一種具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)學(xué)與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗凝血性能 的去細(xì)胞化肝臟生物支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝臟是人體十分重要的器官，被譽(yù)為人體的"解毒工廠、代謝化工廠"，但當(dāng)其受到 病毒、酒精、藥物等多種因素嚴(yán)重侵害時(shí)，會(huì)造成肝細(xì)胞大量壞死，導(dǎo)致肝臟功能衰竭。迄今 為止，受到供體器官短缺、手術(shù)過(guò)程繁復(fù)等特征制約的肝臟移植是臨床上唯一有效的根治 肝臟功能衰竭的方法。組織工程肝臟作為肝臟移植的潛在替代治療手段，正在逐漸受到重 視。其中，肝臟支架材料的質(zhì)量是制備組織工程肝臟的核心要素之一。
[0003] 去細(xì)胞化肝臟生物支架，具有與原肝臟相同的基質(zhì)成分（如膠原、纖連蛋白、彈力 蛋白等）和三維立體微結(jié)構(gòu)，同時(shí)含有豐富的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，是一種優(yōu)秀的天然生 物支架材料，與人工合成材料相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，是構(gòu)建具有臨床應(yīng)用前景的理想肝臟支 架材料來(lái)源。目前制備去細(xì)胞化肝臟生物支架的文獻(xiàn)，大多是灌注肝臟直接去細(xì)胞化即可， 以獲得完整的細(xì)胞外支架網(wǎng)絡(luò)。然而，單純?nèi)ゼ?xì)胞化的去細(xì)胞化肝臟生物支架血液相容性 較差，在臨床治療中容易形成血栓。
[0004] 通過(guò)對(duì)去細(xì)胞化肝臟支架進(jìn)行灌注抗凝修飾，可以提高去細(xì)胞化肝臟生物支架的 血液相容性，但是由于去細(xì)胞化肝臟支架的三維結(jié)構(gòu)和血管網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，要制備得到的 抗凝能力強(qiáng)、支架各個(gè)部分抗凝效果均一、而且抗凝時(shí)間長(zhǎng)的去細(xì)胞化支架材料非常難，已 有的修飾方法復(fù)雜、制備成本高，而且抗凝血效果還不理想。
[0005] 如，公開(kāi)號(hào)為101850136的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了層層自組裝修飾豬肝去細(xì)胞化支架材 料，以提高抗凝性能的方法，但是其需要用兩種溶液和一種洗滌液分別交替灌注八次，在交 替灌注過(guò)程中容易在灌注液中混入氣泡，特別是對(duì)于大器官（如豬肝，豬腎）在高流速灌注 時(shí)，溶液交替過(guò)程中很容易混入氣泡，導(dǎo)致灌注修飾過(guò)程失?。煌瑫r(shí)，修飾后肝素含量最多 只能達(dá)到12 μ g/mg組織干重，抗凝效果不佳，且修飾后肝素與材料是依靠靜電力結(jié)合，結(jié) 合不夠牢固，釋放速度快，24小時(shí)釋放量達(dá)到50%以上，無(wú)法長(zhǎng)期抗凝。
[0006] 另外，Chen-Chi Tsai etal. "Effects of heparin immobilization on the surface characteristics of a biological tissue^fixed with a naturally occurring crosslinkingagent (genipin) : an in vitro study''，Biomaterials 22 (2001) 523-533、孫 赳等，"肝素末端結(jié)合修飾豬肝去細(xì)胞化支架材料的抗凝性能研宄"生物醫(yī)學(xué)工程與臨床 2014年5月第18卷第3期、吳瓊等"肝素層層自組裝修飾豬肝去細(xì)胞化支架材料的抗凝血 性能研宄"，北京：中國(guó)科技論文在線，2014-3-19等許多文獻(xiàn)均提供了對(duì)肝臟切片進(jìn)行肝素 化修飾的方法，具體是將肝臟切片浸泡在肝素溶液中進(jìn)行修飾，但是由于去細(xì)胞化肝臟支 架的三維結(jié)構(gòu)和血管網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，簡(jiǎn)單浸泡根本無(wú)法達(dá)到目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種制備過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低廉的具有抗凝血性能的去細(xì)胞 化肝臟生物支架及其制備方法。
[0008] 本發(fā)明提供了一種具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架的制備方法，它包括 如下步驟：
[0009] (a)取去細(xì)胞化肝臟生物支架，用含有肝素和/或肝素鹽的溶液灌注，灌注的速度 是80-150mL/min，灌注的時(shí)間是5-12小時(shí)；
[0010] (b)滅菌，即可。
[0011] 去細(xì)胞化肝臟生物支架，是通過(guò)去細(xì)胞化技術(shù)建立的完整保留肝臟三維結(jié)構(gòu)和脈 管系統(tǒng)的肝臟生物支架。
[0012] 優(yōu)選地，步驟a)中，所述去細(xì)胞化肝臟生物支架是用1% TritonX-IOO溶液和1% SDS溶液去細(xì)胞化處理得到的去細(xì)胞化肝臟生物支架。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述去細(xì)胞化肝臟生 物支架按照如下方法制備：取離體肝臟，用1%的Triton X-100溶液以200mL/min流速灌 注3h，再用1 % SDS溶液以200mL/min流速灌注6h，最后用1 % Triton X-100溶液和去離 子水灌洗去除殘留SDS，獲得去細(xì)胞化豬肝臟生物支架。
[0013] 優(yōu)選地，步驟（a)中，所述含有肝素和/或肝素鹽的溶液中，肝素或肝素鈉的濃度 為1-3. 3g/L。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述含有肝素和/或肝素鹽的溶液中，肝素或肝素鈉的濃度為 3. 3g/L〇
[0014] 優(yōu)選地，所述含有肝素和/或肝素鹽的溶液中還含有亞硝酸鈉、NaBH3CN和NaCl， 它們的濃度依次為亞硝酸鈉33mg/L、NaBH 3CN 10mg/L、NaCl 0.15mol/L。
[0015] NaBH3CN :氰基硼氫化鈉。
[0016] 優(yōu)選地，步驟（a)中，所述灌注為循環(huán)灌注。
[0017] 循環(huán)灌注：是從肝門(mén)靜脈灌流進(jìn)入的灌流液從肝上下腔流出后，又繼續(xù)從肝門(mén)靜 脈灌流進(jìn)入，循環(huán)使用。
[0018] 優(yōu)選地，步驟（a)中，所述灌注的速度為100mL/min，灌注的時(shí)間為5-8小時(shí)。進(jìn)一 步優(yōu)選地，所述灌注的速度為100mL/min，灌注的時(shí)間為6小時(shí)。
[0019] 優(yōu)選地，步驟（a)中，灌注時(shí)，環(huán)境溫度為室溫。
[0020] 室溫：指 15 ~25 °C。
[0021] 優(yōu)選地，步驟（b)中，所述滅菌采用含有抗生素的PBS溶液灌注，所述抗生素為青 霉素/鏈霉素、氟康唑或甲硝唑。其中，所述灌注的速度為100-300mL/min，灌注的時(shí)間為 6-24小時(shí)。優(yōu)選地，所述灌注的速度為200mL/min，灌注的時(shí)間為6小時(shí)。所述含有抗生素 的PBS溶液是含有青霉素/鏈霉素的PBS溶液，其中，青霉素的終效價(jià)為100U/mL，鏈霉素的 終濃度為100 μ g/mL。
[0022] 本發(fā)明還提供了前述任意一項(xiàng)方法制備的具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物 支架。
[0023] 本發(fā)明方法制備簡(jiǎn)便、成本低廉，不僅可以用于豬肝臟，而且可以適用于各種與豬 肝臟規(guī)格相近的大型動(dòng)物肝臟，如人、猴、狗的肝臟，具有應(yīng)用的廣泛性。
[0024] 本發(fā)明提供的制備具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架的方法，抗凝修飾過(guò) 程中只使用一種灌流液，修飾過(guò)程的操作簡(jiǎn)化，無(wú)交替灌流過(guò)程，避免了在氣泡問(wèn)題；修飾 后肝素含量高，最高能達(dá)到20 μ g/mg組織干重；修飾后去細(xì)胞化肝臟生物支架表面均勻肝 素化，支架各個(gè)部分的抗凝作用均一；并且末端修飾后，肝素與材料是形成共價(jià)結(jié)合，結(jié)合 牢固，釋放速度緩慢，24小時(shí)釋放量?jī)H為20%左右，利于長(zhǎng)期抗凝。
[0025] 本發(fā)明方法制備得到的具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架，保持了去細(xì)胞 化肝臟生物支架上特定的微結(jié)構(gòu)，具有抗凝血性能強(qiáng)、免疫原性低等特點(diǎn)，對(duì)種植于其上的 細(xì)胞的生存、分化和增殖等起到了極為重要的支撐作用，能夠用于體內(nèi)組織重建，為構(gòu)建具 有臨床應(yīng)用價(jià)值的異源性組織工程化生物抗凝支架提供了一種方便廉價(jià)的來(lái)源。
[0026] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0027] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1未去細(xì)胞化豬肝（圖1A)和去細(xì)胞化豬肝支架（圖1B)的HE染色結(jié)果。
[0029] 圖2未去細(xì)胞化豬肝（1、3、5、7、9和11泳道）和去細(xì)胞化豬肝支架（2、4、6、8、10 和12泳道）樣品DNA經(jīng)過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的豬特異性DNA片段電泳結(jié)果。
[0030] 圖3未修飾的去細(xì)胞化豬肝支架（圖3A)和經(jīng)過(guò)肝素化全肝修飾的去細(xì)胞化支架 (圖3C)的甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果和未修飾的去細(xì)胞化豬肝支架（圖3B)和經(jīng)過(guò)肝素化全肝修 飾的去細(xì)胞化支架（圖3D)的掃描電鏡結(jié)果。
[0031] 圖4豬肝支架各部位的肝素定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0032] 圖5三種肝素化修飾材料中的肝素定量試驗(yàn)結(jié)果（圖5A)和肝素釋放量結(jié)果（圖 5B和圖5C)。
[0033] 圖6肝素化修飾的三種凝血檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果。
[0034] 圖7三種肝素化修飾方法在豬體內(nèi)進(jìn)行血液灌注實(shí)驗(yàn)照片（圖7A、圖7B和圖7C) 和HE染色結(jié)果（圖7D)。
[0035] 圖8大鼠原代肝細(xì)胞（圖8A和圖8B)和人臍帶血靜脈細(xì)胞（圖8C和圖8D)種植 在肝素化修飾材料表面的HE染色結(jié)果和免疫組化PCNA染色結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面以實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。
[0037] 本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)試劑與儀器如下：
[0038] 實(shí)驗(yàn)用巴馬香豬由四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)