量。將環(huán)用IlOmMKCl(等摩爾替換碳酸 氫鹽緩沖液中的NaCl)收縮，并且測量產(chǎn)生的力。對KCl未收縮的任何組織認為是無活力 的。對于每個環(huán)將力轉(zhuǎn)化為應力IO5NAi2并且對于每個靜脈進行平均。為了評估細胞的活 力，將來自每個靜脈的3個環(huán)分別置于0? 25ml的0? 1%MTT溶液（用Dulbecco磷酸鹽緩 沖液PH7. 4制備）。對于陰性對照，在置于0. 1 %MTT溶液之前，將一個環(huán)置于20ml水中 并微波10分鐘以滅活任何酶活性。將環(huán)于37°C孵育1小時。將該環(huán)置于蒸餾水中來終止 反應。將組織稱重并在37°C下置于ImlCell0S0Ive(Sigma)中4小時以提取每個的甲臜 (formazan)色素。用分光光度計（BeckmanCoulter)在570nm下測量色素濃度。從每個樣 品中減去陰性對照的吸光度。活力指數(shù)表示為〇D57(l/mg/ml。對于3個環(huán)中計算每個靜脈的 平均值。然后用得自每個靜脈的平均應力對平均活力指數(shù)作圖。
[0113] 數(shù)據(jù)表現(xiàn)出顯著的傾斜，顯示線粒體活力與應力活力（通過IlOmMKCl誘導的收 縮來確定）之間有正比關系（R2= 〇? 7262)(圖8)。插圖中示出低（左）和高（右）活力 指數(shù)的代表性HSV環(huán)。
[0114] 實施例3_靜脈米集溶液和程序
[0115] 將新分離的豬隱靜脈收集于冷的移植物采集緩沖液（IOOmM乳糖酸鉀、25mM KH2P04、5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉， pH7. 4)。將血管在采集的24小時內(nèi)測試，并且在4°C貯存于移植物采集緩沖液中。將靜脈 剝離脂肪和結(jié)締組織并切成2cm長的區(qū)段。將區(qū)段拉伸至2倍于其靜止長度（拉伸的；n= 7)或者不操作（對照；n= 12)。拉伸后，將來自這兩組的區(qū)段進一步分開。然后用棉拭 子將羊毛罌紅溶液（FCF，5%異丙醇和水中2. 6mM)或賦形劑沿縱向線施加到未處理（FCF; n= 8)或拉伸（Stretched+FCF;n= 3)的靜脈區(qū)段。將區(qū)段在勃脈力中于室溫孵育15分 鐘并之后切成環(huán)。將環(huán)懸浮于包含碳酸氫鹽緩沖液（120mMNaCl、4. 7mMKC1、1.OmMMgS04、 LOmMNaH2PO4UOmM葡萄糖、I. 5mMCaCljP25mMNa2HCO3,pH7. 4)的肌肉槽中，在 37°C通 以95% 02/5%CO2。將環(huán)人工拉伸至4g張力，并以Ig的靜止張力維持并平衡~2小時。 使用與Powerlab數(shù)據(jù)米集系統(tǒng)和Chart軟件（ADInstruments，ColoradoSprings，CO) 接口的羅德諾提玻璃技術(shù)公司（Monrovia，CA)的力傳感器（159901A)獲得力測量。將環(huán) 用IlOmMKCl(等摩爾替換碳酸氫鹽緩沖液中的NaCl)收縮，然后將產(chǎn)生的力轉(zhuǎn)化為應力 IO5NAi2(圖9)。對照環(huán)具有（0? 47±0. 034)N/m2的平均應力，用羊毛罌紅染料標記的環(huán)具 有（0? 566±0. 064)N/m2的平均應力，拉伸的環(huán)具有（0? 367±0. 042)N/m2的平均應力，具有 羊毛罌紅染料的拉伸的環(huán)具有（0. 713±0.lll)N/m2的平均應力。拉伸靜脈的應力與對照 非拉伸靜脈顯著（*P< 〇. 05)不同，與沒有羊毛罌紅染料的拉伸相比，具有羊毛罌紅染料 的拉伸靜脈顯著（#P< 〇. 05)不同（圖9)。
[0116] 但是，在豬隱靜脈拉伸性損傷后，用另一染料（誘惑紅）處理沒有恢復功能活力 (圖10)，將豬隱靜脈（n= 4)不處理（對照）或拉伸至兩倍于其靜息長度（沒有染料），切 成環(huán)并懸浮于肌肉槽中的碳酸氫鹽緩沖液。來自拉伸部分的環(huán)與50yM誘惑紅（+紅）或 與50yM羊毛罌紅（+FCF)孵育30分鐘。然后使環(huán)于碳酸氫鹽緩沖液中平衡，之后用IlOmM KCl收縮。將產(chǎn)生的力轉(zhuǎn)化為應力（IO5NAi2)。數(shù)據(jù)代表相對于對照環(huán)應答（設置為100% ) 的收縮。拉伸靜脈的應力與具有誘惑紅的拉伸靜脈沒有顯著的不同（NS)。與具有誘惑紅的 拉伸靜脈相比，羊毛罌紅顯著地恢復了拉伸靜脈中的收縮應答（#P< 〇. 05)。
[0117] 使用來自進行冠狀動脈旁路術(shù)或外周血管旁路手術(shù)患者的人隱靜脈的無標記丟 棄區(qū)段來確定羊毛罌紅對人隱靜脈影響（n= 4)。將靜脈貯存于鹽溶液中直到外科手術(shù)結(jié) 束，這時將其置于冷的移植物采集緩沖液（IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2P04、5mMMgS04、30mM棉 子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7. 4)。在4°C下貯存于移 植物采集緩沖液中的血管在采集的24小時內(nèi)測試。為了測試活力，從剝離脂肪和結(jié)締組織 的隱靜脈上切下I.Omm寬的環(huán)，用羊毛罌紅溶液（FCF，5%異丙醇和水中2. 6mM)或賦形劑處 理并且在室溫下孵育30分鐘。之后將組織剝離內(nèi)皮并懸于包含碳酸氫鹽緩沖液的肌肉槽 中，在37°C下用95% 02/5 %CO2充氣。將環(huán)人工拉伸至4g的張力，以Ig的靜止張力維持并 平衡~2小時。使用與Powerlab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和Chart軟件（ADInstruments，Colorado Springs，CO)接口的羅德諾提玻璃技術(shù)公司（Monrovia，CA)的力傳感器（159901A)獲得力 測量。將環(huán)用IlOmMKCl(等摩爾替換碳酸氫鹽緩沖液中的NaCl)收縮，并且測量產(chǎn)生的力。 將力轉(zhuǎn)化為應力l〇5N/m2,并且對賦形劑和羊毛罌紅環(huán)作圖。顯示了未處理的（對照）或用 羊毛罌紅染料處理環(huán)的代表性追蹤（圖11A)。賦形劑環(huán)具有（0. 015±0. 012)N/m2的平均應 力，羊毛罌紅處理的環(huán)具有（〇? 103±0.021)N/m2的平均應力。這兩組顯著不同（p<0.05)。
[0118] 在采集后、外科操作之前從進行冠狀動脈旁路或外周血管旁路手術(shù)的患者收集人 隱靜脈區(qū)段并保存于勃脈力中。血管在采集的2小時內(nèi)測試。將新分離的豬隱靜脈收集于 冷的移植物采集緩沖液（IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2P04、5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、 3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7. 4)。將血管在采集的24小時內(nèi)測試。 從剝離脂肪和結(jié)締組織的豬隱靜脈（圖12A，n= 2)和未操作的人隱靜脈（圖12B，n= 4)上切下LOmm寬的環(huán)。之后將環(huán)剝離內(nèi)皮并懸浮于包含碳酸氫鹽緩沖液的肌肉槽中，于 37°C通以95% 02/5%CO2。將該環(huán)人工拉伸至4g張力，以及以獲得的Ig的靜止張力維持并 平衡~2小時。使用與Powerlab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和Chart軟件（ADInstruments，Colorado Springs，CO)接口的羅德諾提玻璃技術(shù)公司（Monrovia，CA)的力傳感器（159901A)獲得力 測量。將環(huán)用IlOmMKCl收縮。再平衡30分鐘的之后，將環(huán)用羊毛罌紅溶液（FCF，50yM 至200yM，30分鐘）或用賦形劑處理30分鐘，之后用100yMBzATP收縮。測量力并轉(zhuǎn)化 為應力。應答表示為最大KCl收縮的％。用賦形劑（對照）或50yM羊毛罌紅（FCF預處 理）預處理之后用BzATP收縮的人隱靜脈的代表性力跟蹤示于圖12C。用羊毛罌紅（FCF) 而不是賦形劑（對照）的預處理顯著地抑制了BzATP誘導的收縮（*p<0? 05)(圖12B)。
[0119] 在對靜脈進行移植到動脈循環(huán)的準備之前（未操作，UM)和在外科準備之后（操作 后，AM)，在勃脈力中從同一患者收集人隱靜脈區(qū)段，并在采集的2小時內(nèi)使用。將該區(qū)段切 成~Imm的環(huán)，將來自每一組的一個環(huán)在福爾馬林中固定（預培養(yǎng)）。在50yM羊毛罌紅存 在（FCF)或不存在（對照）的情況下，將其他環(huán)在補充有1%L-谷氨酰胺、1 %青霉素/鏈 霉素和30%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中在5%CO2下于37°C培養(yǎng)14天。14天后，將環(huán)以福 爾馬林固定，以5ym切片并用沃爾夫-馮吉爾森染劑（VerhoffVanGiesonstain)染色。 用Axiovert200捕獲該環(huán)的光學顯微圖并且用AxioVision測量內(nèi)膜厚度。數(shù)據(jù)代表內(nèi)膜 厚度與培養(yǎng)前環(huán)的基礎內(nèi)膜厚度（設置為〇%)的增加％。誤差線示出平均值的標準差。 與對照相比，靜脈準備期間的操作提高了內(nèi)膜層的增厚（在配對t檢驗中#p= 0. 053)，并 且羊毛罌紅處理顯著地（*p<. 05)抑制了內(nèi)膜厚度的發(fā)展（圖13)。
[0120] 在無菌條件下通過非觸碰法（notouchmethod)采集新鮮的豬隱靜脈并IC存于冷 的移植物采集緩沖液（IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2P04、5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM 谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7. 4)。血管在采集的24小時內(nèi)使用。將靜 脈分成三部分：未處理的（未操作，n= 7)，擴張至> 300mmHg的（擴張的，n= 8)，或在 壓力釋放閥存在的情況下擴張的（過壓釋放，n= 7)。然后將每個區(qū)段切成~Imm的環(huán)，并 將來自每種條件的一個環(huán)立即用福爾馬林固定（預培養(yǎng)）。其他的環(huán)在5% 0)2和37°〇下， 在不存在（對照）或存在50yM羊毛罌紅（FCF)、50M亮藍G(BBG)或50yM誘惑紅的情況 下于補充1%L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素和30%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天。 14天后，將環(huán)用福爾馬林固定，以5ym切片并用沃爾夫-馮吉爾森染劑染色。用Axiovert 200捕獲環(huán)的光學顯微圖并且用AxioVision測量內(nèi)膜厚度。與擴張對照相比，羊毛罌紅處 理抑制了擴張誘導的內(nèi)膜增厚的增強，誘惑紅則不然（*P< . 05)(圖14)。
[0121] 在對靜脈進行移植到動脈循環(huán)的準備之前（未操作，UM;n= 5)和外科準備之后 (操作后，AM;n= 5)獲得人左乳內(nèi)動脈（LIMA;n= 3)和隱靜脈的環(huán)。將切自UM區(qū)段的環(huán) 在威斯康星大學溶液（UniversityofWisconsinSolution) (UM)、肝素化鹽溶液（HS)、肝 素化勃脈力（HP)或包含30mM海藻糖的肝素化勃脈力（HPT)中于室溫孵育2小時。環(huán)切自 靜脈、懸于肌肉槽中并在碳酸氫鹽緩沖液中平衡。將環(huán)用KT6M去氧腎上腺素預收縮，之后 用5XKT7M卡巴膽堿（carbachol)以測定內(nèi)皮依賴性舒張。來自LIMA的環(huán)具有比隱靜脈 更大的內(nèi)皮依賴性舒張（圖15)。在外科準備期間的操作引起內(nèi)皮依賴性舒張的減少（圖 15)。在肝素化鹽溶液中的保存[*p< 0? 05,與所有UM組（UM、UW、HP&HPT)的HS相比] 引起內(nèi)皮依賴性舒張的減少，而肝素化勃脈力、肝素化勃脈力加上海藻糖或移植物采集溶 液則不然（圖15)。數(shù)據(jù)代表％舒張（與去氧腎上腺素誘導的最大收縮相比）。
[0122] 在由范德堡大學機構(gòu)審查委員會（Nashville，TN)批準的知情同意后，從進行冠 狀動脈旁路或外周血管旁路手術(shù)的患者中收集人隱靜脈的無標記丟棄區(qū)段（n= 5)。將 靜脈貯存于鹽溶液中直到外科手術(shù)結(jié)束，這時將其置于冷的移植物采集緩沖液（IOOmM乳 糖酸鉀、25mMKH2P04、5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、50g/ L羥乙基淀粉，pH7. 4)中。靜脈在采集的24小時內(nèi)測試并在4°C貯存于移植物采集緩沖液 中。將壓力安全閥一端連接注射器，另一端連接插管的隱靜脈。隱靜脈的遠端也是插管的 并連接到壓力傳感器。當在有或沒有壓力釋放閥的情況下用手持注射器擴張該靜脈時監(jiān) 測壓力。壓力監(jiān)測器將不測量高于300mmHg的壓力。這產(chǎn)生了以下三組：過壓釋放壓力 (Popoff)、具有壓力安全閥的最大壓力（具有閥的最大的）以及沒有壓力安全閥的最大壓 力（沒有閥的最大的）。具有壓力安全閥的靜脈具有（129±L265)mmHg的平均壓力以及 (141.8±L985)mmHg的最大壓力，而沒有壓力安全閥的靜脈具有（300±0.00)mmHg的最 大壓力（圖16)。具有壓力安全閥的靜脈中的平均和最大壓力與沒有壓力安全閥的靜脈顯 著不同（P彡〇? 05)。
[0123] 在無菌條件下通過非觸碰法采集新鮮的豬的隱靜脈并貯存于冷的移植物采集緩 沖液（IOOmM乳糖酸鉀、25mMKH2P04、5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別 嘌呤醇、50g/L羥乙基淀粉，pH7. 4)。該血管在采集的24小時內(nèi)使用。在直列式壓力釋放 閥（壓力安全）缺乏（擴張）或存在的情況下用注射器人工擴張靜脈（n= 4)。對照部分 是非擴張的（ND)。擴張后，將環(huán)切自該部分并懸浮于肌槽。將該環(huán)用KT6M去氧腎上腺素 預收縮，之后用5XKT7M卡巴膽堿處理以確定內(nèi)皮依賴性舒張。數(shù)據(jù)表示為％舒張（與最 大去氧腎上腺素誘導的收縮相比）。用手持注射器進行的人工擴張在內(nèi)皮依賴性舒張中引 起顯著的降低（p< 0. 0005)并且該壓力釋放閥預防這種內(nèi)皮依賴性舒張的喪失（圖17)。
[0124] 從處死的豬新分離豬的冠狀動脈，并直接置于冷的移植物采集緩沖液（IOOmM 乳糖酸鉀、25mMKH2P04、5mMMgS04、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、ImM別嘌呤醇、 50g/L羥乙基淀粉，pH7. 4)。將冠狀動脈剝離脂肪和血管外膜組織并將內(nèi)皮移除。切出 橫向環(huán)（LOmm厚）并懸浮于肌肉槽，通過絲線3-0連接到與數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換A-D面板（Data Translation，MA)接口的力傳感器（KentScientific，CT)。數(shù)據(jù)用PowerLab軟件程序 得到。將豬的冠狀動脈環(huán)懸浮于肌肉槽并在克-林二氏碳酸氫鹽緩沖液中平衡2小時。將 該環(huán)拉伸并逐漸調(diào)節(jié)長度直到獲得最大的張力。該環(huán)用IlOmMKCl(等摩爾替換碳酸氫鹽 緩沖液中的NaCl)收縮，測量產(chǎn)生的力并轉(zhuǎn)化為應力[牛頓（N)/m2]=力（g)XO. 0987/面 積，其中面積等于濕重[mg/長度（最大長度的mm)]除以1.055。洗滌環(huán)并再平衡30分鐘。 將環(huán)用以下進行