一種自殺基因納米膠束及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域，具體涉及一種自殺基因納米膠束及其制備方法和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自殺基因 （suicide gene)治療，是指將某些病毒或細(xì)菌的基因?qū)氚屑?xì)胞中， 其表達(dá)的酶可催化無(wú)毒的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒物質(zhì)，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì) 胞被殺死。這類(lèi)基因稱(chēng)為自殺基因，又稱(chēng)藥物敏感性基因。目前，具有較好臨床應(yīng)用前 景的自殺基因主要有單純皰疫病毒胸苷激酶基因 （herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-tk)，胞啼陡脫氨酶基因（E, colicytocine deaminase, CD)。但是由于自殺基因 本身穿透細(xì)胞膜的能力極差，且易被血清中的酶迅速降解而難以表達(dá)。
[0003] 因此，有必要提供一種攜帶自殺基因進(jìn)入細(xì)胞，并提1?其在體內(nèi)的穩(wěn)定性，從而提 高基因表達(dá)效率的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種自殺基因納米膠束，包括兩親性三嵌段聚合 物和自殺基因，該自殺基因納米膠束采用生物相容性和穩(wěn)定性較好的三嵌段聚合物為載體 材料制備自殺基因載體，該載體能很好的負(fù)載自殺基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染效率較高，能提高自殺基 因質(zhì)粒在體內(nèi)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)自殺基因質(zhì)粒在體內(nèi)的半哀期；本發(fā)明還提供了一種自殺基 因納米膠束的制備方法和應(yīng)用。
[0005] 第一方面，本發(fā)明提供了一種自殺基因納米膠束，包括兩親性三嵌段聚合物，所 述兩親性三嵌段聚合物為線性高分子化合物，包括為氨基聚乙二醇羧酸、聚賴(lài)氨酸和聚異 亮氨酸，所述聚賴(lài)氨酸的一端通過(guò)酰胺鍵與所述氨基聚乙二醇羧酸相連，另一端通過(guò)肽鍵 與所述聚亮氨酸相連，
[0006] 所述自殺基因納米膠束為具有三層結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，所述聚亮氨酸構(gòu)成所述復(fù)合體 的內(nèi)層，所述氨基聚乙二醇羧酸構(gòu)成所述復(fù)合體的外層；
[0007] 所述復(fù)合體的中間層包括所述聚賴(lài)氨酸，還包括自殺基因質(zhì)粒，所述自殺基因質(zhì) 粒分散在中間層的所述聚賴(lài)氨酸中；
[0008] 所述兩親性三嵌段聚合物和自殺基因質(zhì)粒的質(zhì)量比為1~20:1。
[0009] 優(yōu)選地，所述自殺基因納米膠束中，所述氨基聚乙二醇羧酸、聚賴(lài)氨酸和聚異亮氨 酸的摩爾比為1:10~40:30~50。
[0010] 優(yōu)選地，所述兩親性三嵌段聚合物中，所述氨基聚乙二醇羧酸的數(shù)均分子量為 2000Da。
[0011] 優(yōu)選地，所述兩親性三嵌段聚合物中，所述聚賴(lài)氨酸的聚合度為1〇~1〇〇。
[0012] 優(yōu)選地，所述兩親性三嵌段聚合物中，所述聚異亮氨酸的聚合度為10~200。
[0013] 優(yōu)選地，所述自殺基因質(zhì)粒為含有胞嘧啶脫氨酶CD基因或單純皰疹病毒胸苷激 酶HSV-TK基因的真核重組質(zhì)粒載體。
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述真核重組質(zhì)粒載體為PIRES2-EGFP或pcDNA3. 1。
[0015] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述⑶基因插入pIRES2-EGFP質(zhì)粒的XhoI和BamHI位點(diǎn)。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述胞嘧啶脫氨酶⑶基因的表達(dá)由HE4啟動(dòng)子控制。
[0017] 本發(fā)明優(yōu)選以HE4為啟動(dòng)子構(gòu)建對(duì)卵巢癌具有特異識(shí)別功能的CD自殺基因質(zhì)粒。
[0018] 優(yōu)選地，所述HE4啟動(dòng)子的GeneBank序列號(hào)為10406。
[0019] 優(yōu)選地，PCR引物擴(kuò)增所述HE4啟動(dòng)子的上游引物和下游引物分別為核苷酸序列 如 SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO:2 所示的 DNA。其中，
[0020] SEQ ID N0:1 ：5-GCATTAATTTAATAATAAGTGCTATTTCTGTAGC-3,
[0021] SEQ ID N0:2 :5-TAGCGGGCCTAGGCGACAAGCAGG-3。
[0022] 優(yōu)選地，所述胞嘧啶脫氨酶⑶基因的GeneBank序列號(hào)為1249769。
[0023] 優(yōu)選地，PCR引物擴(kuò)增所述⑶基因的上游引物和下游引物分別為核苷酸序列如 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 所示的 DNA。其中，
[0024] SEQ ID NO:3 ：
[0025] 5-ATCCTCGAGATGGTGTCGAATAACGCTTTACAAACAATT-3，
[0026] SEQ ID NO:4 ：
[0027] 5-AGTGGATCCACGTTTGTAATCGATGGCTTCTG-3。
[0028] 本發(fā)明提供的自殺基因納米膠束以?xún)捎H性三嵌段聚合物（PEG-PLL-PLLeu)為載 體，自殺基因質(zhì)粒分散在所述兩親性三嵌段聚合物中間層，構(gòu)成三層結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合物。
[0029] 所述兩親性三嵌段聚合物中間層的聚賴(lài)氨酸（PLL)帶正電荷，可以通過(guò)靜電作用 與帶負(fù)電的自殺基因質(zhì)粒的結(jié)合，共同構(gòu)成納米膠束的中間層；聚亮氨酸（PLLeu)的疏水 作用使其在水中形成納米膠束的內(nèi)核，有助于加快納米膠束的自組裝作用；氨基聚乙二醇 羧酸（HOOC-PEg-NH 2)構(gòu)成所述納米膠束的外層，聚乙二醇為親水性材料，能使納米膠束表 面形成水化層，能夠有效保護(hù)納米膠束躲避免疫系統(tǒng)的清除作用，從而增加納米膠束在生 物體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間；此外，聚乙二醇能增強(qiáng)納米膠束的膜流動(dòng)性從而促進(jìn)納米膠束的轉(zhuǎn)染 效率，進(jìn)而提1?自殺基因質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)效率。
[0030] 本發(fā)明提供的自殺基因納米膠束通過(guò)靜電吸附或物理吸附的作用吸附自殺基因 質(zhì)粒，包封率較高，形成的納米粒比較穩(wěn)定，且具有較高的轉(zhuǎn)染效率。此外，本發(fā)明提供的自 殺基因納米膠束具有良好的生物相容性，可生物降解并通過(guò)正常的生理途徑吸收或排出。
[0031] 第二方面，本發(fā)明提供了一種自殺基因納米膠束的制備方法，包括以下步驟：
[0032] ( 1)提供兩親性三嵌段聚合物，所述兩親性三嵌段聚合物為線性高分子化合物，包 括氨基聚乙二醇羧酸、聚賴(lài)氨酸和聚異亮氨酸，所述聚賴(lài)氨酸的一端通過(guò)酰胺鍵與所述氨 基聚乙二醇羧酸相連，另一端通過(guò)肽鍵與所述聚亮氨酸相連；將所述兩親性三嵌段聚合物 溶于有機(jī)溶劑中，得到濃度為2~4mg/ml的兩親性三嵌段聚合物溶液；
[0033] (2)取步驟（1)制備的兩親性三嵌段聚合物溶液，與水按1:1~5的體積比逐滴加 入所述兩親性三嵌段聚合物溶液中，得到兩親性三嵌段聚合物水溶液；
[0034] ( 3 )將所得兩親性三嵌段聚合
[0035] 物混合水溶液用分子截留量為2000~8000Da的透析袋室溫透析12~36小時(shí)， 得到兩親性三嵌段聚合物納米膠束，所述兩親性三嵌段聚合物納米膠為具有三層結(jié)構(gòu)的復(fù) 合體，所述聚亮氨酸構(gòu)成所述復(fù)合體的內(nèi)層，所述復(fù)合體的中間層包括所述聚賴(lài)氨酸，所述 氨基聚乙二醇羧酸構(gòu)成所述復(fù)合體的外層；
[0036] (4)取自殺基因質(zhì)粒溶于水中，得到濃度為50~100 μ g/ml的自殺基因質(zhì)粒溶 液；
[0037] (5)取步驟（3)所得兩親性三嵌段聚合物納米膠束與步驟（4)所得自殺基因質(zhì)粒 溶液混合均勻并靜置15~60分鐘，得到自殺基因納米膠束；所述自殺基因納米膠束為具有 三層結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，所述聚亮氨酸構(gòu)成所述復(fù)合體的內(nèi)層，所述氨基聚乙二醇羧酸構(gòu)成所 述復(fù)合體的外層；所述復(fù)合體的中間層包括所述聚賴(lài)氨酸，還包括自殺基因質(zhì)粒，所述自殺 基因質(zhì)粒分散在中間層的所述聚賴(lài)氨酸中；所述兩親性三嵌段聚合物和自殺基因質(zhì)粒的質(zhì) 量比為1~20:1。
[0038] 優(yōu)選地，所述水為超純水。
[0039] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中，所述有機(jī)溶劑為二甲基亞砜（DMSO)或N，N-二甲基甲酰 胺（DMF)。
[0040] 優(yōu)選地，所述自殺基因納米膠束中，所述氨基聚乙二醇羧酸、聚賴(lài)氨酸和聚異亮氨 酸的摩爾比為1:10~40:30~50。
[0041] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述自殺基因納米膠束中，所述氨基聚乙二醇羧酸、聚賴(lài)氨酸和聚 異亮氨酸的摩爾比為1:20:40。
[0042] 優(yōu)選地，所述兩親性三嵌段聚合物中，所述氨基聚乙二醇羧酸的數(shù)均分子量為 2000Da。
[0043] 優(yōu)選地，所述兩親性三嵌段聚合物中，所述聚賴(lài)氨酸的聚合度為10~100。
[0044] 優(yōu)選地，所述兩親性三嵌段聚合物中，所述聚異亮氨酸的聚合度為10~200。
[0045] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中，所述將兩親性三嵌段聚合物進(jìn)行透析的操作為將混合水 溶液轉(zhuǎn)入分子截留量在2000~8000Da的透析袋中，采用混合水溶液體積的1000~2000 倍的超純水室溫透析12~36小時(shí)。
[0046] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中，所述將兩親性三嵌段聚合物進(jìn)行透析的操作為將混合水 溶液轉(zhuǎn)入分子截留量在3000Da的透析袋中。
[0047] 優(yōu)選地，所述自殺基因質(zhì)粒為含有胞嘧啶脫氨酶CD基因或單純皰疹病毒胸苷激 酶HSV-TK基因的真核重組質(zhì)粒載體。
[0048] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所