濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及濱蒿提取物的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，是一種濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用。本發(fā)明首次公開了濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用；通過體外抗菌實驗?zāi)軌蛘f明濱蒿提取物具有顯著抑制肺炎鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌生長的作用，通過抗炎實驗?zāi)軌蛘f明濱蒿提取物具有抗炎活性，同時，濱蒿提取物對小鼠肺損傷模型具有保護作用；由上述能夠說明濱蒿提取物對由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎具有治療作用，從而為由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎的治療提供了新途徑。
【專利說明】
濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈 球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及濱蒿提取物的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，是一種濱蒿提取物作為制備治療由肺炎 鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎是指終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥，可由病原微生物、理化因素、免疫損傷、 過敏及藥物所致。肺炎按解剖可分為大葉性肺炎、小葉性肺炎和間質(zhì)性肺炎;按病因可分為 細菌性肺炎、非典型病原體所致肺炎、病毒性肺炎、真菌性肺炎、其他病原體所致肺炎以及 理化因素所致的肺炎;按患病環(huán)境分為社區(qū)獲得性肺炎和醫(yī)院獲得性肺炎。
[0003] 細菌性肺炎是臨床最常見的肺炎，也是常見的感染性疾病之一，發(fā)病率非常高，而 且不容易治愈，更主要的是該病給患者的身體帶來很大傷害，如果不能及時治療或者治療 不當(dāng)，不僅會加重病情的發(fā)展，還有可能引發(fā)其他疾病的發(fā)生，甚至引起死亡，其主要原因 為重癥肺炎患者的免疫功能低下，易合并多重耐藥菌感染，出現(xiàn)嚴(yán)重的低氧血癥，甚至感染 性休克和多臟器功能衰竭。造成這種結(jié)果的主要原因不僅是致病菌的作用，還有機體免疫 過程中引起的"炎癥瀑布效應(yīng)"，然而，抗生素的治療并不能有效控制炎癥的發(fā)生發(fā)展。
[0004] 細菌性肺炎病因主要包括肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌等。社 區(qū)獲得性肺炎的常見病原體為肺炎鏈球菌。細菌性肺炎占成人各類病原體肺炎的80%，其 癥狀變化較大，可輕可重，決定于病原體和宿主的狀態(tài)。常見癥狀為咳嗽、咳痰，或原有呼吸 道癥狀加重，并出現(xiàn)膿性痰或血痰，伴或不伴胸痛。進入抗生素時代以來，細菌性肺炎的預(yù) 后一度顯著改善，但自60年代以后，由于細菌耐藥率增高，所謂"難治性"肺炎屢見不鮮，病 死率居高不降，尤其在兒童、老年人和免疫抑制患者中病死率極高。如何在抗感染治療的同 時，積極探索其他輔助治療方法，降低重癥肺炎的病死率，已成為近年來臨床研究的熱點。 因此，臨床更加注重非抗生素的輔助治療，如研制新型的抗炎藥物來減輕肺組織的炎性損 傷，包括肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞受損，調(diào)節(jié)機體天然免疫系統(tǒng)來抵御致病 菌感染，如何減輕炎癥反應(yīng)對肺組織造成的繼發(fā)損傷，包括改善肺毛細血管通透性與肺水 月中，進一步減輕肺組織病理改變，提高生存率。因此，尋找新型、安全的治療藥物對臨床治療 具有重要意義。
[0005] 中醫(yī)藥治療肺炎在減輕患者癥狀、提高患者生存質(zhì)量及減輕細菌耐藥性等方面有 明顯優(yōu)勢。中醫(yī)藥對重癥肺炎的炎性刺激有明顯抑制作用，輔助西醫(yī)藥治療更有利于重癥 肺炎的恢復(fù)及預(yù)后。此外西醫(yī)大劑量使用抗生素、糖皮質(zhì)激素常伴隨免疫抑制等不良反應(yīng)， 不利于重癥肺炎患者康復(fù)及預(yù)后，而中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)患者免疫力，即"扶正"方面具有一定優(yōu) 勢。中醫(yī)藥治療肺炎的機制主要是:一方面可直接抑殺病原微生物，中藥抗菌機制與抑制細 菌呼吸和糖代謝中間產(chǎn)物的氧化和脫氧，抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成，降低細菌中鎂含量，阻 止細菌細胞壁合成有關(guān)。另一方面還可調(diào)節(jié)機體免疫功能，可對復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)進行 協(xié)調(diào)，使之不致于過度分泌細胞因子或炎癥介質(zhì)，從而改善了炎癥和組織損害。
[0006] 單核巨噬細胞在炎癥中扮有重要的角色，所產(chǎn)生的細胞因子和炎性介質(zhì)，如腫瘤 壞死因子-a(TNF-a)、白介素-1β(]Χ-1β)、白介素-6( IL-6)、一氧化氮（N0)和前列腺素 (PGE2)等，還可產(chǎn)生大量的活性氧自由基(R0S)，參與炎癥的發(fā)生與發(fā)展過程。在細胞內(nèi)部， 這些促炎細胞因子和介質(zhì)受到核因子NF-kB的調(diào)控。因此，這一類促炎細胞因子和介質(zhì)常作 為炎癥損傷的指標(biāo)，也常作為評價抗炎藥物的觀測標(biāo)準(zhǔn)。由于脂多糖（LPS)刺激的RAW 264.7小鼠巨噬細胞會分泌以上細胞因子和介質(zhì)并產(chǎn)生R0S，因此該細胞常作為研究抗炎藥 物的細胞模型。
[0007] NF-kB目前被認為是應(yīng)激反應(yīng)尤其是炎癥過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，NF-κΒ通過調(diào)控機 體內(nèi)多種前炎癥因子等細胞因子調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)，控制炎癥性疾病的發(fā)展。當(dāng)NF-kB結(jié)合 位點接受多種免疫刺激，如TNF_a、LPS、T細胞激活劑、生長因子等均可通過一個或多個信號 轉(zhuǎn)錄途徑激活蛋白激酶，致使NF-kB被激活而由胞漿轉(zhuǎn)核而發(fā)生效應(yīng)。NF-κΒ調(diào)控過程中有 多種蛋白激酶或受體參與，它們介導(dǎo)下游NF-kB信號通路的信號傳導(dǎo)，從而影響細胞的生 存、增殖、分化和死亡等多個生物學(xué)過程的調(diào)控。NF-kB活化后能調(diào)控一系列基因的表達:細 胞表面受體，轉(zhuǎn)錄因子，黏附分子，前炎癥性細胞因子了冊-〇、11^10、11^-6，趨化因子如單核 細胞趨化蛋白-l(MCP-l)等，而誘導(dǎo)表達的細胞因子又能上調(diào)其活性，形成正反饋調(diào)節(jié)機 制，增強炎癥反應(yīng)。
[0008]絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路是細胞內(nèi)一類非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，MAPK家族有三條經(jīng)典的亞族通路分別是細胞外 調(diào)節(jié)蛋白激酶 1 和2(extracellular signal-related kinases 1 and 2，ERKl/2)、c_Jun氨 基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶（口381;11:〇8611- hctivated Protein Kinase，p38MAPK)。這些MAPK通路被脂多糖（LPS)等多種因素激活后， 通過復(fù)雜的細胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)，可產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，從而促進炎癥的發(fā)生發(fā)展。ERK、 JNK、p38MAPK通路活化的標(biāo)志是其磷酸化形式表達量的增多。MAPK通路可以促進炎癥的發(fā) 展，因此，MAPK也是藥物抑制炎癥反應(yīng)的靶點之一。
[0009]正常生理狀態(tài)下，NF-kB與抑制性蛋白ΙκΒα結(jié)合成無活性的二聚體復(fù)合物存在細 胞漿中，當(dāng)受到外界的刺激，如TNF_a、LPS、T細胞激活劑、生長因子等，ΙκΒα就會發(fā)生磷酸 化，磷酸化的ΙκΒα蛋白發(fā)生泛素-蛋白酶體降解，從二聚體上解離出來，活化的NF-κΒ從細胞 質(zhì)轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，對下游的細胞因子和炎癥介質(zhì)等發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，上調(diào)炎癥因子和炎癥 介質(zhì)的蛋白表達，加重炎癥反應(yīng);ERK1/2是MAPK家族三條經(jīng)典的亞族通路之一，其磷酸化形 式即：P-ERK1/2表達量的增多標(biāo)志著MAPK信號通路的活化，從而促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā) 展，導(dǎo)致炎癥因子TNF-a、IL-6基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平增高。因此，抑制ΙκΒα蛋白和ERK1/2 蛋白發(fā)生磷酸化，即：下調(diào)P_lKBa、p-ERKl/2蛋白表達水平，就可以分別抑制NF-κΒ和ERK1/ 2MAPK信號通路的活化，從而發(fā)揮抗炎作用。
[0010] 濱蒿（Artemisia scoparia Waldst · et kit)為菊科蒿屬植物，維吾爾名"西瓦 克"，是維吾爾醫(yī)常用藥材，同時也是中藥茵陳的植物來源之一。濱蒿在新疆的資源分布極 為廣泛。目前為止，國內(nèi)外未見濱蒿提取物用于治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌 引起的肺炎的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明提供了一種濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球 菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用;本發(fā)明首次公開了濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/ 和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來實現(xiàn)的：一種濱蒿提取物作為制備治療由肺 炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用。
[0013] 下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案的進一步優(yōu)化或/和改進：
[0014] 上述濱蒿提取物中的黃酮類成分的質(zhì)量百分比為25%至75%。
[0015] 上述藥物的劑型為藥學(xué)上可接受的劑型。
[0016] 上述藥學(xué)上可接受的劑型為片劑或顆粒劑或口服液或注射劑。
[0017]本發(fā)明首次公開了濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球 菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用;通過體外抗菌實驗?zāi)軌蛘f明濱蒿提取物具有顯著抑制肺炎鏈球 菌和乙型溶血性鏈球菌生長的作用，通過抗炎實驗?zāi)軌蛘f明濱蒿提取物具有抗炎活性，同 時，濱蒿提取物對小鼠肺損傷模型具有保護作用；由上述能夠說明濱蒿提取物對由肺炎鏈 球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎具有治療作用，從而為由肺炎鏈球菌或/和乙型溶 血性鏈球菌引起的肺炎的治療提供了新途徑。
【附圖說明】
[0018] 附圖1為空白對照組（cont)、LPS模型組、LPS+吲哚美辛組（indometacin，INDO)及 LPS+濱蒿提取物(BH)組的凝膠圖像。
[0019] 附圖2為空白對照組（cont)、LPS模型組、LPS+吲噪美辛組（indometacin，INDO)及 LPS+濱蒿提取物(BH)組的ρ-ΙκΒα蛋白表達。
[0020] 附圖3為空白對照組（cont)、LPS模型組、LPS+吲哚美辛組（indometacin，INDO)及 LPS+濱蒿提取物(BH)組的p-ERKl/2蛋白表達。
[0021] 附圖4為空白對照組（cont)、LPS模型組、LPS+吲哚美辛組（indometacin，INDO)及 LPS+濱蒿提取物(BH)組的TNF-α蛋白表達。
[0022] 附圖5為空白對照組（cont)、LPS模型組、LPS+吲哚美辛組（indometacin，INDO)及 LPS+濱蒿提取物(BH)組的IL-6的蛋白表達。
[0023] 附圖6為空白對照組（cont)、LPS模型組、LPS+吲哚美辛組（indometacin，INDO)及 LPS+濱蒿提取物(BH)組的TNF-amRNA表達水平。
[0024] 附圖7為空白對照組(cont)、LPS模型組、LPS+吲噪美辛（IND0)組及LPS+濱蒿提取 物(BH)組的IL-6mRNA表達水平。
[0025] 附圖8為空白對照組(cont)、LPS模型組、LPS+吲噪美辛（IND0)組及LPS+濱蒿提取 物(BH)組的NF-κΒ核轉(zhuǎn)位。
[0026] 附圖 9為正常對照組（cont)、LPS 模型組、LPS+DEX(5mg/kg)組、LPS+BH(200mg/kg) 組、LPS+BH(400mg/kg)組的肺部病理（200 X )。
【具體實施方式】
[0027] 本發(fā)明不受下述實施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實際情況來確定具體 的實施方式。
[0028] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述：
[0029] 實施例1:該濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起 的肺炎藥物的應(yīng)用。濱蒿提取物為申請?zhí)枮?00910113473的中國專利文獻中提及的濱蒿提 取物。濱蒿提取物也可以為現(xiàn)有普通市售的濱蒿提取物。
[0030] 實施例2:作為上述實施例的優(yōu)化，濱蒿提取物中的黃酮類成分的質(zhì)量百分比為 25%至 75%。
[0031] 實施例3:作為上述實施例的優(yōu)化，藥物的劑型為藥學(xué)上可接受的劑型。
[0032] 實施例4:作為上述實施例的優(yōu)化，藥學(xué)上可接受的劑型為片劑或顆粒劑或口服液 或注射劑。
[0033] 下面為本發(fā)明所述的濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈 球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用的具體藥理實驗：
[0034](一)體外抗菌試驗 [0035] 1實驗材料
[0036] 1.1受試藥物濱蒿提取物，新疆藥物研究所制備，批號20141028;復(fù)方一枝蒿顆粒， 新疆銀朵蘭維藥股份有限公司，批號20141223;頭孢氨芐膠囊，浙江亞太藥業(yè)股份有限公 司。
[0037] 1.2菌株與試劑肺炎鏈球菌，批號：ATCC 49619;乙型溶血性鏈球菌，批號：ATCC 19615;以上菌種均購于中國食品藥品檢定研究院。一次性使用培養(yǎng)皿，江拱醫(yī)療科技有限 公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司，批號：150117);血瓊脂培養(yǎng)基(杭州微生 物試劑有限公司，批號：20150622);胎牛血清(杭州微生物試劑有限公司，批號:051112);過 氧化氫(杭州微生物試劑有限公司，批號:051019) ;0pt〇chin紙片(杭州微生物試劑有限公 司，批號：120829)。
[0038] 2樣品的預(yù)處理
[0039] 分別稱取濱蒿提取物樣品10g、復(fù)方一枝蒿樣品10g，樣品分別以無菌雙蒸水配制 成濃度為l〇〇〇mg/mL的藥液，頭孢氨節(jié)膠囊(標(biāo)示量125mg)以無菌雙蒸水配成12.5mg/mL的 濃度，充分振搖后置4 °C冰箱浸泡過夜，取浸泡液過濾除菌，分別接種于M-Η瓊脂培養(yǎng)基和血 瓊脂平板，置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后觀察有無菌生長。結(jié)果表明，受試樣品（濱蒿提取物樣 品、復(fù)方一枝蒿樣品、孢氨芐膠囊)溶液均無菌生長，可用于下一步實驗。
[0040] 3實驗方法
[0041 ] 3.1實驗菌的準(zhǔn)備
[0042]乙型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌菌株分別接種于血瓊脂平板，選取菌落直徑約等 于1mm大小的菌接種于lmL血清肉湯培養(yǎng)基，6h后，經(jīng)麥?zhǔn)媳瘸胤ù_定細菌濃度，同時做細菌 計數(shù)。確定細菌濃度約為109_1()CFU/mL，并做系列稀釋，通過傾倒平板法計數(shù)。實驗中，每lmL 液體培養(yǎng)基中加入〇. lmL菌懸液為最終實驗濃度，計數(shù)結(jié)果：乙型溶血性鏈球菌的實驗濃度 為3.3 X 107CFU/mL，肺炎鏈球菌的實驗濃度為3.8 X 106CFU/mL。
[0043] 3.2試管法測定對乙型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌的MIC和MBC
[0044] 實驗包括三組，每組包括13個管。采用標(biāo)準(zhǔn)試管二倍稀釋法稀釋濱蒿提取物藥液。 2號-13號管，每管均分別加入胎牛血清0.05mL和肉湯培養(yǎng)基0.85mL，混勻即得到0.9mL血清 肉湯培養(yǎng)基，1號管加入〇. 〇5mL胎牛血清和1.75mL濱蒿提取物初始藥液(濃度為1000mg/mL) 混勻，取1號管藥液0.9mL加入2號管，混勻，然后取2號管藥液0.9mL加入3號管，混勻，以此類 推連續(xù)倍比稀釋至第10管，將濱蒿提取物稀釋成濃度1:1 (500mg/mL)，1:2(250mg/mL)，1:4 (125mg/mL) ,1:8(62.5mg/mL) ,1:16(31.25mg/mL)......1:256( 1 ·95mg/mL)共 10管。對照藥復(fù) 方一枝蒿的稀釋方法同濱蒿提取物。對照藥頭孢氨芐配制成12.5mg/mL的溶液，同理稀釋成 濃度1:1 (6· 25mg/mL)，1:2(3 · 125mg/mL)，1:4( 1 · 56mg/mL)，1:8(0 ·78mg/mL)，1:16(0· 39mg/ mL)……1: 256 (0.0024mg/mL)共10管。每組的第11管只加血清肉湯培養(yǎng)基做空白對照管，每 組的第12管不加菌液（乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌）加0. lmL藥液(各組對應(yīng)的藥液，比 如對照藥頭孢氨芐組的藥液為頭孢氨芐溶液)做對照，第13管不加藥液(各組對應(yīng)的藥液， 比如對照藥頭孢氨芐組的藥液為頭孢氨芐溶液)做菌液（乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌） 對照，第1號-10號管以及第13號每管分別加入O.lmL實驗用新鮮菌液，置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h，24h后觀察菌對照管的細菌生長情況，同時比對1號-12號試管每只試管上清渾濁度，搖 勻后，用10uL加樣器吸取少量劃平板，觀察是否有菌生長，觀察最低抑菌濃度(MIC)和最低 殺菌濃度(MBC)，并統(tǒng)計出MIC5Q和MBC5Q。濱蒿提取物、復(fù)方一枝蒿、頭孢氨芐對乙型溶血性 鏈球菌（乙型鏈球菌)和肺炎鏈球菌生長情況的影響如表1至表3所示，濱蒿提取物、復(fù)方一 枝蒿、頭孢氨芐對乙型溶血性鏈球菌（乙型鏈球菌）的MIC、MBC、MIC5Q和MBC5Q如表4所示，濱 蒿提取物、復(fù)方一枝蒿、頭孢氨節(jié)對肺炎鏈球菌的MIC、MBC如表5所不。表1至表3中，"一"表 示無菌生長，"+"表示有菌生長。表4和表5中，藥物濃度(藥濃，mg/mL))
[0045] 4實驗結(jié)果分析
[0046] 通過表4至表5可以看出，濱蒿提取物對乙型溶血性鏈球菌的MIC、MBC分別為 31.2511^/11^、62.511^/11^，其50%]\〇(：、50%]\^(：分別為7.811^/11^、15.611^/1111^復(fù)方一枝蒿對乙 型溶血性鏈球菌的MIC、MBC分別為250mg/mL、500mg/mL，其50%MIC、50%MBC分別為15.6mg/ mL、31 · 2mg/mL;頭孢氨節(jié)顆粒對乙型溶血性鏈球菌的MIC、MBC分別為0 · 19mg/mL、0 · 39mg/ mL，其50%MIC、50%MBC分別為0.048mg/mL、0.095mg/mL，說明濱蒿提取物具有較強的抗乙 型溶血性鏈球菌作用；濱蒿提取物對肺炎鏈球菌的MIC、MBC分別為15.63mg/mL、31.25mg/ mL，復(fù)方一枝蒿對肺炎鏈球菌的MIC、MBC分別為250mg/mL、500mg/mL，頭孢氨芐顆粒對肺炎 鏈球菌的MIC、MBC分別為0.019mg/mL、0.039mg/mL，說明濱蒿提取物具有較強的抗肺炎鏈球 菌作用。
[0047](二)抗炎實驗
[0048]雖然抗感染治療仍然是臨床上治療肺炎的主要措施，但研究顯示，現(xiàn)有的抗感染 治療措施不能進一步降低重癥肺炎的病死率。主要原因不僅是致病菌的作用，還有機體免 疫過程中引起的"炎癥瀑布效應(yīng)"。如何在抗感染治療的同時，積極探索其他輔助治療方法， 降低重癥肺炎的病死率，已成為近年來臨床研究的熱點。因此，臨床逐漸對非抗生素輔助治 療更加重視，如應(yīng)用抗炎藥物來減輕肺組織的炎性損傷等。中醫(yī)藥對重癥肺炎的炎性刺激 有明顯抑制作用，輔助西醫(yī)藥治療更有利于重癥肺炎的恢復(fù)及預(yù)后。由肺炎鏈球菌或/和乙 型溶血性鏈球菌引起的重癥肺炎，在機體免疫過程中也會激發(fā)"炎癥瀑布效應(yīng)"，最終可能 會導(dǎo)致胸膜炎、膿胸、心包炎、腦膜炎等并發(fā)癥的發(fā)生，因此，在給予抗感染治療的同時，積 極采取抗炎輔助治療就尤為重要。
[0049] 1體外實驗-濱蒿提取物的抗炎作用及抗炎機制
[0050] 本實驗以細菌脂多糖LPS誘導(dǎo)RAW 264.7小鼠巨噬細胞建立細胞炎癥模型，模擬體 內(nèi)炎癥反應(yīng)。
[0051 ] 1.1實驗材料
[0052] 1.1.1細胞小鼠單核巨噬細胞株1^1264.7購自中科院上海細胞庫(4了〇：)，用10% (熱滅火)胎牛血清、2Mm/L-glutamine、100yg/mL鏈霉素、100U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)液于37 °C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)(隔天傳代，細胞于對數(shù)生長期呈半貼壁狀態(tài)生長）。 [0053] 1.1.2試劑DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清購自Gibco公司；胰蛋白酶 Amreseo公司；Lipopolysaccharide(Escherichia coli 0111 :B4) ,Dexamethasone(Dex), Indometaxin(Indo,53-86-l) ,DCFH-DA(D6883) ,Hoechst 33342(B226lW^gSigma- △1扣化11(5七丄〇11丨8，]\10，1]54)。小鼠了陬-€[、11^-6、]\03-比1^154試劑盒均購自武漢華美生物科 技有限公司；PGE2Express EIA Kit購自Cayman Chemical Company(MI USA) ;LPS (Escherichia coli 0111 ;B4)和MTT為Sigma公司產(chǎn)品。NaN〇2,對氨基苯橫酰胺，天津市河 北區(qū)海晶精細化工廠;N-萘乙二胺鹽酸鹽，天津市化學(xué)試劑六廠，其他常用試劑均為國產(chǎn)分 析純；Anti-phospho-I-icBa(p-I-KBa) (Ser32)、Anti_NF-K：B p65(D14E12)XP?RabbitmAb、 Phosph〇-p44/42MAPK(p_ERKl/2)、TNF_aAntibody購自 Cel 1 Signaling(Beverley，ΜΑ， USA) ;Anti_GAPDH 購自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA，USA).Anti_IL- 6antibody ab6672貝勾自abeam;Goat Anti-Rabbit IgG,Biotin Conjugated , Streptavidin-HRP and eECL Western Blot Kit購自于康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。 Alexa Fluor 488Goat Anti-Rabbit IgG(A0423)購自于碧云天生物技術(shù)有限公司。
[0054] 1.2實驗方法
[0055] 1.2.1濱蒿提取物的抗炎作用-濱蒿提取物對LPS致RAW 264.7細胞急性炎癥的影 響
[0056] (1)細胞毒性測定
[0057] 取對數(shù)生長期的RAW 264.7細胞，用0.25 %胰蛋白酶消化，制成每mL含2 X 105個細 胞的單細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100yL，每孔含細胞數(shù)為2 X104,分組如表6 所示，待細胞80%-90%融合后，將培養(yǎng)液換成無血清的培養(yǎng)基，每孔190yL，12h后分別加入 不同濃度的樣品l〇yL(稀釋20倍），置37°C、5%的二氧化碳濃度的條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，然 后加入5mg/mL MTT 10yL，繼續(xù)培養(yǎng)，4h后棄去上清、每孔加入150yL DMS0,振搖至生成的藍 紫色甲瓚結(jié)晶完全溶解后，用微孔板檢測系統(tǒng)M5測定490nm處的吸光度值(0D值），各組的0D 值如表6所不。
[0058] (2)對LPS致RAW 264.7產(chǎn)生炎性介質(zhì)N0的影響
[0059] 取對數(shù)生長期的巨噬細胞RAW 264.7,按2X 105個/孔接種在96孔板中，每孔100μ L，待細胞80 % -90 %融合后，將培養(yǎng)液換成無血清的培養(yǎng)基，并加入濱蒿提取物孵育1小時， 然后加入終濃度為lyg/mL的LPS，同時設(shè)LPS模型組、空白對照組和吲哚美辛組，每組6個重 復(fù)孔。各組加劑量(yg/mL)如表7所示，置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后，吸取培養(yǎng)液上清lOOyL至 酶標(biāo)板中，加入等體積的Griess試劑(Griess試劑A:0.1 %N-萘乙二胺鹽酸鹽，溶于水； Griess試劑B:l%對氨基苯磺酰胺，溶于5%磷酸鹽溶液中；使用前等體積混合試劑A和試劑 B)。室溫反應(yīng)5min后測定540nm的吸光度值。用濃度為Ομπιο?/L、lymol/L、2 · 5ymol/L、10μ mol/L、20ymol/L、50ymol/L、100μ mol/L的亞硝酸鈉繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線 計算細胞培養(yǎng)上清液中N0的濃度，空白對照組、LPS模型組、吲哚美辛組和濱蒿提取物組的 NO濃度(μπιο 1 /L)如表7所示。在表7中，與空白對照組比較，##P〈0.01;與LPS模型組比較/P〈 0.05,**P<0.01〇
[0060] (3)對LPS致RAW 264.7產(chǎn)生R0S的影響
[0061] 實驗設(shè)空白對照組、LPS模型組、吲哚美辛組和濱蒿提取物組，細胞處理及給藥同 1.2.1(2)，置37°(：培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2411后，吸棄上清液，？83洗細胞3遍，加入終濃度為以1 DCFH-DA探針(PBS 1:1000稀釋）100yL，置37°C培養(yǎng)箱中孵育20min，M5檢測各孔的熒光強 度。空白對照組、LPS模型組、吲哚美辛組和濱蒿提取物組的熒光強度(R0S)如表7所示。在表 7中，與空白對照組比較，##P〈0.01;與LPS模型組比較/P〈0.05，》P〈0.01。
[0062] (4)對RAW 264.7細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-l、PGE2的影響
[0063] 實驗設(shè)空白對照組、LPS模型組、吲哚美辛組和濱蒿提取物組，細胞處理及給藥同 1.2.1 (2)，置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書方法進行測定， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組培養(yǎng)上清中TNF-a、IL-6、MCP-1、PGE2的濃度?？瞻讓φ战M、LPS模型 組、吲噪美辛組和濱蒿提取物組的TNF-aUL-6濃度(pg/mL)如表8所示，空白對照組、LPS模 型組J引噪美辛組和濱蒿提取物組的MCP-1、PGE2的濃度(pg/mL)如表9所示。在表8、表9中， 與空白對照組比較，##P〈〇. 01;與LPS模型組比較/P〈0.05，》P〈0.01。
[0064] 1.2.2濱蒿提取物的抗炎機制
[0065] ① Western Blot法檢測對口-1仙〇、？4服1/2、了陬-〇、幾-6蛋白表達的影響
[0066] 實驗方法：1)將狀態(tài)良好的RAW 264.7細胞分別接種于21個直徑為60mm的培養(yǎng)皿， 待細胞融合90 %時，將培養(yǎng)細胞隨機分為空白對照組、LPS模型組、LPS+吲哚美辛組（15yg/ mL)及LPS+濱蒿提取物組（12 · 5yg/mL、25yg/mL、50yg/mL、100yg/mL)，每組每個濃度3個培養(yǎng) 皿，將完全培養(yǎng)基換成不完全培養(yǎng)基，各組加入指定濃度的樣品預(yù)先孵育lh，空白及LPS模 型組給予DMEM培養(yǎng)液，然后除空白對照組外，每個皿加入終濃度為lyg/mL LPS的刺激RAW 264.7細胞。2)2411后，棄去培養(yǎng)上清，盡量吸棄干凈，每個皿加入15(^1^裂解液（1〇111111〇1/1 HEPES-K0H pH7.9,60mmol/L KCl，lmmol/L EDTA，lmmol/L DTT，0.4%NP-40，100mg/L PMSF)，冰上孵育5min，用細胞刮子將細胞刮下來收集于離心管中，4°C下12000g離心5min。 取上清液加1/4體積的5 X SDS-PAGE上樣液，沸水浴8min，放于-20°C保存待用。3)同時取5ul 上清液按照BCA蛋白質(zhì)檢測試劑進行蛋白濃度測定。用BCA蛋白定量試劑盒測定提取物蛋白 含量。4)SDS-PAGE電泳。上樣:每孔加樣量為40yg，并加有預(yù)染Marker作為指示。電泳:濃縮 膠中電壓為80V，分離膠中電壓為120V。根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的指示終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。5)轉(zhuǎn) 膜:采用PVDF膜，BI0-RAD電轉(zhuǎn)儀裝置，恒流200mA，冰水浴轉(zhuǎn)膜2h。6)封閉及雜交:轉(zhuǎn)膜完后， 將PVDF膜取出置封閉液(含5 % BSA的TBST)中37 °C孵育lh，加一抗(工作濃度1:1000) 37 °C孵 育2h，TBST洗4次，每次5min。加二抗(工作濃度1:800) 37 °C孵育lh，用TBST洗4次，每次5min。 7)發(fā)光鑒定:參照ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒操作手冊，主要步驟如下:將試劑A和試劑B等體積混 合，室溫放置lmin。加混合液于PVDF膜上，充分浸潤，然后爆片。8)凝膠圖像分析：用凝膠圖 象處理系統(tǒng)Quantity one software分析目標(biāo)條帶的光密度值?？瞻讓φ战M(cont)、LPS模 型組、LPS+吲噪美辛組（indometacin，IND0)及LPS+濱蒿提取物(BH)組的凝膠圖像如圖1?？?白對照組(cont)、LPS模型組、LPS+吲哚美辛組（indometacin IND0)及LPS+濱蒿提取物(BH) 組的口-1仙€[、1^狀1/2、了嚦-€[、幾-6的蛋白表達如圖2至圖5所示。在圖2至圖5中，與空白對 照組(Cont)比較，##P〈0 · 01。與LPS 模型組比較，*P〈0 · 05，**P〈0 · 01 0
[0067] ② RT-PCR 法檢測 TNF-α、IL_6mRNA 表達水平
[0068] 實驗方法：1)總RNA的抽提。細胞總RNA的提?。河肨RIZ0L試劑提取，按TRIZ0L試劑 說明書進行。細胞培養(yǎng)及加藥同1.2.2①。加 lmL TRIZ01于培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打，直至細胞完 全被消化。室溫靜置5min，加0.2mL氯仿，劇烈振動15s。室溫靜置5min，4°C、12000g離心 15min。取上層水相600yL于另一1.5mL EP管中，加600yL異丙醇，顛倒混勾。室溫靜置lOmin， 4°〇、1200(^離心1〇111；[11。去上清，加入冰預(yù)冷的75%乙醇1111匕4°0、750(^離心5111；[11。棄上清， 空氣干燥5min至lOmin。用30yL DEPC水溶解沉淀物。提取的總RNA用紫外分光光度測定其含 量和純度:0D260值 10D = 40yg RNA，要求0D260/0D280 2 1.80及0D260/0D280S2.1。
[0069] 2)逆轉(zhuǎn)錄。取2yg RNA作為模板合成cDNA，反應(yīng)體系（20yL)中包括：1XRT buffer， 0.5mM dNTPs，lyg Oligo d(T)18,400U M-MLV，40U RNA酶抑制劑。反應(yīng)程序：42°C逆轉(zhuǎn)錄 30min，然后85°C、5s滅活RNA酶。合成的cDNA儲存在-20°C備用。
[0070] 3)實時熒光定量PCR:使用高親合力雙鏈DNA結(jié)合染料SYBR green I在MX3000PT檢 測系統(tǒng)進行實時熒光定量PCRJSyL反應(yīng)液中包含：150ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，lyL Taq DNA 聚合酶（lunit/yL)，lXPCR反應(yīng)緩沖液，3mM MgC12,0.2mM dNTPs，SYBR Green I(20X) 0.25yL，1 Opmo 1 uPAR或GATOH上游及下游特異性引物。反應(yīng)程序為：94 °C預(yù)變性30S，94 °C變 性5S，55°C退火15S，72°C延伸10S，共39個循環(huán)，85°C8s，每個循環(huán)在85°C時檢測熒光強度。 空白對照組、LPS模型組、LPS+吲哚美辛組及LPS+濱蒿提取物組的TNF-amRNA表達水平如圖6 所示，空白對照組(c〇nt)、LPS模型組、LPS+吲噪美辛（IND0)組及LPS+濱蒿提取物(BH)組的 I L-6mRNA表達水平如圖7所示。
[0071] 引物由上海生工公司設(shè)計合成。引物序列：
[0072] 小鼠 GAPDH上游：5' -GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'，
[0073] GAPDH下游，5' -ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3';
[0074] IL-6上游，5' -CTGATGCTGGTGACAACCAC-3'，
[0075] IL-6下游，5' -TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3';
[0076] TNF-a上游，5' -CATGGATCTCAAAGACAACC-3'，
[0077] TNF-a下游，5' -GGTATATGGGCTCATACCAG-3'。
[0078]③免疫熒光染色法檢測濱蒿提取物對LPS致RAW 264.7細胞急性炎癥時NF-κΒ核轉(zhuǎn) 位的影響
[0079]實驗方法：1)將狀態(tài)良好的RAW 264.7細胞接種1塊96孔培養(yǎng)板，待細胞融合90% 時，將培養(yǎng)細胞隨機分為空白對照組、LPS模型組、LPS+吲哚美辛組（15yg/mL)及LPS+濱蒿提 取物組（12.5yg/mL、25yg/mL、50yg/mL、100yg/mL)，每組每個濃度4個重復(fù)，將完全培養(yǎng)基換 成不完全培養(yǎng)基，各組加入設(shè)定終濃度的樣品預(yù)先孵育2h，空白及LPS模型組給予DMEM培養(yǎng) 液。2)除空白對照組外，每孔加入終濃度為2yg/mL LPS，終體積為200yL，37°C孵育30min。3) 各孔吸棄l〇〇yL培養(yǎng)上清，再加入8%中性甲醛100μL7孔，固定30min。4)棄上清，加入0.1 % TritonlOOPBS溶液lOOyL/孔，37°C孵育30min并室溫放置卟。5)棄上清，加入3%BSA封閉，50 μ!7孔，37°C孵育卟。6)棄上清，加入NF-κΒ p65抗體(3%BSA按400:1稀釋），50yL/孔，室溫放 置lh，4°C過夜。7)回收一抗，用roS洗細胞3次，lOOyL/孔/次。8)二抗孵育，加入3 %BSA稀釋 的濃度為1.6yL/mL的綠色焚光二抗Alexa Fluor 488Goat Anti-Rabbit IgG，50yl/孔，室 溫避光孵育lh。9)回收抗體，0 . 1 % TWeen-20PBS洗3次，100μL7孔/次，棄上清，用 Hoechst33342染核（用PBS 1:1000稀釋），室溫孵育2〇11^11。10)棄上清，PBS洗細胞3次，100μ L/孔/次，最后加入200yL PBS，高內(nèi)涵儀器ARRAYSCAN VTI(Thermo SCIENTIFIC)檢測細胞 核及細胞漿內(nèi)綠色熒光強度?？瞻讓φ战M(cont)、LPS模型組、LPS+B引噪美辛（IND0)組及LPS +濱蒿提取物(BH)組的NF-κΒ核轉(zhuǎn)位如圖8所示。在圖8中，與空白對照組（Cont)比較，##P〈 0.01。與LPS 模型照組比較，*P〈0.05，**P〈0.01。
[0080] 1.2.3統(tǒng)計方法以上實驗數(shù)據(jù)以X土 S表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理。組間比 較用單因素方差分析(one-way AN0VA)，以P〈0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[00811 1.3實驗結(jié)果分析
[0082] 通過表6可以看出，濱蒿提取物在12.5yg/mL至100yg/mL的劑量時，濱蒿提取物對 RAW264.7細胞無明顯細胞毒作用；通過表7至表9可以看出，濱蒿提取物在劑量為12.5yg/ mL-100yg/mL時，可呈濃度依賴性地顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞產(chǎn)生炎癥因子TNF-α、 IL-6、MCP-1及炎癥介質(zhì)NO，顯著抑制PGE2及細胞內(nèi)活性氧自由基R0S的產(chǎn)生，說明濱蒿提取 物具有明顯的抗炎活性。
[0083]由圖1至圖5可見，濱蒿提取物呈劑量（12.5yg/mL至lOOyg/mL)依賴性地顯著抑制 RAW 264.7細胞急性炎癥時的TNF-a、IL-6、ρ-ΙκΒα、p-ERKl/2蛋白表達，通過圖6至圖7可知， 濱蒿提取物顯著抑制TNF-amRNA、IL-6mRNA表達;通過圖8可知，LPS模型組NF-κΒ發(fā)生了核轉(zhuǎn) 位，而濱蒿提取物呈劑量（12.5yg/mL至100yg/mL)依賴性地顯著抑制NF-κΒ核轉(zhuǎn)位，抑制其 活化。
[0084]通過體外實驗可知，濱蒿提取物在LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞炎癥模型中，可濃度依賴 性地顯著抑制炎性因子TNF-a、IL-6、MCP-l和PGE2的生成，顯著抑制炎癥介質(zhì)N0的生成及活 性氧自由基R0S的生成，可顯著降低TNF-a、IL-6蛋白和mRNA表達水平，顯著降低p-ERK 1 /2、 ρ-ΙκΒα蛋白表達水平，顯著抑制NF-κΒ核轉(zhuǎn)位，說明濱蒿提取物有顯著的抗炎作用，濱蒿提 取物通過抑制I_kB、ERK1/2的磷酸化，以劑量依賴的方式抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κΒ和ERK1/ 2MAPK的活化，從而減少TNF-a、IL-6等炎性因子及炎癥介質(zhì)的表達來發(fā)揮抗炎作用。其抗炎 作用與抑制NF-κΒ/ΜΑΡΚ信號通路的活化密切相關(guān)。
[0085] 2體內(nèi)抗炎實驗-濱蒿提取物對LPS致小鼠急性肺損傷的保護作用
[0086] 急性肺損傷(ALI)是多種因素(如感染、創(chuàng)傷等)直接或間接作用于肺臟導(dǎo)致的急 性、進行性缺氧性呼吸衰竭。LPS是ALI的重要致病因素之一，LPS作為革蘭氏陰性細菌細胞 壁外膜中以脂多糖為主的成分，在細菌繁殖或死亡時釋放到細胞外發(fā)揮致病效應(yīng)。由LPS所 致的ALI動物模型可表現(xiàn)出肺泡毛細血管損傷和彌漫性的肺泡損傷、中性粒細胞浸潤，并伴 有肺內(nèi)出血、水腫等。大量研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的ALI動物模型具有不會引起全身性炎癥反應(yīng) 和多器官衰竭的特點，因此，十分適用于藥物抗炎作用及機制的研究。由肺炎鏈球菌或/和 乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎也會導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷，本實驗以LPS所誘導(dǎo)的ALI小鼠模型 為載體，觀察濱蒿提取物對急性肺損傷小鼠的保護作用，探討其抗炎作用，可為該藥臨床用 于由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎的治療提供實驗依據(jù)。
[0087] 2.1實驗材料
[0088] 2.1.1受試藥物:濱蒿提取物(BH)，陽性對照藥地塞米松(DEX)。
[0089] 2.2.2實驗動物:雄性8六1^/(：小鼠，4-6周齡，體重188-2(^，由北京維通利華實驗動 物技術(shù)有限公司提供。
[0090] 2.2.3主要試劑
[0091] 內(nèi)毒素 LPS(055:B5)，Sigma公司；TNF-a、IL-6ELISA試劑盒，武漢華美公司；其他試 劑均為國產(chǎn)分析純。
[0092] 2.2實驗方法
[0093] 取雄性BALB/c小鼠120只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，依體重隨機均衡分為5組，即正常對 照組(0.5 %羧甲基纖維素鈉）、LPS模型組(0.5 %羧甲基纖維素鈉）、LPS+DEX(5mg/kg)組、 LPS+BH( 200mg/kg)組、LPS+BH( 400mg/kg)組。配藥:小鼠灌胃容積為10mL/kg，依據(jù)給藥劑量 計算出配藥濃度，采用0.5%羧甲基纖維素鈉制備成混懸液，對各實驗組小鼠進行灌胃給 藥。然后，在超凈工作臺內(nèi)，采用無菌生理鹽水溶解LPS，配制成終濃度為6mg/mL的溶液。除 正常對照組外，灌胃給藥1小時后，采用乙醚輕度麻醉小鼠，用移液槍吸取50yL濃度為6mg/ mL的LPS溶液滴鼻感染小鼠誘導(dǎo)肺損傷模型，6h后各實驗組再給藥一次。LPS刺激24小時后， [0094]①頸椎脫臼處死小鼠，每組取6只小鼠，用4°C預(yù)冷滅菌的PBS進行肺氣管插管灌 洗，每次〇. 3mL，反復(fù)沖洗3次后收集肺泡灌洗液于1.5mL EP管中，4°C，1500rmp離心10min， 回收上清置于_80°C冰箱保存待測TNF-a、IL-6炎癥因子的含量。正常對照組、LPS模型組、 DEX組和濱蒿提取物組的TNF-a、IL-6炎癥因子的含量(pg/mL)如表10所示，在表10中，與正 常對照組比較，##Ρ〈〇.〇1，與模型組比較，》Ρ〈〇.〇1。數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，組 間比較采用單因素方差分析/P〈〇. 05有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0095]②采用50yL預(yù)冷滅菌ros重懸灌洗液離心后收集的細胞，統(tǒng)計細胞總數(shù);細胞總數(shù) 進行涂片，用瑞氏-姬姆薩染色法統(tǒng)計中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)。正常對照組、LPS模型組、 DEX組和濱蒿提取物組的白細胞總數(shù)、巨噬細胞數(shù)和中性粒細胞數(shù)（X106)如表11所示，表 11中，與正常對照組比較，##Ρ〈〇.〇1，與模型組比較，，〈0.05，*叩〈0.01。數(shù)據(jù)用3?3317.0軟 件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，P〈〇.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0096]③每組再另取6只小鼠，摘取肺組織，并去除結(jié)締組織和脂肪，左肺裝入5mL離心管 稱濕重，然后置烘箱80°C烘烤48小時，稱干重以計算肺的濕干重比，肺濕干重比率=肺組織 濕重/干重。正常對照組、LPS模型組、DEX組和濱蒿提取物組肺濕干重比如表12所示，表12 中，與正常對照組比較，##Ρ〈〇.〇1，與模型組比較，，〈0.05，*叩〈0.01。數(shù)據(jù)用3?3317.0軟件 進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，P〈〇.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0097]④取右肺中葉固定在4%的甲醛溶液中，用于病理切片分析。正常對照組(Cont)、 LPS 模型組、LPS+DEX( 5mg/kg)組、LPS+BH( 200mg/kg)組、LPS+BH( 400mg/kg)組的肺部病理如 圖9(200X)所示。
[0098] 2.3實驗結(jié)果分析
[0099]通過表10可以看出，LPS刺激24h后，LPS模型組小鼠肺泡灌洗液中的促炎癥因子 TNF-a、IL-6水平顯著升高，陽性對照藥地塞米松可顯著降低TNF-a、IL-6水平，濱蒿提取物 在400mg/kg的劑量也可顯著降低TNF-a、IL-6水平。
[0100]通過表11可以看出，LPS刺激24h后，LPS模型組小鼠肺泡灌洗液中的白細胞總數(shù)顯 著升高，中性粒細胞數(shù)及巨噬細胞數(shù)也顯著升高。陽性對照藥地塞米松可顯著降低白細胞 總數(shù)，中性粒及巨噬細胞數(shù)，濱蒿提取物低、高劑量也可濃度依賴性地顯著降低炎癥細胞的 數(shù)目，說明濱蒿提取物對急性肺損傷小鼠具有抗炎保護作用。
[0101] 通過表12可以看出，LPS刺激24h后，LPS模型組小鼠的肺濕干重比顯著升高，說明 急性肺損傷模型成立，肺部出現(xiàn)明顯水腫等炎性變化，陽性對照藥地塞米松可顯著降低肺 濕干重比，濱蒿提取物低、高劑量組可濃度依賴性地顯著降低肺濕干重比。
[0102] 通過圖9可以看出，LPS刺激24h后，LPS模型組小鼠肺組織出現(xiàn)了典型的急性肺損 傷病理改變，包括:肺泡結(jié)構(gòu)破壞、中性粒細胞浸潤、肺泡出血和肺間質(zhì)水腫。陽性對照藥地 塞米松組小鼠的肺組織病變程度較輕，基本趨于正常。濱蒿提取物低、高劑量給藥組可濃度 依賴性地改善急性肺損傷肺組織病理變化。
[0103] 通過體內(nèi)實驗，說明濱蒿提取物可顯著降低LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型的肺 濕干重比，顯著降低肺泡灌洗液中的白細胞總數(shù)、中性粒及巨噬細胞數(shù)，還可顯著降低肺泡 灌洗液中炎癥因子TNF-a、IL-6水平，并對肺組織病理變化具有顯著改善作用，說明濱蒿提 取物對小鼠急性肺損傷具有顯著的保護作用。
[0104] (三)酶學(xué)實驗一濱蒿提取物對環(huán)氧化酶COX-1、C0X_2的抑制作用
[0105] 環(huán)化氧酶C0X-1和C0X-2分別由兩個獨立的基因編碼，兩者在結(jié)構(gòu)上有60%的同源 性。C0X-1在人體多數(shù)組織中持續(xù)表達，對外界刺激不敏感，維護機體正常的生理功能，發(fā)揮 保護作用;而C0X-2是一種誘導(dǎo)型酶，多數(shù)正常組織中無法檢測到，但可被多種刺激因素，如 細胞因子、絲裂原、誘癌劑等誘導(dǎo)而表達。因此，C0X-2在某一組織內(nèi)異常增高預(yù)示著炎癥的 發(fā)展，而是否能抑制C0X-2也成為目前抗炎藥物的判斷標(biāo)尺之一。目前，大多數(shù)傳統(tǒng)的抗炎 藥物對C0X-1和C0X-2均有抑制作用，有的藥物是選擇性的抑制C0X-2。因此，我們檢測濱蒿 提取物對C0X-UC0X-2活性的抑制效果，進一步明確濱蒿提取物的抗炎作用機制，即濱蒿提 取物是否可以通過調(diào)控炎癥反應(yīng)中的限速酶，對炎癥起到控制作用。
[0106] 1實驗材料
[0107] COX Fluorescent Inhibitor Screening Assay Kit貝勾自Cayman Chemical Company(MI USA)〇
[0108] 2實驗方法
[0109] 稱取濱蒿提取物樣品溶于DMSO中配制成濃度為200mg/mL的母液，采用蒸餾水倍比 稀釋成1〇〇1^/11^、5(^8/1111^、25以8/1]11^、12.5以8/1111^、6.25以8/1111^、3.125以8/1111^的一系列濃度，按 照試劑盒說明書方法操作，采用微孔板檢測系統(tǒng)(Molecular Devices，M5)檢測熒光強度 值，激發(fā)波長535nm，吸收波長590nm。濱蒿提取物對C0X-1酶的抑制活性如表13所示，濱蒿提 取物對C0X-2酶的抑制活性如表14所示。
[0110] 3.實驗結(jié)果分析
[0111] 通過表13至表14可以看出，濱蒿提取物呈劑量(3.125yg/mL至100yg/mL)依賴性地 抑制C0X-1 和C0X-2的活性，IC5Q分別為5 · 8yg/mL、4· lyg/mL。
[0112] 通過酶學(xué)實驗，環(huán)氧化酶⑶Χ-l和⑶X-2是抗炎藥物的一個作用靶點，濱蒿提取物 對該靶點具有較好的抑制作用。
[0113] 綜上所述，本發(fā)明首次公開了濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型 溶血性鏈球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用;通過體外抗菌實驗?zāi)軌蛘f明濱蒿提取物具有顯著抑 制肺炎鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌生長的作用，通過抗炎實驗?zāi)軌蛘f明濱蒿提取物具有抗 炎活性，同時，濱蒿提取物對小鼠肺損傷模型具有保護作用；由上述能夠說明濱蒿提取物對 由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎具有治療作用，從而為由肺炎鏈球菌或/ 和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎的治療提供了新途徑。
[0114] 以上技術(shù)特征構(gòu)成了本發(fā)明的實施例，其具有較強的適應(yīng)性和實施效果，可根據(jù) 實際需要增減非必要的技術(shù)特征，來滿足不同情況的需求。
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【主權(quán)項】
1. 一種濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈球菌引起的肺炎藥 物的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈 球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用，其特征在于濱蒿提取物中的黃酮類成分的質(zhì)量百分比為25% 至 75%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性 鏈球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用，其特征在于藥物的劑型為藥學(xué)上可接受的劑型。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的濱蒿提取物作為制備治療由肺炎鏈球菌或/和乙型溶血性鏈 球菌引起的肺炎藥物的應(yīng)用，其特征在于藥學(xué)上可接受的劑型為片劑或顆粒劑或口服液或 注射劑。
【文檔編號】A61P31/04GK105832793SQ201610350487
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】黃華, 王林林, 王雪, 司麗君, 楊巧麗, 史玉柱, 馬雪萍, 姚華, 劉燕, 徐芳
【申請人】新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所