用于靜脈采集和自體移植的改進(jìn)的方法和組合物的制作方法【專利說明】[0001]本申請是申請?zhí)枮?01080055389.X、發(fā)明名稱為"用于靜脈采集和自體移植的改進(jìn)的方法和組合物"的申請的分案申請，該母案申請是2010年12月8日提交的PCT申請PCT/US2010/059459進(jìn)入中國國家階段的申請。[0002]相關(guān)申請的交叉引用[0003]本申請要求2010年12月8日提交的序列號為No.61/267,640的美國臨時(shí)申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用合并到本文中。
技術(shù)領(lǐng)域：
[0004]本發(fā)明一般地涉及如下領(lǐng)域：自體靜脈、靜脈移植、靜脈保存、組織保存、內(nèi)膜增生、血管痙攣、藥物、設(shè)備以及血管生物學(xué)。[0005]本發(fā)明在來自國立衛(wèi)生研宄院的資助No.2R01HL070715的政府支持下進(jìn)行。政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利?！?br>背景技術(shù)：
】[0006]人大隱靜脈（HSV)仍然是用于冠狀和外周動脈旁路移植的最常用管道。HSV通常用直接手術(shù)暴露或者內(nèi)窺鏡靜脈采集從腿采集。將分支結(jié)扎并且將靜脈取出，并在植入之前置于"后臺（backtable)"。多數(shù)外科醫(yī)生將HSV在室溫下置于肝素化鹽溶液中。在遠(yuǎn)端對靜脈進(jìn)行插管并且用肝素化鹽溶液人工擴(kuò)張（用注射器）。這允許對在采集過程中遺漏的分支進(jìn)行鑒別和結(jié)扎。這種人工擴(kuò)張引起靜脈損傷。靜脈還可用外科皮膚標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，從而在植入期間優(yōu)化其取向。[0007]在全世界每年進(jìn)行的超過1百萬例冠狀旁路手術(shù)中，10%至15%的冠狀靜脈移植物發(fā)生早期血栓性阻塞；還有10%至15%在之后的1年至5年由于內(nèi)膜增生而發(fā)生阻塞，再有30%至40%在隨后的5年至7年中由于內(nèi)膜增生與進(jìn)行性動脈粥樣硬化的疊加而發(fā)生阻塞。12年后少于一半的靜脈移植物仍有效（Motwani&Topol，1998)。靜脈移植物阻塞引起心肌梗塞、肢體喪失以及死亡。[0008]動脈旁路移植失敗的首要原因是內(nèi)膜增生（Clowes&Reidy，1991)。盡管血管介入近來有許多技術(shù)發(fā)展，但是內(nèi)膜增生仍然是昂貴的、與疾病相關(guān)的并且未解決的問題。內(nèi)膜增生由一連串事件介導(dǎo)，包括血管平滑肌增殖、迀移、表型轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生(Allaire&Clowes，1997;Mosse等人，1985)。該過程引起血管腔的病理性變窄、移植物狹窄，并最終引起移植物衰竭（LoGerfo等人，1983)。[0009]測試其抑制內(nèi)膜增生之能力的許多藥物在臨床試驗(yàn)中都失敗了。抗血栓劑和抗血小板劑（如華法林（warfarin)、氯吡格雷（clopidogrel)和阿司匹林（aspirin))對內(nèi)膜增生沒有或幾乎沒有作用（Kent&Liu，2004)。藥物洗出式支架在預(yù)防冠狀動脈血管成形術(shù)之后的再狹窄中已表現(xiàn)出有效；但是，還沒有治療被批準(zhǔn)用于自體管道。使用E2F誘餌（與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而隔離這些蛋白質(zhì)的DNA短序列）預(yù)防平滑肌增殖的以預(yù)防冠狀和外周血管靜脈移植物衰竭的兩個(gè)大型臨床試驗(yàn)的最初目的失敗了。來自這些大型臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)指出，簡單地限制增殖應(yīng)答不足以預(yù)防內(nèi)膜增生（Mann等人，1999;Alexander等人，2005)。因此，對于成功預(yù)防靜脈移植的失敗而言，需要靶向的是增殖以外的其他機(jī)制。[0010]采集期間對靜脈移植物的損傷引起血管痙攣和內(nèi)膜增生，其導(dǎo)致移植物阻塞。因此，鑒定出防止在采集期間對移植物的損傷以及后續(xù)內(nèi)膜增生的新的外科方法和治療劑將是非常有益的。【
發(fā)明內(nèi)容】[0011]因此，根據(jù)本發(fā)明，提供在移植之前處理靜脈外植體的方法，其包括（a)提供靜脈外植體；(b)將所述靜脈外植體在包含P2X7受體拮抗劑的pH7.0至pH7.6的緩沖溶液中進(jìn)行穩(wěn)定化，以產(chǎn)生穩(wěn)定化靜脈外植體；以及（c)保持所述穩(wěn)定化靜脈外植體的功能活力。所述方法還可恢復(fù)在步驟（b)之前無活力的靜脈外植體的功能活力。本文將平滑肌的功能活力（functionalviability)定義為應(yīng)答于去極化或激動劑而收縮的能力。對內(nèi)皮細(xì)胞而言，活力定義為預(yù)收縮的血管應(yīng)答于乙酰膽堿而舒張的能力。另外，所述緩沖溶液可進(jìn)一步包含肝素。所述？2乂7受體詰抗劑可以是羊毛罌紅/藍(lán)染料#1(61'；[0〖13110；[116/131116076#1)或亮藍(lán)G(brilliantblueG)，或者它們的組合。所述緩沖溶液還可進(jìn)一步包含磷酸鹽緩沖液、MOPS、Hepes、Pipes、醋酸鹽或勃脈力（Plasmalyte)。所述pH可以是7.35至7.45,或者7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6。[0012]另外，所述緩沖溶液可進(jìn)一步包含硫酸鎂或漢克斯（Hanks'）平衡鹽溶液。[0013]另外，所述緩沖溶液可進(jìn)一步包含以下一種或更多種：抗收縮劑、抗氧化劑、寡糖、膠體劑（colloidagent)、抗炎劑、內(nèi)皮功能保存劑（endothelialfunctionpreservative)、代謝調(diào)節(jié)劑、水凝膠、熱休克蛋白27(HSP27)抑制劑、HSP20調(diào)節(jié)劑和/或MPKAP激酶2抑制劑。[0014]進(jìn)一步，所述抗收縮劑可以是以下至少一種：磷酸二酯酶抑制劑（例如，罌粟堿（papaverine)、西地那非（sildenafil)、他達(dá)拉非（tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、烏地那非（udenafil)、阿伐那非西絡(luò)他挫（avanafilcilistizol)、己酮可可堿（pentoxifylline)、雙喃達(dá)莫（dipyridamole)，或其組合）、1?通道阻斷劑(例如，氨氯地平（amlodipine)、阿雷地平（aranidipine)、阿折地平（azelnidipine)、巴尼地平（barnidipine)、西尼地平（cilnidipine)、氯維地平（clevidipine)、依福地平（efonidipine)、非洛地平（felodipine)、拉西地平（Iacidipine)、樂卡地平（Iercanidipine)、馬尼地平（mandipine)、尼卡地平（nicardipine)、硝苯地平（nifedipine)、尼伐地平（nilvadipine)、尼莫地平（nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平（netrendipine)、普拉地平（prandipine)，或其組合）、一氧化氮供體（例如，硝普鈉（sodiumnitroprusside)、硝酸甘油（nitroglycerin)，或其組合）或者環(huán)核苷酸類似物（雙丁酰cAMP(dibutyrylcAMP)、雙丁酰cGMP(dibutyrylcGMP)或其組合），或其組合。[0015]進(jìn)一步，所述抗氧化劑可以是例如N-乙酰半胱氨酸、別嘌呤醇、谷胱甘肽、甘露醇、抗壞血酸、生育酚、生育三烯酚（tocotrienol)或綠茶酚或其組合。[0016]進(jìn)一步，所述寡糖可以是例如乳糖酸（lactobionicacid)、棉子糖或海藻糖或其組合。[0017]進(jìn)一步，所述膠體劑可以是例如羥乙基淀粉、葡聚糖、血液或白蛋白或其組合。[0018]進(jìn)一步，所述抗炎劑可以是例如皮質(zhì)甾類（例如，地塞米松（dexamethasone)、氫化可的松（hydrocortisone)、可的松（cortisone)、潑尼松（prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)、甲潑尼龍（methylprednisolone)或其組合）或者非甾類抗炎劑（例如，阿司匹林、布洛芬（ibuprophen)、萘普生水楊酸（naproxensalicylicacid)或其組合）、MAPKAP激酶2抑制劑、抗-TNF-a、抗-IL-I-0、Cox-2抑制劑，或其組合。[0019]另外，所述內(nèi)皮功能保存劑可以是例如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（例如，依那普利（enalapril)、雷米普利（ramipril)、喹那普利（quinapril)、培噪普利（perindopril)、賴諾普利（Iisinopril)、內(nèi)那普利（benazepril)、福辛普利（monopril)或其組合）、血管緊張素受體抑制劑（例如氯沙坦（Iosartan))、抑制素（statin)(例如阿托伐他?。╝torvastatin)、西立伐他?。╟erivastatin)、氟伐他?。╢Iuvastatin)、洛伐他?。↖ovastatin)、美伐他?。╩evastatin)、匹伐他?。╬itavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、羅素伐他汀（rosuvastatin)、辛伐他?。╯imvastatin)或其組合）、二甲雙狐（metformin)、氨基咪挫氨甲酰核糖核苷酸（aminoimidazolecarboxamideribonucleotide，AICAR)或雌激素（例如，雌三醇（estriol)、雌二醇（estradiol)、雌酮(estrone)、170-雌二醇或其組合）。[0020]另外，所述代謝調(diào)節(jié)劑可以是例如葡萄糖、腺苷胰淀素（adenosineamylin)、降隹$素相關(guān)基因肽（calcitoninrelatedgenepeptide)、胰島素，或其組合。[0021]另外，所述水凝膠可包括例如天然多糖如藻酸鹽（alginate)、葡聚糖、殼聚糖和糖胺聚糖；或親水性聚合物如聚乙二醇、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚羥基丁酸或聚（n-異丙基丙烯酰胺）。[0022]進(jìn)一步，所述HSP27抑制劑可以是例如抑制HSP27表達(dá)的siRNA或miRNA，增強(qiáng)HSP20表達(dá)的抗-miRNA，或其組合。[0023]另外，所述MPKAP激酶2抑制劑可以是例如肽抑制劑。[0024]所述外植體可用不基于醇的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，例如但不限于羊毛罌紅/藍(lán)染料#1、靛藍(lán)（indigotine)、誘惑紅AC(AlluraRedAC)或亮藍(lán)G0[0025]所述方法可進(jìn)一步包括沖洗所述靜脈外植體的管腔以使內(nèi)部沖洗壓不超過200mmHg，或不超過150mmHg0[0026]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供靜脈移植試劑盒，其包含（a)含有P2X7受體拮抗劑的組織標(biāo)記筆；以及（b)生理緩沖溶液或用于制備它的試劑。另外，所述試劑盒可進(jìn)一步包含適于浸浴靜脈外植體的容器。另外，所述試劑盒可進(jìn)一步包含以下中的一種或更多種：肝素、抗收縮劑、抗氧化劑、寡糖、膠體劑、抗炎劑、內(nèi)皮功能保存劑、代謝調(diào)節(jié)劑、水凝膠、熱休克蛋白抑制劑、硫酸鎂和/或MAPKAP激酶2抑制劑。[0027]所述緩沖溶液可包含例如磷酸鹽緩沖液、M0PS、H印es、Pipes、醋酸鹽或勃脈力。所述緩沖溶液可以是PH7.0至pH7.6,或者pH7.35至pH7.45。所述P2X7受體拮抗劑可以包含例如羊毛罌紅/藍(lán)染料#1、誘惑紅AC、亮藍(lán)G，或其任何組合。[0028]所述試劑盒可進(jìn)一步包含用于沖洗所述靜脈外植體的管腔的設(shè)備；所述設(shè)備設(shè)計(jì)成防止所述靜脈外植體內(nèi)部的沖洗壓大于200mmHg，或大于150mmHg。所述設(shè)備可包含注射器和/或?qū)Ч芎蛪毫Π踩y（pop-offvalve)。另外，所述注射器或?qū)Ч芸砂訌棤罴舛?，所述子彈狀尖端包含用于引入所述靜脈外植體近端的管腔。另外，所述試劑盒還進(jìn)一步包含設(shè)計(jì)成把持所述靜脈外植體的夾具。[0029]本發(fā)明還提供用于沖洗所述靜脈外植體管腔的設(shè)備；所述設(shè)備設(shè)計(jì)成防止所述靜脈外植體內(nèi)部的沖洗壓大于200mmHg，或大于150mmHg。所述設(shè)備可包含注射器和/或?qū)Ч芎蛪毫Π踩y。所述注射器或?qū)Ч芸砂訌棤罴舛耍鲎訌棤罴舛税糜谝胨鲮o脈外植體遠(yuǎn)端的管腔。此外，所述設(shè)備還可包含用于引入所述靜脈外植體近端的無管腔的子彈狀塞。另外，所述設(shè)備還可包含設(shè)計(jì)成把持所述靜脈外植體的夾具。[0030]另一個(gè)實(shí)施方案包含pH7.0至pH7.6的緩沖溶液，其中所述緩沖溶液進(jìn)一步包含肝素和P2X7受體拮抗劑。所述P2X7受體拮抗劑可以是例如羊毛罌紅/藍(lán)染料#1或亮藍(lán)G或其組合。另外，所述緩沖溶液可進(jìn)一步包含肝素，連同羊毛罌紅/藍(lán)染料#1、亮藍(lán)G中一種或更多種，或其兩者。進(jìn)一步，所述緩沖溶液可包含磷酸鹽緩沖液、MOPS、H印es、Pipes、醋酸鹽或勃脈力。進(jìn)一步，所述pH可以是7.35至7.45,或者7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6〇[0031]另外，所述緩沖溶液可進(jìn)一步包含硫酸鎂或漢克斯平衡鹽溶液。[0032]另外，所述緩沖溶液可進(jìn)一步包含以下一種或更多種：抗收縮劑、抗氧化劑、寡糖、膠體劑、抗炎劑、內(nèi)皮功能保存劑、代謝調(diào)節(jié)劑、水凝膠、熱休克蛋白27(HSP27)抑制劑、HSP20調(diào)節(jié)劑、MAPKAP激酶2抑制劑，和/或其組合。[0033]進(jìn)一步，所述抗收縮劑可以是磷酸二酯酶抑制劑（例如，罌粟堿、西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非、烏地那非、阿伐那非西絡(luò)他唑、己酮可可堿、雙嘧達(dá)莫，或其組合）、鈣通道阻斷劑（例如，氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、西尼地平、氯維地平、依福地平、非洛地平、拉西地平、樂卡地平、馬尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平）、一氧化氮供體（例如，硝普鈉、硝酸甘油，或其組合）或者環(huán)核苷酸類似物（例如，雙丁酰cAMP、雙丁酰cGMP，或其組合）。[0034]進(jìn)一步，所述抗氧化劑可以是例如N-乙酰半胱氨酸、別嘌呤醇、谷胱甘肽、甘露醇、抗壞血酸、生育酚、生育三烯酚或綠茶酚，或其組合。[0035]所述寡糖可以是例如當(dāng)前第1頁1 2 3 4 5 6