一種無創(chuàng)制作細菌性肺炎動物模型的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于動物實驗模型構建技術領域，具體地說，涉及一種無創(chuàng)制作細菌性肺炎動物模型的方法。
【背景技術】
[0002]現(xiàn)有的細菌性肺炎動物模型的構建方法有很多，主要包括:經(jīng)鼻滴入法、經(jīng)口咽氣管滴入法、霧化吸入法、氣管插管法、直視下給藥法等方法。雖然方法很多，但是構建出的動物模型的質(zhì)量參差不齊。眾多方法均能不同程度模擬臨床構建細菌性肺炎動物模型，但是均存在一定弊端，導致諸多動物模型不穩(wěn)定。
[0003]經(jīng)鼻滴入法最符合臨床患者的感染方式，但是實驗研宄中發(fā)現(xiàn)該方法大多動物不能成模型，滴鼻之后，動物吸入的量無法控制在同一水平，而且不能保證其吸入程度，故構建出的模型質(zhì)量比較低。經(jīng)口咽氣管滴入法、霧化吸入法的缺點同上。
[0004]氣管切開法:為有創(chuàng)操作，簡單易行，且在切開后，視野暴露良好，易于準確定位；但術后感染與否以及操作對于氣管局部以及周圍組織的破壞難以掌握，存活率和局部感染易對某些感染類指標產(chǎn)生影響。
[0005]直視下給藥法:選取光源暴露聲門后，操作者在直視聲門的情況下，進行氣管內(nèi)給藥的相關操作，較其他方法創(chuàng)傷小，器械和技術水平要求相應也降低，但選擇合適的光源清晰暴露聲門則是此法關鍵環(huán)節(jié)，多選用燈泡，冷光源，手電等透過頸部的光線。此時輔以牽拉舌根暴露聲門，但大鼠頭部狹長，聲門狹小并且在口腔深部，選用的給藥裝置如過粗或形態(tài)不能很好配合生理曲度時，在逐漸接近會厭部，則會擋住大部分視線，在聲門暴露的短暫時間內(nèi)，較難準確插入聲門完成操作，并容易將給藥裝置誤入食管或因為視野不清反復多次插入造成喉頭水腫，氣道損傷，聲帶出血，嚴重時甚至大鼠死亡。
[0006]盲插法:經(jīng)口氣管內(nèi)給藥，在沒有暴露聲門的情況下，容易反復刺激喉部，造成粘膜水腫出血，氣道分泌物增加，導致氣道阻塞，另外極易將注射裝置誤入食道，成功率較低。經(jīng)皮氣管內(nèi)給藥，則需要從外部皮膚直接準確定位氣管位置并從環(huán)狀軟骨間隙給藥，對操作人的技術要求較高，否則容易多次刺激局部肌肉及筋膜等，給藥效果難以評估，還容易造成水腫出血，成功率低。
[0007]吸入法:一般情況下，除滿足藥物霧化后粒徑要求外，選擇合適的霧化發(fā)生裝置和動物霧化吸入裝置同樣重要，藥液用量小常用壓縮式霧化器，若用量大則用超聲霧化器；而吸入裝置應根據(jù)不同動物選擇不同型號的面罩或噴霧吸嘴。目前常用的是動式吸入裝置，應選擇對供試品吸附較少，氣溶膠發(fā)生能力強、密封性好、易于清洗的裝置，并確保能快速達到試驗所需濃度并在試驗過程中保持藥物濃度穩(wěn)定性。藥物仍須保持分散均勻，不形成結(jié)塊。所以從霧化粒徑之外，裝置要求較多，并難以計算以及掌握吸入量的多少，容易造成給藥量不均。
[0008]針對上述現(xiàn)有的操作技術，目前，需要一種操作方便，成功率高，損傷小且成本低廉的大鼠用氣管內(nèi)給藥方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷，本發(fā)明提出了一種無創(chuàng)制作細菌性肺炎動物模型的方法，通過氣管內(nèi)滴注大腸埃希菌模擬臨床建立肺炎動物模型，探宄扶正解毒中藥對肺炎動物炎癥調(diào)控機制。其技術方案如下:
[0010]一種無創(chuàng)制作細菌性肺炎動物模型的方法，包括以下步驟:
[0011]步驟1、菌株與細菌培養(yǎng)
[0012]大腸埃希菌標準菌株由天津市臨床檢驗中心提供，菌株號:ATCC25922，取菌株ATCC25922接種于血瓊脂培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)18_24h，挑取單菌落接種THB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm/min振蕩培養(yǎng)12h，離心濃縮后，據(jù)預實驗結(jié)果，用無菌PBS制備1.2 X 19CFU.mL—1細菌懸液，4°C保存，2h之內(nèi)用于接種實驗動物；
[0013]步驟2、實驗動物
[0014]清潔級Wistar雄性大鼠60只，月齡3_6個月，體重180 士 20g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格(許可)證號:SCXK(京)2009-0004 ;實驗大鼠喂養(yǎng)在天津?qū)嶒瀯游镏行?，飼養(yǎng)環(huán)境室內(nèi)相對濕度為50% -60%，溫度控制在18-22°C ;常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲用水，按時通風沖刷糞便，保持環(huán)境安靜，適應性喂養(yǎng)I周后開始實驗；
[0015]步驟3接種細菌
[0016]采用內(nèi)窺鏡引導下氣管內(nèi)灌注的滴注菌液方式，設備采用鼻O度4#硬式內(nèi)窺鏡、氙燈冷光源及松下KS-822攝錄監(jiān)視系統(tǒng)；
[0017]將大鼠置于直徑為26cm的干燥器內(nèi)乙醚麻醉，麻醉滿意后迅速將鼠從麻醉器中取出，呈仰臥位狀以彈力固定夾將其四肢分別固定于鼠板上；
[0018]兩名操作者并排位于鼠頭頂方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉鏡，自鼠上唇齒伸入口腔、提壓鼠舌，伸至鼠會厭緣處時提拉鼠舌根，以右手持牽拉套圈，套住鼠上列長尖牙門齒，左右手同時相反方向上下牽拉舌根與長尖牙門齒，使鼠自唇齒至喉部間上呼吸暢通暴露聲門區(qū)域，此時主操作者以左手持O度硬式內(nèi)窺鏡，右手持7號長針注射器，內(nèi)裝定量造模所用肺炎鏈球菌菌懸液，在監(jiān)視器顯示引導下將7號長注射針插入氣管內(nèi)，并深入聲門下15?20mm，此時觀察鼠的聲帶活動情況，當雙側(cè)聲帶由內(nèi)收狀向外展狀變化時，迅速推注2ml大腸埃希菌菌液，隨后注入100 μ I空氣，此時鼠呈吸氣階段，使藥物隨吸氣時的氣流充分進入支氣管內(nèi)，推注完畢后，將鼠板迅速立起鼠頭在上左右翻轉(zhuǎn)8?10秒，空白組不做處理，鹽水對照組注入同等量的無菌生理鹽水；
[0019]解除鼠四肢彈力固定夾將鼠放回鼠籠內(nèi)待復蘇，鼠復蘇時間約30?60秒，然后置于恒溫動物房飼養(yǎng)；接種后每日觀察其活動、取食、精神的一般情況，記錄相應數(shù)據(jù)。
[0020]進一步優(yōu)選，所述大腸埃希菌菌液的濃度為1.2 X 19CFU.mL'
[0021]本發(fā)明的有益效果為:
[0022]本發(fā)明造模過程更加嚴謹、減小損傷，提高了模型質(zhì)量，能夠使藥物完全進入動物氣管內(nèi)從而進入肺內(nèi)，內(nèi)造成肺部感染，易于模型成功建立；同時避免了其他造模方法的操作過程中對動物的局部造成創(chuàng)傷和感染，對造模的評估造成干擾；造模動物死亡數(shù)量下降，降低了經(jīng)濟成本。
【附圖說明】
[0023]圖1為模型組的肺組織大體標本圖，
[0024]圖2為為空白組的肺組織大體標本圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0026]I材料與方法
[0027]1.1菌株與細菌培養(yǎng)
[0028]大腸埃希菌標準菌株由天津市臨床檢驗中心提供，菌株號:ATCC25922。取菌株ATCC25922接種于血瓊脂培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)18_24h，挑取單菌落接種THB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm/min振蕩培養(yǎng)12h，離心濃縮后，據(jù)預實驗結(jié)果，用無菌PBS制備1.2 X 19CFU.mL—1細菌懸液，4°C保存，2h之內(nèi)用于接種實驗動物。
[0029]1.2實驗動物
[0030]清潔級Wistar雄性大鼠60只，