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      一種具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架及其制備方法_2

      文檔序號(hào):8518527閱讀:來(lái)源:國(guó)知局
      物中心提供,3月齡,體重15-25千 克;肝素鈉(成都市科龍化工試劑廠);1-(3_二甲氨基丙基)_3乙基碳二亞胺(l-ethyl-3 -3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride,EDC,日本 T0SHIMA 公司);聚二甲 基二稀丙基氯化按(polyelectrolyte polydiallydimethylammonium chloride,PDADMAC, 美國(guó)SIGEMA-ALDRIH公司);氰基硼氫化鈉(NaBH3CN,成都市科龍化工試劑廠);
      [0039] 酶標(biāo)儀(ΒΙ0ΤΕΚ,美國(guó));CA-50半自動(dòng)血凝儀(SYSMEX,日本)。
      [0040] 實(shí)施例1本發(fā)明具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架的制備
      [0041] I、實(shí)驗(yàn)方法
      [0042] (1)獲取去細(xì)胞化豬肝臟生物支架
      [0043] 本發(fā)明去細(xì)胞化肝臟生物支架可以以豬離體肝臟為原材料,采用常規(guī)的去細(xì)胞化 方法處理得到,比如,可以按照如下方法制備:
      [0044] 從體重15_25kg實(shí)驗(yàn)用巴馬香豬上取出肝臟,行0. 1%乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acid, EDTA)液體灌注至肝臟內(nèi)血液完全流盡,得豬離體肝臟,_20°C 保存。
      [0045] 取豬離體肝臟,4°C解凍,用1 % Triton X-100溶液以200mL/min流速灌注3h,1 % 十二烷基磺酸鈉 (sodium dodecylsulphate,SDS)溶液以200mL/min流速灌注6h,之后用 1% Triton X-100溶液和去離子水灌洗去除殘留SDS,獲得去細(xì)胞化豬肝臟生物支架。
      [0046] (2)抗凝修飾
      [0047] a、抗凝修飾
      [0048] 制備肝素鈉灌注液:在(TC的條件下配制濃度為lg/L的肝素鈉水溶液,調(diào)整pH值 為2. 7 ;然后加入亞硝酸鈉至終濃度為33mg/L,在0°C的條件下攪拌2小時(shí),調(diào)整pH值至 7. 〇 ;再加入NaBH3CN和NaCl至終濃度分別為10mg/L和0· 15mol/L,調(diào)整pH至3. 5。
      [0049] 室溫條件下,向去細(xì)胞化豬肝支架中灌入制備好的肝素鈉灌注液,循環(huán)灌注6小 時(shí),流速為l〇〇mL/min。
      [0050] b、滅菌
      [0051] 用PBS配置成含有青霉素(lOOU/mL) /鏈霉素(100 μ g/mL)的PBS溶液。
      [0052] 完成抗凝修飾后,灌注PBS溶液以達(dá)到無(wú)菌處理的目的,流速為200mL/min,灌注 時(shí)間為6小時(shí),即得本發(fā)明具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架。
      [0053] 2、檢測(cè)方法
      [0054] 將制備的具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架分割成直徑為1cm、厚度為 300um的厚片,部分材料用于1%甲苯胺藍(lán)水溶液染色,另部分用2. 5%戊二醛固定后,經(jīng)梯 度酒精脫水處理,用掃描電鏡觀察材料表面形態(tài)。
      [0055] 為了檢測(cè)整肝修飾中豬肝臟生物支架不同部位肝素分布的均一性,隨機(jī)選取位于 不同肝葉的不同部位的支架材料進(jìn)行肝素含量測(cè)定。具體方法如下:將25mg甲苯胺藍(lán)溶于 500mL含有0. 2% NaCl的0.0 lN HCl溶液中,配制成甲苯胺藍(lán)染色液。配置不同濃度梯度 的肝素溶液,各取2. 5mL肝素溶液與2. 5mL甲苯胺藍(lán)染色液混合均勻,然后加入5mL己烷。 搖晃混合液,使甲苯胺藍(lán)和肝素形成混合物,溶解于有機(jī)相中。用酶標(biāo)儀測(cè)定水相中的甲苯 胺藍(lán)殘余量,測(cè)定波長(zhǎng)為631nm,計(jì)算出肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用木瓜蛋白酶消化待測(cè)材料, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定消化液中肝素的含量。
      [0056] 3、檢測(cè)結(jié)果
      [0057] (1)去細(xì)胞化檢測(cè)結(jié)果
      [0058] 結(jié)果如圖1和圖2所示:經(jīng)過(guò)去細(xì)胞化過(guò)程使豬肝中的細(xì)胞成分得到清除,但細(xì)胞 外基質(zhì)成分得到保留(圖1);從未去細(xì)胞化豬肝(1、3、5、7、9和11泳道)和去細(xì)胞化豬肝 支架(2、4、6、8、10和12泳道)樣品中提取DNA后經(jīng)過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的豬特異性 DNA片段電泳結(jié)果(圖2)。
      [0059] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,本發(fā)明得到的去細(xì)胞化肝臟生物支架中無(wú) DNA殘留。
      [0060] (2)本發(fā)明具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架的表面形態(tài)檢測(cè)結(jié)果
      [0061] 結(jié)果如圖3所示:
      [0062] 與未修飾的去細(xì)胞化肝臟生物支架相比,本發(fā)明抗凝修飾后的去細(xì)胞化肝臟生物 支架能夠被甲苯胺藍(lán)染成藍(lán)色,說(shuō)明經(jīng)過(guò)本發(fā)明抗凝修飾過(guò)程后,肝素大量且均勻地分布 于支架材料表面(詳見圖3A、C)。
      [0063] 與未修飾的去細(xì)胞化肝臟生物支架相比,本發(fā)明抗凝修飾后的去細(xì)胞化肝臟生物 支架然保留了細(xì)胞外基質(zhì)疏松多孔的結(jié)構(gòu)(詳見圖3B、D)。
      [0064] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,本發(fā)明抗凝修飾方法既可以使得去細(xì)胞化肝臟生物支架表面均勻 肝素化,又不會(huì)改變其本身的多孔結(jié)構(gòu)。
      [0065] (3)本發(fā)明具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架的肝素均勻分布檢測(cè)結(jié)果
      [0066] 結(jié)果如圖4和下表1所示:
      [0067] 表1不同部位的肝素含量(μ g/mg組織干重)
      【主權(quán)項(xiàng)】
      1. 一種具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架的制備方法,其特征在于:它包括如 下步驟: (a) 取去細(xì)胞化肝臟生物支架,用含有肝素和/或肝素鹽的溶液灌注,灌注的速度是 80-150mL/min,灌注的時(shí)間是5-12小時(shí); (b) 滅菌,即可。
      2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于:步驟a)中,所述去細(xì)胞化肝臟生物 支架是用1%TritonX-IOO溶液和1%SDS溶液去細(xì)胞化處理得到的去細(xì)胞化肝臟生物支 架。
      3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于:所述去細(xì)胞化肝臟生物支架按照如 下方法制備: 取離體肝臟,用1 %的TritonX-100溶液以200mL/min流速灌注3h,再用1 %SDS溶液 以200mL/min流速灌注6h,最后用1 %TritonX-100溶液和去離子水灌洗去除殘留SDS,獲 得去細(xì)胞化豬肝臟生物支架。
      4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于:步驟(a)中,所述含有肝素和/或肝 素鹽的溶液中,肝素或肝素鈉的濃度為1-3. 3g/L。
      5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于:所述含有肝素和/或肝素鹽的溶液 中,肝素或肝素鈉的濃度為3. 3g/L。
      6. 根據(jù)權(quán)利要求1、3或4所述的制備方法,其特征在于:所述含有肝素和/或肝素鹽 的溶液中還含有亞硝酸鈉、NaBH3CN和NaCl,它們的濃度依次為亞硝酸鈉33mg/L、NaBH3CN 10mg/L、NaCl0.15mol/L。
      7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于:步驟(a)中,所述灌注為循環(huán)灌注。
      8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于:步驟(a)中,所述灌注的速度為 100mL/min,灌注的時(shí)間為5-8小時(shí)。
      9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于:所述灌注的速度為100mL/min,灌注 的時(shí)間為6小時(shí)。
      10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于:步驟(a)中,灌注時(shí),環(huán)境溫度為室 溫。
      11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于:步驟(b)中,所述滅菌采用含有抗 生素的PBS溶液灌注,所述抗生素為青霉素/鏈霉素。
      12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法,其特征在于:所述灌注的速度為100_300mL/ min,灌注的時(shí)間為6-24小時(shí)。
      13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備方法,其特征在于:所述灌注的速度為200mL/min,灌 注的時(shí)間為6小時(shí)。
      14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法,其特征在于:所述含有抗生素的PBS溶液是 含有青霉素/鏈霉素的PBS溶液,其中,青霉素的終效價(jià)為100U/mL,鏈霉素的終濃度為 100yg/mL。
      15. 權(quán)利要求1-14任意一項(xiàng)方法制備的具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架。
      【專利摘要】本發(fā)明提供了一種具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架的制備方法,它包括如下步驟:(a)取去細(xì)胞化肝臟生物支架,用含有肝素和/或肝素鹽的溶液灌注,灌注的速度是80-150mL/min,灌注的時(shí)間是5-12小時(shí);(b)滅菌,即可。本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架。本發(fā)明制備得到的具有抗凝血性能的去細(xì)胞化肝臟生物支架抗凝血性能強(qiáng)、細(xì)胞相容性好,對(duì)種植于其上的細(xì)胞的生存、分化和增殖等起到了極為重要的支撐作用,為構(gòu)建具有臨床應(yīng)用價(jià)值的異源性組織工程化生物抗凝支架提供了一種方便廉價(jià)的來(lái)源和制備方法。
      【IPC分類】A61L33-10, A61L27-36
      【公開號(hào)】CN104841017
      【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510283871
      【發(fā)明人】包驥, 步宏, 王宇嘉, 吳瓊
      【申請(qǐng)人】四川大學(xué)華西醫(yī)院
      【公開日】2015年8月19日
      【申請(qǐng)日】2015年5月28日
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