水蛭的全唾液提取物的制作方法
【專利說(shuō)明】水蛭的全唾液提取物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年9月21日提交的美國(guó)申請(qǐng)No. 13/624,847的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng) 要求2012年9月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/701，735的權(quán)益，每份申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容 均以引用方式并入本文。 【背景技術(shù)】 技術(shù)領(lǐng)域
[0003]
[0004] 本文提供的教導(dǎo)總體涉及分離以及使用水蛭的全唾液提取物來(lái)治療受試對(duì)象的 方法。
[0005] 相關(guān)領(lǐng)域的描沐
[0006] 人類使用水蛭的歷史可以追溯至幾千年前，并且實(shí)際上所有的人類文化都描述了 水蛭治療多種疾病的用途。不幸的是，至少由于缺乏對(duì)與此用途相關(guān)的化學(xué)和機(jī)制的了解， 目前最先進(jìn)的技術(shù)仍不能成功地商業(yè)化水蛭唾液提取物在治療疾病中的用途。
[0007] 曾經(jīng)嘗試殺死水蛭以便由水蛭的全身、由水蛭的頭或由它們的唾液腺提取活性化 合物。很多研宄已經(jīng)定向于識(shí)別水蛭唾液提取物中的蛋白質(zhì)。但是，可能除了分離和使用 水蛭素作為抗凝劑，這些努力都不能再現(xiàn)使用完整活水蛭的作用。
[0008] 已經(jīng)嘗試不殺死水蛭，而是由活水蛭提取很多的稀釋的唾液溶液。不幸的是，這 些努力面臨2個(gè)主要的問(wèn)題：（i)唾液移出需要手工擠壓水蛭，這樣是不容易升級(jí)的；以及 (ii)唾液保持稀釋的，其僅可以新鮮使用，并且任何凍干法的嘗試都將降低或完全消除水 蛭唾液提取物的治療活性。這樣，劑量依賴的治療或者高濃度下的適量不可用于測(cè)試。
[0009] 任一技術(shù)人員都將欣賞（i)分離活性的精制的水蛭唾液提取物（LSE)的方法，所 述的水蛭唾液提取物可以成功地儲(chǔ)存數(shù)月或者甚至幾年；（ii)再利用水蛭以生產(chǎn)LSE的 方法；（iii)使水蛭的分離和再利用商業(yè)化達(dá)到可升級(jí)的量（其實(shí)際用于商業(yè)化）的方法， (iv)使用LSE質(zhì)粒實(shí)體腫瘤的方法；（V)使用LSE治療液體腫瘤的方法；(vi)使用LSE質(zhì) 粒糖尿病的方法；(vii)使用LSE治療病毒的方法；(viii)使用LSE治療寄生蟲疾病的方 法；（ix)使用LSE作為抗氧化劑的方法；以及（X)使用LSE作為抗細(xì)菌劑的方法。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本文提供的教導(dǎo)總體涉及分離和使用水蛭全唾液提取物治療受試對(duì)象的方法。提 供包含水蛭提取物和藥物可接受的載體的藥物配制物。
[0012] 所述的教導(dǎo)包含由水蛭移出全唾液的方法。在這些實(shí)施方案中，所述的方法可以 包含向水蛭提供取食刺激（取食刺激）劑；誘導(dǎo)水蛭反芻，所述的誘導(dǎo)包含將水蛭置于溫度 低于大約o°c的環(huán)境下；以及在冷卻水蛭的反芻中收集未精制的全唾液。
[0013] 所述的教導(dǎo)包含建立水蛭的凍干的全唾液提取物（具有改善的穩(wěn)定性）的方法。 在這些實(shí)施方案中，所述的方法包含向水蛭提供取食刺激劑；誘導(dǎo)水蛭反芻，所述的誘導(dǎo)包 含將水蛭置于溫度為大約-5°C至大約15°C的環(huán)境下；在冷卻水蛭的反芻中收集未精制的 全唾液；由未精制的全唾液移出固體成分以建立精制的全唾液；以及凍干分離體積的精制 的全唾液提取物，所述的體積均不超過(guò)大約2ml。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，所述的收集包含擠壓水蛭以增加所收集的未精制的全唾液的 量。在一些實(shí)施方案中，所述的方法進(jìn)一步包含通過(guò)將水蛭在溫度為大約5°C至大約40°C 的水浴中溫暖來(lái)復(fù)蘇水蛭。在一些實(shí)施方案中所述的方法進(jìn)一步包含建立精制的全唾液提 取物；所述的建立包含由未精制的全唾液移出固體成分。在一些實(shí)施方案中，所述的方法進(jìn) 一步包含凍干分離體積的精制的全唾液提取物，所述的體積均不超過(guò)大約2ml。并且在一些 實(shí)施方案中所述的水輕為菲牛輕（irudinaria manillensis)。
[0015] 所述的教導(dǎo)包含水蛭的穩(wěn)定的凍干的全唾液提取物。在這些實(shí)施方案中，所述的 提取物包含體積均不超過(guò)大約2ml的水蛭的、精制的凍干全唾液提取物，所述的提取物是 通過(guò)由未精制的全唾液移出固體成分而精制的，從而建立精制的全唾液；其中當(dāng)將所述的 提取物在溫度低于大約_20°C下儲(chǔ)存以用于使用時(shí)，其具有穩(wěn)定的活性，所述的提取物保持 至少70%的活性達(dá)至少6個(gè)月。并且所述的水蛭可以為菲水蛭。
[0016] 提供給藥有效量的水蛭提取物來(lái)治療受試對(duì)象的方法。在一些實(shí)施方案中，所述 的方法包含治療實(shí)體腫瘤、治療液體腫瘤、治療糖尿病、治療病毒疾病、治療寄生蟲疾病、治 療細(xì)菌疾病或者給藥抗氧化劑治療。應(yīng)該理解的是各治療還涉及受試對(duì)象中可以理想地治 療的其他狀況。
[0017] 附圖簡(jiǎn)述
[0018] 圖1示出了根據(jù)一些實(shí)施方案使，用膜向水蛭提供取食刺激劑的方法。
[0019] 圖2A-2C示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，未精制的全唾液提取物的收集。
[0020] 圖3示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，精制的水蛭唾液提取物的UV光譜。
[0021] 圖4示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，Bradford蛋白比色檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0022] 圖5示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，使用Laemmli SDS-PAGE15%凝膠電泳得到的馬來(lái) 西亞水蛭（菲水蛭）的LSE蛋白質(zhì)分子量分布結(jié)果。
[0023] 圖6示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，使用Laemmli SDS-PAGE15%凝膠電泳得到的馬來(lái) 西亞水蛭（菲水蛭）的LSE蛋白質(zhì)分子量分布結(jié)果，其中所述的LSE是使用丙酮沉淀而濃 縮的。
[0024] 圖7示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，使用Laemmli SDS-PAGE15%凝膠電泳得到的馬來(lái) 西亞水蛭（菲水蛭）的LSE蛋白質(zhì)分子量分布結(jié)果，其中所述的LSE是使用三氯乙酸（TCA) 沉淀由溶液沉淀得到的。
[0025] 圖8示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，使用Non-Urea SDS-PAGE凝膠電泳得到的馬來(lái)西 亞水蛭（菲水蛭）的LSE蛋白質(zhì)分子量分布結(jié)果。
[0026] 圖9示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，使用麥黃酮SDS-PAGE凝膠電泳得到的馬來(lái)西亞水 蛭（菲水蛭）的LSE蛋白質(zhì)分子量分布結(jié)果。
[0027] 圖IOA和IOB示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，在LSE分析中RP-HPLC的結(jié)果。
[0028] 圖11示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，使用RP-HPLC的LSE蛋白質(zhì)的分離。
[0029] 圖12示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，使用麥黃酮SDS-PAGE凝膠電泳的2種分離蛋白 質(zhì)的分子量。
[0030] 圖13示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，LSE相對(duì)于抗凝血酶活性的IC50。
[0031] 圖14示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，凝血酶時(shí)間與LSE蛋白質(zhì)濃度之間的關(guān)系。
[0032] 圖15示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，凍干條件和儲(chǔ)存條件對(duì)LSE的活性和穩(wěn)定性的影 響。
[0033] 圖16示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，凍干時(shí)間對(duì)LSE抗凝血酶活性的影響。
[0034] 圖17示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，光照和容器對(duì)在室溫下儲(chǔ)存至多7天的LSE樣品 (凍干的和非凍干的）的影響。
[0035] 圖18示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，儲(chǔ)存溫度、光照和容器對(duì)在4°C下至多180天的 LSE樣品（凍干的和非凍干的）的抗凝血酶活性的影響。
[0036] 圖19示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，容器和凍干對(duì)在_20°C下至多180天的LSE樣品 的抗凝血酶活性的影響。
[0037] 圖20示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，LSE顯示對(duì)人類小細(xì)胞肺癌（SW1271細(xì)胞系）具 有明顯的抗增殖活性。
[0038] 圖21和22示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，LSE與依立替康或卡波鉑的混合物的細(xì)胞 毒作用。
[0039] 圖23和24示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，在正常和糖尿病大鼠中，在不同的時(shí)間間隔 下不同劑量的LSE和胰島素對(duì)禁食血糖（mmol/L)的影響。
[0040] 圖25示出了根據(jù)一些實(shí)施方案，LSE對(duì)糖尿病的發(fā)作具有預(yù)防作用。
[0041] 圖26和27根據(jù)一些實(shí)施方案，比較了 LSE與L-抗壞血酸（維生素 C)的自由基 清除活性。
[0042] 發(fā)明詳述
[0043] 本文提供的教導(dǎo)總體涉及分離和使用水蛭全唾液提取物治療受試對(duì)象的方法。提 供了包含水蛭提取物和藥物可接受的載體的藥物配制物。
[0044] 應(yīng)該理解的是術(shù)語(yǔ)"提取物"可以用于指粉末形式的所關(guān)注的化合物、液體形式的 所關(guān)注的化合物或者粉末或液體形式的所關(guān)注的化合物的任意一種或任意組合。任一技 術(shù)人員將理解的是術(shù)語(yǔ)"提取物"可以用于指在由水蛭移出之前、移出過(guò)程中或移出之后所 關(guān)注的化合物。在一些實(shí)施方案中，所關(guān)注的化合物可以使用任一技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方 法來(lái)化學(xué)合成，使得它們可以由那些技術(shù)人員在不使用本文所教導(dǎo)的提取方法的情況下單 獨(dú)或者以任意的組合來(lái)合成并使用。本文提供的組合物可以指提取物、組合物、化合物、試 劑、活性劑、生物活性劑、補(bǔ)充劑、藥品等。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"LSE"、"提取物"、"LSE 組合物"、"組合物"、"化合物、"試劑"、"活性"、"活性劑"、"生物活性劑"、"補(bǔ)充劑"和"藥品" 可以交換使用，并且應(yīng)該理解的是"配制物"可以包含這些物質(zhì)的任意一種或任意的組合。 類似地，在一些實(shí)施方案中，所述的組合物還可以為液體或干燥形式，其中在一些實(shí)施方案 中，干燥形式可以為粉末形式，液體形式可以包含水性或非水性成分。此外，術(shù)語(yǔ)"活性"或 "生物活性"可以指化合物在體外（例如在檢驗(yàn)中）或者在體內(nèi)（在給藥受試對(duì)象時(shí)）的功 能。
[0045] 應(yīng)該理解的是水蛭提取物可以是分離的或純化的。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"分離 的"和"純化的"可以交換使用。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"分離的"可以用于指提取物由水 蛭的天然化學(xué)環(huán)境中移出，使得該提取物并非為其天然存在的形式。應(yīng)該理解的是術(shù)語(yǔ)"純 化的"在一些實(shí)施方案中可以用于指由菲牛蛭水蛭得到的提取物，使得所關(guān)注的化合物以 可以給藥受試對(duì)象的形式（例如可溶形式）或者可以進(jìn)入到水性溶液中的形式與水蛭的其 余部分分離。這樣，任一技術(shù)人員將理解的是所關(guān)注的化合物有時(shí)可以伴有其他成分（其 與提取物一起攜帶）。例如此類其他的成分可以包含在水蛭中發(fā)現(xiàn)具有活性的任意一種蛋 白質(zhì)或者此類蛋白質(zhì)的任意組合。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"純化的"可以用于指這樣的提 取物，其由或者基本上由所關(guān)注的任意一種化合物或該化合物的任意組合組成。在一些實(shí) 施方案中，所述的提取物包含取食刺激溶液或由取食刺激溶液得到的成分。在一些實(shí)施方 案中，提取物"基本上由以下組成":所關(guān)注的任意一種化合物或該化合物的組合，其中由水 蛭或提取過(guò)程得到的任意其他的成分的存在都對(duì)所關(guān)注的化合物的活性具有微不足道的 影響。術(shù)語(yǔ)"微不足道的影響"可以用于指當(dāng)分別與所關(guān)注的任意一種化合物（不具有其 他成分）或該化合物的任意組合（不具有其他成分）相比時(shí)，活性未升高或降低超過(guò)大約 10%。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"微不足道的影響