)合(數(shù)據(jù)未列出)。
在溫育后，加入1μl抗p65的血清，將NF-κB免疫復(fù)合物固定到蛋白A-瓊脂糖凝膠上并在如Alkalay等人所述的HeLa細(xì)胞提取物中進(jìn)行體外遍在蛋白化。已遍在蛋白化的蛋白通過(guò)SDS-PAGE得以分離，并通過(guò)放射自顯影得以顯影。
如圖1A所示，只有野生型35S-pIκBα多肽生成多個(gè)遍在蛋白化的類別(泳道4)。35S標(biāo)記的IκBα S32/36A突變體(泳道1)和未磷?；囊吧?5S-IκBα(泳道2)均不能發(fā)生遍在蛋白化，在ATP不存在的條件下未觀察到pIκBα的遍在蛋白化(泳道3)。
通過(guò)比較游離的35S-IκB的遍在蛋白化和復(fù)合物結(jié)合型磷?；孜锏捏w外遍在蛋白化，進(jìn)一步證明本實(shí)驗(yàn)的生理關(guān)聯(lián)性。依據(jù)復(fù)合物結(jié)合型S32/36A突變體在體內(nèi)的命運(yùn)，它不能與遍在蛋白偶聯(lián)，而突變體或野生型IκBα的游離形式易于發(fā)生偶聯(lián)(圖1B)。與之相似，只有游離的而非與復(fù)合物結(jié)合的IκBα第21、22位賴氨酸突變體可在體外遍在蛋白化(數(shù)據(jù)未列出)。因此，當(dāng)以無(wú)差別形式通過(guò)遍在蛋白系統(tǒng)識(shí)別游離的IκBα?xí)r，與復(fù)合物結(jié)合的抑制劑被遮蔽了，除非它經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)亓柞；?。B.鑒定IκBα-遍在蛋白連接酶識(shí)別基元為了鑒定IκBα-遍在蛋白連接酶識(shí)別基元，在肽酶抑制劑苯丁抑制素(40μg/ml)的存在下，將多種肽以不同濃度加入反應(yīng)混合物中。這些肽橫跨蛋白的N端信號(hào)域，它們?cè)谝粋€(gè)或兩個(gè)絲氨酸殘基(第32和36位)上發(fā)生磷?；蛘咚鼈兪俏唇?jīng)修飾的或絲氨酸被替換的。將這些肽以不同濃度包括在遍在蛋白化反應(yīng)中，并測(cè)試其對(duì)pIκBα特異性遍在蛋白化的抑制。當(dāng)監(jiān)測(cè)到游離IκBα的偶聯(lián)時(shí)，直接將經(jīng)翻譯的蛋白加入偶聯(lián)反應(yīng)混合物中。
只有在絲氨酸32和36上均發(fā)生磷?；碾?pIκBα肽)才能有效地抑制pIκBα的遍在蛋白化(圖1A，泳道7、11-14)。在濃度為400μM時(shí)，c-Fos磷酸肽(ppFos，泳道5)、第32、36位絲氨酸替換為丙氨酸的IκBα肽(p21 S/A，泳道6)和未磷?；碾?p21，泳道8)不對(duì)pIκB的遍在蛋白化產(chǎn)生可測(cè)的影響。計(jì)算磷?；疘κBα肽的IC50，典型抑制濃度示于圖1A。二磷?；腎κBα肽抑制pIκB的偶聯(lián)反應(yīng)(泳道7、11-14)，其IC50為5μM。在上面的表1和SEQ ID NO5-9中提供了這些肽的序列。相反，單磷?；碾?泳道9、10)抑制pIκBα的偶聯(lián)反應(yīng)，其IC50為400μM。測(cè)試的最小肽(pp7，泳道14)僅橫跨信號(hào)磷酰化位點(diǎn)，它足以有效地抑制遍在蛋白化，盡管其IC50較高(10μM)。因此，包含SEQ ID NO1中的殘基21-41的肽包含了針對(duì)E3遍在蛋白連接酶的識(shí)別域。有趣的是，第21和22位的賴氨酸對(duì)于抑制并非是必需的，這意味遍在蛋白系統(tǒng)的識(shí)別位點(diǎn)與實(shí)際的偶聯(lián)位點(diǎn)是不同的。
在兩個(gè)其他的遍在蛋白偶聯(lián)反應(yīng)中測(cè)試肽的特異性，所述兩個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)為游離野生型(圖1B，泳道1-3)或S32/36A突變IκBα(圖1B，泳道4-6)的偶聯(lián)，以及遍在蛋白與HeLa提取物中的大量細(xì)胞蛋白間的偶聯(lián)(按照Alkalay等人所述，用125I標(biāo)記的遍在蛋白檢測(cè)，圖1C)。IκBα-遍在蛋白連接酶識(shí)別基元或?qū)φ针牡募尤氩挥绊戇@兩個(gè)反應(yīng)。
已發(fā)現(xiàn)，包含IκBα-遍在蛋白連接酶識(shí)別基元的肽使與pIκBα相關(guān)的底物pIκBβ不能遍在蛋白化(圖1D)。與pIκBα的偶聯(lián)相似，IκBβ的特異性偶聯(lián)也要求有結(jié)合的NF-κB復(fù)合物存在(未顯示)，并在與IκBα同源的殘基第19和23位絲氨酸上已經(jīng)發(fā)生了磷?；Ｔ诹姿崦敢种苿┎淮嬖诘臈l件下制備的IκBβ底物不發(fā)生遍在蛋白化(圖1D，泳道1)。肽影響pIκBβ的遍在蛋白化，其IC50類似于在pIκBα情況中觀察到的IC50(圖1D，泳道4-7)。因此，這顯示相同的酶靶向兩種IκB，以進(jìn)行遍在蛋白依賴型降解。
在互補(bǔ)的遍在蛋白依賴型體外降解實(shí)驗(yàn)中測(cè)試抑制性pIκBα肽(Orian et al.，J.Biol.Chem.27021707，1995；Stancovski et al.，Mol.Cell.Biol.157106，1995)。使用該實(shí)驗(yàn)，只有受激細(xì)胞產(chǎn)生的pIκBα以依賴于遍在蛋白的方式發(fā)生體外降解，而來(lái)自相同細(xì)胞提取物的未磷?；腎κBα不發(fā)生降解。將抑制偶聯(lián)的磷酸肽引入降解實(shí)驗(yàn)，這導(dǎo)致pIκBα底物的穩(wěn)定(圖2，泳道3、4)，而未磷?；碾奈镔|(zhì)或磷酸-Fos肽對(duì)照不影響特異的pIκBα降解(泳道5、6)。所述肽在賴氨酸21/22上的修整不降低降解抑制作用(泳道4)，這說(shuō)明所述肽不會(huì)通過(guò)消耗作為可偶聯(lián)的底物的遍在蛋白-蛋白體系統(tǒng)來(lái)廢止pIκBα的降解。實(shí)施例2鑒定參與底物識(shí)別的遍在蛋白系統(tǒng)成分本實(shí)施例說(shuō)明對(duì)負(fù)責(zé)pIκB多肽識(shí)別的特定E3的鑒定。
pIκBα-遍在蛋白偶聯(lián)和降解需要全套遍在蛋白系統(tǒng)酶E1、源自遍在蛋白系統(tǒng)級(jí)分I的特定E2、E2F1(Alkalay et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210599，1995；Chen et al.，Cell 84853，1996)和級(jí)分II-成分E3。為了鑒定參與底物識(shí)別的遍在蛋白系統(tǒng)成分，將HeLa溶胞產(chǎn)物經(jīng)IκBα磷酸肽柱分級(jí)分離，分析流通級(jí)分以用于pIκBα偶聯(lián)。按照制造商的指示，將肽以2mg/ml的濃度連接到NHS-瓊脂糖凝膠(Pharmacia)上。在0.1％NP40和3％卵清蛋白的存在下，100μg HeLa提取物與2.5μl偶聯(lián)樹(shù)脂在4℃一起溫育1小時(shí)。棄去樹(shù)脂，在上述遍在蛋白化實(shí)驗(yàn)中測(cè)試未結(jié)合的物質(zhì)。
從對(duì)照磷酸肽柱和S32/36A肽柱得到的流通級(jí)分保留了全部IκBα偶聯(lián)能力(圖3A，泳道2、3)，而從兩個(gè)不同pIκBα肽得到的流通級(jí)分失去了它們的IκBα特異性偶聯(lián)能力(泳道4、7)。消耗的偶聯(lián)活性可由網(wǎng)狀細(xì)胞級(jí)分II進(jìn)行補(bǔ)充(泳道5、8)，該級(jí)分含有E3酶的所有已知類別(Ciechanover，Cell 7913，1994)。補(bǔ)充不能通過(guò)加入級(jí)分I或者級(jí)分I和E1獲得(分別為泳道6和9)，這表明肽柱消耗E3，而不消耗E2或E1。此外，IκBα的第21和22位賴氨酸殘基對(duì)于保留E3不是必要的(比較圖3A，泳道7至泳道4)，這強(qiáng)調(diào)在底物識(shí)別位點(diǎn)和偶聯(lián)位點(diǎn)的不同。當(dāng)所有流通級(jí)分在隨機(jī)HeLa蛋白偶聯(lián)中維持全部活性時(shí)，肽柱消耗被發(fā)現(xiàn)是對(duì)IκBE3特異的(通過(guò)檢查125I遍在蛋白的偶聯(lián)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，圖3B)。這表明特定E3負(fù)責(zé)在識(shí)別基元處識(shí)別pIκB。實(shí)施例3典型肽對(duì)細(xì)胞NF-κB活化的影響本實(shí)施例說(shuō)明，通過(guò)顯微注射包含IκBα-遍在蛋白連接酶識(shí)別基元的肽，抑制細(xì)胞NF-κB活化。
在顯微注射前，將HeLa細(xì)胞植在方格蓋玻片(Cellocate，Eppendorf)上18小時(shí)。使用半自動(dòng)器械(Eppendorf)，用22個(gè)氨基酸的pIκBα肽(pp21；表1和SEQ ID NO9)或?qū)φ樟姿?Fos肽(SEQ ID NO10)進(jìn)行顯微注射。將在100mM KCl、5mM Na2HPO4(pH7.2)中濃度為5mg/ml的肽注射入細(xì)胞質(zhì)中，然后立即用TNFα(200單位/mL)活化20分鐘(用于NF-κB易位)或3小時(shí)(用于E選擇蛋白的表達(dá))。在活化后，將細(xì)胞固定，并用p65的特異性抗體(Mercurio et al.，Genes & Dev.7705，1993；Santa Cruz)或抗E選擇蛋白的單克隆抗體(R&D Systems)將細(xì)胞染色。
正如90％細(xì)胞的p65核染色所示，當(dāng)肽不存在時(shí)，TNFα引發(fā)NF-κB快速核易位至細(xì)胞核中(參見(jiàn)圖4G，第2列)。在一些試驗(yàn)中，pp21肽廢止了TNFα刺激的NF-κB活化(參見(jiàn)圖4A和4B中的典型區(qū)域；和圖4G，第3列)。相反，與未顯微注射的細(xì)胞相比，對(duì)照pp-Fos肽不影響NF-κB誘導(dǎo)核易位的速率(圖4C和4G，第4列)。
為了進(jìn)一步評(píng)估NF-κB抑制的功能性結(jié)果，將IκB-E3抑制性肽顯微注射到初級(jí)人血管內(nèi)皮細(xì)胞中(HUVEC；Chen et al.，J.Immunol1553538，1995)。通過(guò)由NF-κB調(diào)控的粘附蛋白(例如E選擇蛋白)在表面的表達(dá)，這些細(xì)胞對(duì)TNFα產(chǎn)生響應(yīng)。如上所述培植、顯微注射和刺激HUVEC細(xì)胞。在刺激后3小時(shí)，細(xì)胞被固定并染色，以標(biāo)明NF-κB依賴型E選擇蛋白的表達(dá)。在一些試驗(yàn)中，在TNFα刺激后，75％-85％的HUVEC細(xì)胞由于E選擇蛋白而深度染色。顯微注射pp21肽導(dǎo)致在70％-80％顯微注射的細(xì)胞中E選擇蛋白的表達(dá)受到抑制(圖4D；和圖4H，第3列)。相反，與未經(jīng)顯微注射的細(xì)胞相比，對(duì)照pp-Fos肽不影響E選擇蛋白的表達(dá)(圖4F和圖4H，第4列)。對(duì)照S32/36A替換的IκBα肽的顯微注射不影響E選擇蛋白表達(dá)的速率。
這些結(jié)果證明，由信號(hào)誘導(dǎo)而磷?；腎κBα和IκBβ的亞基特異性降解由特定E3介導(dǎo)。針對(duì)E3遍在蛋白連接酶的識(shí)別域是一短序列，其以兩個(gè)由信號(hào)得到的磷酸絲氨酸為中心，這代表第一個(gè)生物學(xué)上有關(guān)的E3識(shí)別基元，在兩種IκB中所述的磷酸絲氨酸是保守的。IκB識(shí)別的特異性由描述磷酰化底物的上下文所支持結(jié)合的細(xì)胞復(fù)合物使底物與非特異性E3隔絕。該特征將NF-κB抑制劑的降解限制于刺激后的階段，此時(shí)它通過(guò)位點(diǎn)特異性磷?；c特異的連接酶相接觸。使用本發(fā)明提供的調(diào)節(jié)劑，通過(guò)在體內(nèi)抑制IκB連接酶，可廢止NF-κB的活化和其產(chǎn)生的作用。實(shí)施例4進(jìn)一步表征IκBα的遍在蛋白化本實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明與IκBα遍在蛋白化相關(guān)的遍在蛋白連接酶的特征A.細(xì)胞因子刺激促進(jìn)pIκBα和特異性遍在蛋白-連接酶之間的結(jié)合為了進(jìn)一步研究由磷酰化IκBα-復(fù)合物引起的遍在蛋白結(jié)構(gòu)成分的補(bǔ)充，從蛋白體抑制的、TNF-α刺激的HeLa細(xì)胞中純化出pIκBα/NF-κB復(fù)合物，并評(píng)價(jià)其遍在蛋白化能力。HeLa細(xì)胞與蛋白體抑制劑ALLN(150μM)預(yù)溫育1小時(shí)，用TNF-α刺激10分鐘。IκBα/NF-κB復(fù)合物用山羊抗Rel A(p65)的抗體(Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)和同源p65肽(ELFPLIFPAEPAQASGP(SEQ ID NO21)，其是合成的并購(gòu)自Alfa-Diagnostic，Inc.，而后其經(jīng)HPLC純化，經(jīng)質(zhì)譜分析，證明了預(yù)計(jì)的結(jié)構(gòu)并證實(shí)純度超過(guò)85％)進(jìn)行免疫親合純化。
向經(jīng)免疫純化的級(jí)分中添加遍在蛋白系統(tǒng)的多種成分，并進(jìn)行體外遍在蛋白化。具體地講，所述級(jí)分中添加有0.2μg純化的E1和0.1μg純化的重組UBC5C(Jensen et al.，J.Biol.Chem.27030408-30414，1995)，并在反應(yīng)緩沖液中在37℃溫育90分鐘，所述反應(yīng)緩沖液含有50mM Tris(pH7.6)、2mM MgCl2、1mM DTT、20nM岡田軟海綿酸、1mg/ml牛遍在蛋白(Sigma)和5mM ATPγS(Sigma)。反應(yīng)混合物接著在SDS-緩沖液中加熱至沸，樣品通過(guò)SDS-PAGE(8.5％)和磷酸成像進(jìn)行分析。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，遍在蛋白、純化的E1和特定E2、UBC5C的加入足以產(chǎn)生全容量IκBα-遍在蛋白偶聯(lián)活性(圖5，第2列)，這在與IκBα特異性抗血清反應(yīng)的大分子物質(zhì)的積聚中十分明顯。該活性是依賴于E1的(比較泳道1和2)，來(lái)自未受激HeLa細(xì)胞的相應(yīng)的免疫純化級(jí)分不能提供該活性(比較泳道4、5、6)。當(dāng)受激HeLa的級(jí)分同時(shí)含有磷?；臀戳柞；腎κBα?xí)r，觀察到的偶聯(lián)物可以源自兩種IκB中的任一種。
為了確定IκBα-偶聯(lián)物的來(lái)源，在pIκBα肽(pp12；CDRHDS[PO3]GLDS[PO3]；SEQ ID NO22)(泳道7)或絲氨酸/谷氨酸替換的IκBα肽(p12S/E)(泳道8)的存在下進(jìn)行遍在蛋白化反應(yīng)。兩種肽均是合成的并購(gòu)自Alfa-Diagnostic，Inc.，而后其經(jīng)HPLC純化，經(jīng)質(zhì)譜分析，證明了預(yù)計(jì)的結(jié)構(gòu)并證實(shí)純度超過(guò)85％。在肽酶抑制劑苯丁抑制素(40μg/ml)的存在下，將IκBα肽以指定濃度加入反應(yīng)混合物中。只有pp12使多遍在蛋白-IκBα偶聯(lián)物不能形成，這表明遍在蛋白化對(duì)pIκBα是特異的(Yaron et al.，EMBO J.166486-6494，1997)。B.磷?；瘜?duì)于補(bǔ)充特異性遍在蛋白-連接酶活性是必要且充分的E1和E2特異性地補(bǔ)充受激HeLa級(jí)分的pIκBα-偶聯(lián)物，但不補(bǔ)充未受激級(jí)分，這一發(fā)現(xiàn)可有若干解釋a)HeLa刺激活化了特異性pIκB-遍在蛋白連接酶；b)HeLa刺激修飾了底物，由此使它易于遍在蛋白化；或c)HeLa刺激對(duì)于修飾底物和連接酶均是必要的。為了區(qū)分這幾種可能，使用重組的、組成活化的IKK2蛋白(IKK2-EE)(Mercurioet al.，Science 278860-66，1997)。類似于TNFα激活I(lǐng)KK-復(fù)合物，該蛋白在絲氨酸32/36上磷?；疘κBα。
先使未受激HeLa的溶胞產(chǎn)物與重組的35S標(biāo)記的IκBα一起溫育，再將來(lái)自未受激HeLa溶胞產(chǎn)物的35S標(biāo)記的IκBα/NF-κB復(fù)合物免疫沉淀，之后，復(fù)合物用重組IKK2-EE磷?；?、用p65同源肽洗脫并進(jìn)行體外遍在蛋白化。在與IKK2-EE溫育后，幾乎所有的35S-IκB都發(fā)生磷?；?。而遍在蛋白、E1和UBC5C的加入并不能導(dǎo)致pIκBα的磷?；?圖6，泳道2)。因此，由IKK引起的IκB磷酰化不足以促進(jìn)其在E1和E2存在下的遍在蛋白化?？梢韵胂?，pIκBα遍在蛋白化需要附加的HeLa溶胞產(chǎn)物成分，該成分沒(méi)有從未受激細(xì)胞中共免疫純化。
為證明這一假說(shuō)，或直接地或在IKK2-EE磷?；?，將免疫結(jié)合的IκBα/NF-κB復(fù)合物與未受激HeLa的溶胞產(chǎn)物一起溫育，用高鹽緩沖液徹底洗滌，并用p65肽洗脫。事實(shí)上，HeLa溶胞產(chǎn)物與磷酰化IκB復(fù)合物(圖6，泳道3)而不是與未磷酰化的IκB復(fù)合物(泳道1)的溫育提供了pIκBα偶聯(lián)所需的pIκB-連接酶成分。當(dāng)把E1或E2從反應(yīng)中略去時(shí)，沒(méi)有得到任何信號(hào)，這證明凝膠上方的信號(hào)代表多個(gè)遍在蛋白IκBα-偶聯(lián)物(泳道5、6)。在提供必要的連接酶成分方面，受TNFα刺激的HeLa的溶胞產(chǎn)物不比未受激的溶胞產(chǎn)物優(yōu)越。
pp12對(duì)pIκBα遍在蛋白化的抑制作用(圖5)暗示，在溫育過(guò)程中基本HeLa成分特異并穩(wěn)定地與pIκBα識(shí)別基元結(jié)合，之后，這些基本成分在pIκB-遍在蛋白偶聯(lián)中發(fā)揮作用。為了測(cè)試這一設(shè)想，將pp12或?qū)φ针膒12S/E包括在溫育過(guò)程中，在洗脫級(jí)分前，可將這些肽與HeLa溶胞產(chǎn)物一同除去。pp12(圖6，泳道4)而不是p12S/E(泳道5)的加入廢止了與pIκB-復(fù)合物相關(guān)的遍在蛋白-連接酶活性，同時(shí)保持了底物的完整。這對(duì)于肽處理級(jí)分在網(wǎng)狀細(xì)胞級(jí)分II的存在下發(fā)生遍在蛋白化的能力是明顯的，所述網(wǎng)狀細(xì)胞級(jí)分II是E3源?？蓮拇嗽囼?yàn)中得出若干結(jié)論1)pIκBα遍在蛋白化所必須的遍在蛋白-連接酶成分由IκBα/NF-κB復(fù)合物在IKK磷酰化后從HeLa溶胞產(chǎn)物中補(bǔ)充。
2)此促進(jìn)偶聯(lián)的成分含在未受激的HeLa溶胞產(chǎn)物中，這表明不需要通過(guò)TNF刺激來(lái)活化遍在蛋白-連接酶。
3)基本連接酶成分顯然是特異的，該成分通過(guò)與pIκB識(shí)別基元的直接作用來(lái)與IκB結(jié)合(通過(guò)pp12對(duì)pIκBα-偶聯(lián)物的抑制來(lái)證實(shí))。C.分離識(shí)別pIκBα的特異性遍在蛋白-連接酶成分
HeLa提取物(250mg)與250μl抗p65的免疫珠一起溫育。在A緩沖液(1M KCl、0.5％NP40、50mM pH7.6的Tris緩沖液、1mM DTT)中洗滌四次，在B緩沖液(50mM pH 7.6的Tris緩沖液、1mM DTT)中洗滌一次。然后，這些珠中的一半用IKK進(jìn)行體外磷?；?，另一半進(jìn)行模擬磷?；?。珠在A緩沖液中洗滌兩次，在B緩沖液中洗滌一次。它們與100mg HeLa提取物在1μm岡田軟海綿酸存在下于25℃攪拌30分鐘，在A緩沖液中洗滌四次，在B緩沖液中洗滌一次，用1mg/ml p65肽洗脫。使用10mg35S代謝標(biāo)記的HeLa溶胞產(chǎn)物(100μCi/ml蛋氨酸/半胱氨酸，8小時(shí))和25μl p65-免疫珠進(jìn)行相似的試驗(yàn)。源自熱和冷溶胞產(chǎn)物的洗脫物-級(jí)分相互混合，在SDS-樣品緩沖液中加熱至沸，并通過(guò)7.5％SDS-PAGE和放射自顯影進(jìn)行分析。將與放射自顯影信號(hào)對(duì)應(yīng)的凝膠片切下，并如下所述通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定其蛋白帶的序列。
通過(guò)SDS-PAGE分析，比較三個(gè)經(jīng)免疫親合純化的級(jí)分(圖7A)1)一個(gè)含有IκBα/NF-κB復(fù)合物的級(jí)分，該級(jí)分未經(jīng)IKK2-EE磷?；?，但與HeLa溶胞產(chǎn)物一起溫育；2)一個(gè)經(jīng)IKK2-EE磷?；译S后與HeLa溶胞產(chǎn)物一起溫育的級(jí)分；3)一個(gè)經(jīng)IKK2-EE磷?；磁cHeLa溶胞產(chǎn)物一起溫育的級(jí)分。所有溫育均在由免疫珠固定的復(fù)合物上進(jìn)行，然后，徹底洗滌該復(fù)合物并用p65肽洗脫。
三個(gè)級(jí)分的SDS-PAGE分析揭示了模式變化，該變化歸因于IKK磷?；驓w因于IκBα/NF-κB蛋白的進(jìn)一步免疫吸附，但所述分析沒(méi)有辨明任何在IKK磷?；笱a(bǔ)充到IκB復(fù)合物中的蛋白。蛋白染色的復(fù)雜性可能會(huì)掩蓋任何補(bǔ)充的蛋白的存在，所述蛋白與經(jīng)免疫純化的蛋白一起遷移。為了識(shí)別補(bǔ)充的蛋白，在源自級(jí)分1和2的經(jīng)膠體藍(lán)染色的珠上進(jìn)行質(zhì)譜分析。此分析揭示幾乎全部Rel家族蛋白和IκBα的存在，包括NF-κB1(p105)、NF-κB2(p100)、Re1A(p65)、p50、p49、C-Re1、IκBα和IκBε。只有少數(shù)其他蛋白與IκB/NF-κB復(fù)合物共免疫沉淀，特別是GRP78/Bip、Hsp70和Hsc70。
為了避免可能造成對(duì)推定的pIκB-遍在蛋白連接酶的遮蔽，用35S生物合成性標(biāo)記的HeLa溶胞產(chǎn)物代替連接酶源，并通過(guò)SDS-PAGE分析和放射自顯影來(lái)跟蹤與IκBα結(jié)合的蛋白(圖7B)。相同地，測(cè)試不同級(jí)分的遍在蛋白-連接酶容量。將活性級(jí)分的帶模式(泳道2)與非活性級(jí)分的帶模式(泳道1)進(jìn)行比較。在泳道2中辨別了分子量為54、58、61和64kD的四個(gè)35S-蛋白帶。這些蛋白帶中的一些可代表直接識(shí)別pIκBα的遍在蛋白連接酶的成分，而其他的則可能與pIκBα間接相關(guān)或者與IKK磷酰化復(fù)合物的另一成分相關(guān)。為了挑選出直接識(shí)別pIκBα的連接酶成分，將pp12或?qū)φ针膒12S/E加入放射標(biāo)記的HeLa溶胞產(chǎn)物，接著將該溶胞產(chǎn)物與免疫結(jié)合的IκBα/NF-κB復(fù)合物一起溫育。對(duì)洗脫級(jí)分的比較顯示，針對(duì)所述四個(gè)特殊帶的級(jí)分只存在于級(jí)分2中，三個(gè)帶被特異性pp12肽所消除(p54、p58和p61)，而只有64kD帶在pp12的存在下繼續(xù)存在(圖7B，比較泳道2和3)。對(duì)照肽不影響特殊蛋白中任一個(gè)與pIκBα的結(jié)合(泳道4)。p58和p54這兩個(gè)與pIκBα相互作用的蛋白是一貫存在的，它們總與特異性遍在蛋白-連接酶活性相關(guān)。實(shí)施例5鑒定人E3遍在蛋白連接酶本實(shí)施例說(shuō)明人E3遍在蛋白連接酶的分離和表征。
將前實(shí)施例所述的54和58kD帶從連接酶陽(yáng)性和連接酶陰性(HeLa溶胞產(chǎn)物與未磷?；腎κBα-復(fù)合物一起溫育)的泳道中切下，通過(guò)納電子噴射質(zhì)譜，對(duì)原位消化的蛋白(Shevchenko et al.，Anal.Chem.68850-858，1996)和由此得到的胰蛋白酶肽測(cè)序(Wilm et al.，Nature379466-469，1996)。正如所述，蛋白帶以凝膠態(tài)還原，S-烷化，并以凝膠態(tài)由過(guò)量胰蛋白酶消化(室溫過(guò)夜)(Shevchenko et al.，Anal.Chem.68850-858，1996；Wilm et al.，Nature 379466-469，1996)。提取凝膠片，將所得肽混合物濃縮并脫鹽，其中使用含有50nl Poros R2材料(Perceptive Biosystems，F(xiàn)ramingham，MA)的微柱。使用1μl 60％甲醇、5％甲酸，將肽直接洗脫到納電子噴射針中。在四級(jí)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(QqTOF，Perkin-Elmer Sciex，Toronto，Canada)上記錄納電子噴射圖譜。從碎片譜中裝配出肽序列標(biāo)志(Mann and Wilm，Anal.Chem.664390-4399，1994)，并使用肽搜索程序(PeptideSearch，Mann and Wilm，Anal.Chem.664390-4399，1994)，在歐洲生物信息研究所(EBI，HinxtonPark，England)維護(hù)的非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)(nrdb)中搜索該序列標(biāo)志。
54kD凝膠帶的質(zhì)譜揭示出一個(gè)復(fù)雜的肽混合物(圖8A)，從該混合物中選擇一些肽用于碎裂。通過(guò)肽序列標(biāo)志搜索(Mann and Wilm，Anal.Chem 664390-4399，1994)鑒定的蛋白包括NF-κBl(p50)、IκB激酶α、IκBε、RelB、微管蛋白β-1鏈和甲狀腺受體起始子結(jié)合蛋白。為了鑒定與E3活性相關(guān)的蛋白，選擇少量存在的附加肽用于通過(guò)比較來(lái)自活性級(jí)分和來(lái)自非活性級(jí)分的54kD帶的譜來(lái)進(jìn)行測(cè)序(圖8B)。肽序列標(biāo)志(1587.81)VVNV(SEQ ID NO23)(1999.09)由圖8C所示的碎片譜導(dǎo)出，并被明確地鑒定為AAVNVVDFDDKYIVSAS(SEQ ID NO24)。其他譜鑒定了肽LEGHEELVR(SEQ ID NO25)、LVVSGSSDNTIR(SEQ ID NO26)、IQDIETIESNWR(SEQ ID NO27)和VISEGMLWK(SEQ ID NO28)。最初的四個(gè)片段具有人F盒/WD蛋白β-TrCP中的序列(Margottin et al.Mol.Cell 1565-574，1998)。然而，第五個(gè)肽(VISEGMLWK(SEQ ID NO28))與來(lái)自果蠅Slimb蛋白的肽(參見(jiàn)Jiang and Struhl，Nature 391493-496，1998)相符，其與人β-TrCP高度同源。進(jìn)一步的測(cè)序鑒定了圖9提供的人E3遍在蛋白連接酶的核酸序列(SEQ ID NO15)，預(yù)計(jì)的蛋白序列(SEQ ID NO16)示于圖10。因此，人E3遍在蛋白連接酶看起來(lái)是同源蛋白β-TrCP/Slimb家族的一個(gè)新成員。實(shí)施例6進(jìn)一步表征E3遍在蛋白連接酶活性本實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明人E3遍在蛋白連接酶家族成員β-TrCP和Slimb的遍在蛋白連接酶活性。
在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中檢測(cè)這些蛋白特異性結(jié)合pIκBα和輔助其遍在蛋白化的能力。IκBα/NF-κB復(fù)合物從HeLa細(xì)胞中免疫提純，如上所述，免疫復(fù)合物用IKK2-EE磷酰化或模擬磷?；?。它接著與下列已固定的以FLAG示蹤的E3家族成員一起溫育，所述成員從轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中免疫沉淀，包括小鼠β-TrCP(mβ-TrCP)、人β-TrCP(hβ-TrCP)、缺失了F盒區(qū)域殘基122-168的人β-TrCP(Δβ-TrCP)和果蠅Slimb蛋白。使用抗IκBα和抗FLAG的抗體，通過(guò)Western印跡來(lái)分析結(jié)合的物質(zhì)。所有這些蛋白只結(jié)合IKK磷?；腎κBα，而不結(jié)合模擬磷?；腎κBα(參見(jiàn)圖11A)。然而，人和鼠β-TrCP結(jié)合IκBα的能力比高度同源的果蠅蛋白好得多(比較泳道2、4、6和8)。Δβ-TrCP結(jié)合IκBα的能力甚至比野生型蛋白好，這表明F盒區(qū)域?qū)τ诮Y(jié)合不是必需的。此外，β-TrCP的結(jié)合可被代表pIκBα識(shí)別基元的肽(pp10；DRHDS(PO3)GLDS(PO3)M，(SEQ ID NO29))所廢止(參見(jiàn)圖11B，泳道3)；而不被對(duì)照肽廢止(泳道4)，進(jìn)而指明了保守DS(PO3)GLDS(PO3)(SEQ ID NO30)序列的pIκBα識(shí)別位點(diǎn)。
為了評(píng)價(jià)結(jié)合對(duì)遍在蛋白化的影響，在pIκBα遍在蛋白化中，使用E3家族成員和所述缺失突變體作為E3活性的來(lái)源。在E1和E2(UBC5C)的存在下，野生型β-TrCP蛋白促進(jìn)pIκBα的遍在蛋白化，而不促進(jìn)未磷酰化的IκBα的遍在蛋白化(參見(jiàn)圖11C，泳道1-4)。Δβ-TrCP缺乏F盒蛋白-蛋白相互作用組件，盡管它具有結(jié)合能力(圖11A，泳道6)，但它不能促進(jìn)遍在蛋白化(泳道7和8)。盡管Slimb促進(jìn)一些pIκBα的遍在蛋白化，但其效力至少比人和鼠β-TrCP低10倍(基于相似的FLAG-標(biāo)志表達(dá)水平)，這與其較弱的活性相對(duì)應(yīng)。
這些家族成員的模塊設(shè)計(jì)和本文所述的體外分析間接表明，F(xiàn)盒的缺失將形成在體內(nèi)起顯性陰性分子作用的蛋白。事實(shí)上，在受激Jurkat細(xì)胞中，Δβ-TrCP的瞬時(shí)過(guò)度表達(dá)抑制了內(nèi)源性IκBα的降解，從而導(dǎo)致pIκBα的積聚(圖12A)。隨后，NF-κB的活化受到抑制(圖12B)。由于Δβ-TrCP不影響NF-AT受體的活化，所以NF-κB的活化是特異性的。應(yīng)注意這樣一個(gè)事實(shí)，即在使用野生型Slimb時(shí)也觀察到NF-κB受到抑制，而野生型人β-TrCP的表達(dá)不產(chǎn)生抑制作用(圖12B)。因此，野生型Slimb的過(guò)度表達(dá)對(duì)于NF-κB活化具有顯性陰性影響，這可能與其相對(duì)弱的pIκBα遍在蛋白化活性有關(guān)(圖11B)。
基于前面的敘述，可以理解的是，盡管為舉例說(shuō)明而在本文描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但仍可進(jìn)行改進(jìn)而同時(shí)不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。
序列表概要SEQ ID NO1是IκBα的氨基酸序列SEQ ID NO2是IκBα的DNA序列SEQ ID NO3是IκBβ的氨基酸序列SEQ ID NO4是IκBβ的DNA序列SEQ ID NO5是pp7的氨基酸序列SEQ ID NO6是pp11的氨基酸序列SEQ ID NO7是pp15的氨基酸序列SEQ ID NO8是pp19的氨基酸序列SEQ ID NO9是pp21的氨基酸序列SEQ ID NO10是磷酸-Fos肽的氨基酸序列SEQ ID NO11是pp21 S/A的氨基酸序列SEQ ID NO12是以HA示蹤的IκBα的氨基酸序列SEQ ID NO13是以HA示蹤的S32、36IκBα的氨基酸序列SEQ ID NO14是以HA示蹤的IκBβ的氨基酸序列SEQ ID NO15是人E3遍在蛋白連接酶的DNA序列SEQ ID NO16是預(yù)測(cè)的人E3遍在蛋白連接酶的氨基酸序列SEQ ID NO17是人β-TrCP的DNA序列SEQ ID NO18是人E3β-TrCP的氨基酸序列
SEQ ID NO19是IκBα的磷酰化位點(diǎn)SEQ ID NO20是檢索到的β-TrCP序列SEQ ID NO21是同源p64肽的氨基酸序列SEQ ID NO22是pIκBα肽pp12的氨基酸序列SEQ ID NO23是人E3遍在蛋白連接酶的肽序列標(biāo)志SEQ ID NO24是來(lái)自人E3遍在蛋白連接酶的肽SEQ ID NO25是來(lái)自人E3遍在蛋白連接酶的肽SEQ ID NO26是來(lái)自人E3遍在蛋白連接酶的肽SEQ ID NO27是來(lái)自人E3遍在蛋白連接酶的肽SEQ ID NO28是來(lái)自人E3遍在蛋白連接酶的肽SEQ ID NO29是pIκBα識(shí)別基元的氨基酸序列SEQ ID NO30是保守的pIκBα序列序列表<110>信號(hào)藥物公司耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)伊薩姆研究發(fā)展公司<120>調(diào)節(jié)NF-κB活化的化合物和方法<130>860098.427PC<140>PCT<141>1999-12-09<160>30<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>317<212>PRI<213>智人<400>1Met Phe Gln Ala Ala Glu Arg Pro Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro1 5 10 15Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser20 25 30Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu35 40 45Leu Gln Glu Ile Arg Leu Glu Pro Gln Glu Val Pro Arg Gly Ser Glu50 55 60Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu65 70 75 80Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Ile Arg Gln85 90 95Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln100 105 110Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Glu Ile Ala Glu115 120 125Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly130 135 140Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val145 150 155 160Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu His Ser Ile Leu
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cgcctcgagc cgcaggaggt gccgcgcggc tcggagccct ggaagcagca 300gctcaccgag gacggggact cgttcctgca cttggccatc atccatgaag aaaaggcact 360gaccatggaa gtgatccgcc aggtgaaggg agacctggct ttcctcaact tccagaacaa 420cctgcagcag actccactcc acttggctgt gatcaccaac cagccagaaa ttgctgaggc 480acttctggga gctggctgtg atcctgagct ccgagacttt cgaggaaata cccccctaca 540ccttgcctgt gagcagggct gcctggccag cgtgggagtc ctgactcagt cctgcaccac 600cccgcacctc cactccatcc tgaaggctac caactacaat ggccacacgt gtctacactt 660agcctctatc catggctacc tgggcatcgt ggagcttttg gtgtccttgg gtgctgatgt 720caatgctcag gagccctgta atggccggac tgcccttcac ctcgcagtgg acctgcaaaa 780tcctgacctg gtgtcactcc tgttgaagtg tggggctgat gtcaacagag ttacctacca 840gggctattct ccctaccagc tcacctgggg ccgcccaagc acccggatac agcagcagct 900gggccagctg acactagaaa accttcagat gctgccagag agtgaggatg aggagagcta 960tgacacagag tcagagttca cggagttcac agaggacgag ctgccctatg atgactgtgt 1020gtttggaggc cagcgtctga cgttatgagt gcaaaggggc tgaaagaaca tggacttgta 1080tatttgtaca aaaaaaaagt tttatttttc taaaaaaaga 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Leu Gly Glu Ala Ser Thr Val Glu Lys100 105 110Leu Tyr Ala Ala Gly Ala Gly Val Leu Val Ala Glu Arg Gly Gly His115 120 125Thr Ala Leu His Leu Ala Cys Arg Val Arg Ala His Thr Cys Ala Cys130 135 140Val Leu Leu Gln Pro Arg Pro Ser His Pro Arg Asp Ala Ser Asp Thr145150 155160Tyr Leu Thr Gln Ser Gln Asp Cys Thr Pro Asp Thr Ser His Ala Pro165 170 175Ala Ala Val Asp Ser Gln Pro Asn Pro Glu Asn Glu Glu Glu Pro Arg180 185 190Asp Glu Asp Trp Arg Leu Gln Leu Glu Ala Glu Asn Tyr Asp Gly His195 200 205Thr Pro Leu His Val Ala Val Ile His Lys Asp Ala Glu Met Val Arg210 215 220Leu Leu Arg Asp Ala Gly Ala Asp Leu Asn Lys Pro Glu Pro Thr Cys225 230 235 240Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Val Glu Ala Gln Ala Ala Ser Val245 250 255Leu Glu Leu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Pro Thr Ala Arg Met Tyr260 265 270Gly Gly Arg Thr Pro Leu Gly Ser Ala Leu Leu Arg Pro Asn Pro Ile275 280 285Leu Ala Arg Leu Leu Arg Ala His Gly Ala Pro Glu Pro Glu Asp Glu290 295 300Asp Asp Lys Leu Ser Pro Cys Ser Ser Ser Gly Ser Asp Ser Asp 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Asp Val Asn Thr325 330 335Gly Glu Met Leu Asn Thr Leu Ile His His Cys Glu Ala Val Leu His340 345 350Leu Arg Phe Asn Asn Gly Met Met Val Thr Cys Ser Lys Asp Arg Ser355 360 365Ile Ala Val Trp Asp Met Ala Ser Pro Thr Asp Ile Thr Leu Arg Arg370 375 380Val Leu Val Gly His Arg Ala Ala Val Asn Val Val Asp Phe Asp Asp385 390 395 400Lys Tyr Ile Val Ser Ala Ser Gly Asp Arg Thr Ile Lys Val Trp Asn405 410 415Thr Ser Thr Cys Glu Phe Val Arg Thr Leu Asn Gly His Lys Arg Gly420 425 430Ile Ala Cys Leu Gln Tyr Arg Asp Arg Leu Val Val Ser Gly Ser Ser435 440 445Asp Asn Thr Ile Arg Leu Trp Asp Ile Glu Cys Gly Ala Cys Leu Arg450 455 460Val Leu Glu Gly His Glu Glu Leu Val Arg Cys Ile Arg Phe Asp Asn465 470 475 480Lys Arg Ile Val Ser Gly Ala Tyr Asp Gly Lys Ile Lys Val Trp Asp485 490 495Leu Val Ala Ala Leu Asp Pro Arg Ala Pro Ala Gly Thr Leu Cys Leu500 505 510Arg Thr Leu Val Glu His Ser Gly Arg Val Phe Arg Leu Gln Phe Asp515 520 525Glu Phe Gln Ile Val Ser Ser Ser His Asp Asp Thr Ile Leu Ile Trp530 535 540Asp Phe Leu Asn Asp Pro Ala Ala Gln Ala Glu Pro Pro Arg Ser Pro545 550 555 560Ser Arg Thr Tyr Thr Tyr Ile Ser Arg565<210>19<211>6<212>PRT<2l3>智人<400>l9Asp Ser Gly Leu Asp Ser1 5<210>20<211>20<212>PRT<213>智人<400>20Ala Ala Val Asn Val Val Asp phe Asp Asp Lys Tyr Ile Val Ser Ala1 5 10 15Ser Gly Asp Arg20<210>21<211>17<212>PRT<213>智人<400>21Glu Leu Phe Pro Leu Ile Phe Pro Ala Glu Pro Ala Gln Ala Ser Gly1 5 10 15Pro<210>22<211>10<212>PRT<213>智人<220><221>MOD RES<222>(6)<223>磷?；?amp;lt;220><221>MOD RES<222>(10)<223>磷酰化<400>22Cys Asp Arg His Asp Ser Gly Leu Asp Ser1 5 10<210>23<211>4<212>PRT<213>智人<400>23Val Val Asn Val1<210>24<211>17<212>PRT<213>智人<400>24Ala Ala Val Asn Val Val Asp Phe Asp Asp Lys Tyr Ile Val Ser Ala1 5 10 15Ser<210>25<211>9<212>PRT<213>智人<400>25Leu Glu Gly His Glu Glu Leu Val Arg1 5<210>26<211>12<212>PRT<213>智人<400>26Leu Val Val Ser Gly Ser Ser Asp Asn Thr Ile Arg1 5 10<210>27<211>12<212>PRT<213>智人<400>27Ile Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg1 5 10<210>28<211>9<212>PRT<213>智人<400>28Val Ile Ser Glu Gly Met Leu Trp Lys1 5<210>29<211>10<212>PRT<213>智人<220><221>MOD RES<222>(5)<223>磷?；?amp;lt;220><221>MOD RES<222>(9)<223>磷?；?amp;lt;400>29Asp Arg His Asp Ser Gly Leu Asp Ser Met1 5 10<210>30<211>6<212>PRT<213>智人<220><221>MOD RES<222>(2)<223>磷?；?amp;lt;220><221>MOD RES<222>(6)<223>磷?；?amp;lt;400>30Asp Ser Gly Leu Asp Ser1 權(quán)利要求
1.具有SEQ ID NO16所示序列的分離的多肽或其變體，該變體的區(qū)別在于在不超過(guò)20％的SEQ ID NO16中的氨基酸殘基上發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或替換，以致多肽增強(qiáng)磷?；腎κB的遍在蛋白化作用。
2.包括SEQ ID NO16所示的人E3遍在蛋白連接酶的一部分的分離的多肽或其變體，其中所述部分與磷?；腎κB結(jié)合并抑制磷?；疘κB的遍在蛋白化作用。
3.分離的編碼權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸，其中該多核苷酸不編碼全長(zhǎng)人E3遍在蛋白連接酶。
4.分離的編碼權(quán)利要求2所述多肽的多核苷酸。
5.包含至少10個(gè)連續(xù)的與權(quán)利要求3所述多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸的反義核苷酸。
6.包含權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述多核苷酸的表達(dá)載體。
7.用權(quán)利要求6所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
8.藥物組合物，包含(a)人E3遍在蛋白連接酶多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO16所示的序列或其一部分或其變體，該變體的區(qū)別在于在不超過(guò)20％的SEQ ID NO16中的氨基酸殘基上發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或替換，以致多肽增強(qiáng)磷?；腎κB的遍在蛋白化作用；和(b)生理上可接受的載體。
9.藥物組合物，包含(a)人E3遍在蛋白連接酶多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO16所示序列的一部分或其變體，該變體的區(qū)別在于一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、插入、缺失或添加，以致多肽與磷酰化的IκB結(jié)合并抑制磷?；疘κB的遍在蛋白化作用；和(b)生理上可接受的載體。
10.藥物組合物，包含(a)編碼人E3遍在蛋白連接酶多肽的多核苷酸，其中所述多肽包括SEQ ID NO16所示的序列或其一部分或其變體，該變體的區(qū)別在于在不超過(guò)20％的SEQ ID NO16中的氨基酸殘基上發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入、添加或替換，以致多肽增強(qiáng)磷?；腎κB的遍在蛋白化作用；和(b)生理上可接受的載體。
11.藥物組合物，包含(a)編碼人E3遍在蛋白連接酶多肽的多核苷酸，其中所述多肽包括SEQ ID NO16所示序列的一部分或其變體，該變體的區(qū)別在于一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、插入、缺失或添加，以致多肽與磷?；腎κB結(jié)合并抑制磷酰化IκB的遍在蛋白化作用；和(b)生理上可接受的載體。
12.藥物組合物，包含(a)權(quán)利要求5所述的反義多核苷酸；和(b)生理上可接受的載體。
13.分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與SEQ ID NO16所示的人E3遍在蛋白連接酶序列相結(jié)合。
14.權(quán)利要求13所述的抗體或其片段，其中抗體是單克隆抗體。
15.包含權(quán)利要求13所述的抗體或其片段以及生理上可接受的載體的藥物組合物。
16.權(quán)利要求8-12或15中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，在藥品制造中的應(yīng)用，其中所述藥品用于調(diào)節(jié)患者的NF-κB的活性。
17.權(quán)利要求8-12或15中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，在藥品制造中的應(yīng)用，其中所述藥品用于治療患有與NF-κB活化相關(guān)的疾病的患者。
18.權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述疾病選自炎癥、自身免疫性疾病、癌癥和病毒感染。
19.調(diào)節(jié)NF-κB活性的物質(zhì)的篩選方法，包括以下步驟(a)使候選物質(zhì)與人E3遍在蛋白連接酶多肽接觸，其中所述多肽包含SEQ ID NO16所示序列或者其部分或其變體，所述變體的區(qū)別在于一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、插入、缺失或添加，以致多肽增強(qiáng)磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用，候選物質(zhì)與人E3遍在蛋白連接酶多肽接觸的條件和時(shí)間足以使多肽和候選物質(zhì)相互作用；和(b)隨后相對(duì)于預(yù)先確定的在不存在候選物質(zhì)時(shí)多肽增強(qiáng)磷?；疘κB的遍在蛋白化作用的能力，評(píng)價(jià)多肽增強(qiáng)磷?；疘κB的遍在蛋白化作用的能力；由此識(shí)別出調(diào)節(jié)NF-κB活性的物質(zhì)。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中候選物質(zhì)是存在于組合文庫(kù)中的小分子。
21.調(diào)節(jié)患者中NF-κB活性的方法，包括將包含β-TrCP蛋白(SEQID NO18)或者其部分或其變體的多肽給藥至患者，并因此調(diào)節(jié)患者中的NF-κB活性，所述變體的區(qū)別在于在不超過(guò)20％的SEQ ID NO18中的殘基上發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、缺失、添加或替換，以致多肽增強(qiáng)磷?；腎κB的遍在蛋白化作用。
22.在藥品制造中使用的治療有效量的多肽，該多肽包含β-TrCP蛋白(SEQ ID NO18)或者其部分或其變體，所述變體的區(qū)別在于在不超過(guò)20％的SEQ ID NO18中的殘基上發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、缺失、添加或替換，以致多肽增強(qiáng)磷?；腎κB的遍在蛋白化作用，其中所述藥品用于治療患有與NF-κB活化相關(guān)的疾病的患者。
23.權(quán)利要求22所述的多肽，其中所述病癥選自炎癥、自身免疫性疾病、癌癥和病毒感染。
24.調(diào)節(jié)NF-κB活性的物質(zhì)的篩選方法，包括以下步驟(a)使候選物質(zhì)與包含β-TrCP蛋白(SEQ ID NO18)或者其部分或其變體的多肽接觸，所述變體的區(qū)別在于在不超過(guò)20％的SEQ IDNO18中的殘基上發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、缺失、添加或替換，以致多肽增強(qiáng)磷?；腎κB的遍在蛋白化作用，候選物質(zhì)與多肽接觸的條件和時(shí)間足以使多肽和候選物質(zhì)相互作用；和(b)隨后相對(duì)于預(yù)先確定的在不存在候選物質(zhì)時(shí)多肽增強(qiáng)磷?；疘κB的遍在蛋白化作用的能力，評(píng)價(jià)多肽增強(qiáng)磷?；疘κB的遍在蛋白化作用的能力；由此識(shí)別出調(diào)節(jié)NF-κB活性的物質(zhì)。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中候選物質(zhì)是存在于組合文庫(kù)中的小分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)核因子κB(NF－κB)活化的組合物和方法。所述組合物包含一種或多種調(diào)節(jié)磷?；疘κBα和/或IκBβ的遍在蛋白化的物質(zhì)。這些組合物可用于治療與NF－κB活化相關(guān)的疾病。調(diào)節(jié)劑包括人E3遍在蛋白連接酶、其抗體及其變體以及相關(guān)蛋白。
文檔編號(hào)A61K38/53GK1346406SQ99814307
公開(kāi)日2002年4月24日 申請(qǐng)日期1999年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月10日
發(fā)明者安東尼·M·曼寧, 弗蘭克·默丘里奧, 沙倫·阿米特, 伊農(nóng)·本-內(nèi)里艾, 馬蒂·戴維斯, 埃達(dá)·哈楚拜, 艾里斯·拉萬(wàn), 亞伯拉罕·亞龍 申請(qǐng)人:信號(hào)藥物公司, 耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)伊薩姆研究發(fā)展公司