智能化納米水凝膠拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)抗菌接骨板及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于外科醫(yī)療用材料及其制造方法，具體的說，智能化納米水凝膠拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)抗菌接骨板。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)國際內(nèi)固定研宄協(xié)會(huì)AO (Arbeit sgem ein schaft fur Osteosynthesesfragen) /ASIF (Associat1n for the Study of Internal Fixat1n)報(bào)道，開放性骨折中感染率高達(dá)約3?40%，如使用內(nèi)固定則感染率增加30%以上。每年在美國約200萬例院內(nèi)感染病例中，約50%與內(nèi)植物有關(guān)，不僅消耗高達(dá)240億美元的巨大社會(huì)財(cái)富，還導(dǎo)致包括細(xì)菌耐藥、截肢甚至每年10萬患者死亡等嚴(yán)重后果。宄其原因，細(xì)菌與植入物材料粘附以形成完整的生物膜是“內(nèi)植物相關(guān)感染”的主要病理基礎(chǔ)。“內(nèi)植物相關(guān)感染”(Orthopedic Device Related Infect1ns, 0DRI)始終是困擾骨科臨床的最常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。針對(duì)0DRI，一般傳統(tǒng)的治療方法是:在取出內(nèi)植物的基礎(chǔ)上，徹底清創(chuàng)去除感染壞死骨與軟組織及大部分細(xì)菌；使用外固定支架臨時(shí)固定骨折斷端；全身或局部應(yīng)用大劑量抗生素消滅殘留細(xì)菌；應(yīng)用皮瓣等技術(shù)關(guān)閉傷口。確實(shí)無感染后再行植骨、骨搬移或延長(zhǎng)及膜成骨技術(shù)恢復(fù)骨結(jié)構(gòu)。
[0003]針對(duì)ODRI的傳統(tǒng)治療技術(shù)，周期長(zhǎng)、花費(fèi)大，多使用外固定支架固定骨骼，維持其穩(wěn)定性。而較少使用內(nèi)固定器械，與在開放性骨折和火器傷中鋼板螺絲釘?shù)葍?nèi)植物則被視為禁忌癥的原因相同，僅約數(shù)量為103CFU/ml的細(xì)菌即可與內(nèi)植物粘附以及并形成完整的生物膜導(dǎo)致ODRI的發(fā)生、發(fā)展與持續(xù)迀延不愈是基礎(chǔ)。而沒有內(nèi)植物的情況下，即使開放性骨折局部有106CFU/ml細(xì)菌，也未必導(dǎo)致肌體感染。但是外固定具有針道感染率高(5.9%?19% )、在干骺端骨折中不易固定、鋼針?biāo)蓜?dòng)和嚴(yán)重影響患者生活、不便于護(hù)理等缺點(diǎn)。而在干骺端骨折中，接骨板是不可替代的固定骨折斷端的方式。因此，在ODRI的預(yù)防與治療中，傳統(tǒng)抗生素使用方法:全身或局部用藥。前者，往往由于局部損傷和血循破壞導(dǎo)致全身血中抗生素難以在損傷局部達(dá)到有效抗菌濃度；后者，雖然能夠在局部初始產(chǎn)生高濃度的抗生素，但隨后快速下降，不能維持有效治療濃度。因此，均難以對(duì)ODRI與創(chuàng)傷性骨髓炎的形成與發(fā)展產(chǎn)生有效的抗感染作用。目前針對(duì)細(xì)菌生物膜，通過抑制其多糖基質(zhì)合成及促進(jìn)其分解、干擾密度感應(yīng)系統(tǒng)、加用單抗和改進(jìn)植入物的表面理化特性以降低細(xì)菌與材料的粘附及抗菌素涂層等方法，證實(shí)在一定程度上可以降低ODRI發(fā)生率，但均不能徹底地解決生物膜的形成和由此導(dǎo)致的持續(xù)感染。為此，尋找新的改變固定物材料表面特性的方法或物質(zhì)已成為目前臨床工作的迫切需要，是國內(nèi)外微生物、材料、臨床醫(yī)學(xué)等多領(lǐng)域研宄焦點(diǎn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一在于提供一種強(qiáng)力抗感染和抑制細(xì)菌生物膜形成的智能化納米水凝膠拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)抗菌接骨板，該接骨板制備PEG-C0-AA微膠粒為核的智能化電荷梯度徑向分布凝膠顆粒、PH敏感型PMMA微凝膠層為控釋殼的復(fù)合微膠粒。該微膠粒不僅能夠充分負(fù)載hBD-3等抗菌肽，并且由于微膠粒核內(nèi)hBD-3等抗菌肽呈現(xiàn)正電荷梯度徑向分布，使hBD-3等抗菌肽具有“智能化”由高電勢(shì)向低電勢(shì)自動(dòng)地遞補(bǔ)、發(fā)揮“接觸性殺菌”效應(yīng)和拓?fù)淇咕Y(jié)構(gòu)的三重“智能化”特征的納米水凝膠涂層，以克服傳統(tǒng)交聯(lián)方法的困境及涂層易水解、負(fù)載抗菌肽量少和半衰期短的缺陷，從而突破hBD-3等抗菌肽在體內(nèi)防治ODRI的應(yīng)用“瓶頸”。
[0005]本發(fā)明的目的之二在于提供一種智能化納米水凝膠拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)抗菌接骨板的制造方法。
[0006]一種智能化納米水凝膠拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)抗菌接骨板，包括鈦金屬或鈦合金接骨板(I)，其關(guān)鍵在于:所述鈦金屬或鈦合金接骨板拓?fù)淇咕Y(jié)構(gòu)表面復(fù)合微膠粒負(fù)載β —防御素一I?3、乳鐵蛋白1-11、LL-37、富組蛋白類似體(histatin analogue DHVAR-5)、內(nèi)源性抗微生物多肽-1 (Protegrins-1)及人工合成的陽離子抗菌肽單位面積濃度約0.025?lmg/mL。所述鈦金屬或鈦合金接骨板表面覆蓋由聚乙二醇-Co-丙稀酸(Poly (ethyleneglycol)-co-acrylic acid, PEG_co_AA)微凝膠核為內(nèi)核，外層控釋殼為pH敏感型聚甲基丙稀酸(poly (methacrylic acid, PMAA)微凝膠層的智能化電荷梯度徑向分布復(fù)合微膠粒，該復(fù)合微膠粒涂層在不銹鋼、鈦金屬或鈦合金接骨板形成拓?fù)淇咕Y(jié)構(gòu)表面復(fù)合微膠粒負(fù)載β 一防御素一 I?3、乳鐵蛋白l-ll、LL-37、富組蛋白類似體(histatin analogueDHVAR-5)、內(nèi)源性抗微生物多肽-1 (Protegrins-1)及人工合成的陽離子抗菌肽。所述復(fù)合微膠粒直徑約100?400 μm、高度范圍0.6?8 μπι。PEG-co-AA微凝膠核電勢(shì)范圍約負(fù)6?40mv，核內(nèi)徑約I?100nm ;PMAA微凝膠層電勢(shì)范圍約負(fù)6?Omv，層數(shù)約5?30層。該復(fù)合微膠粒具備電荷自高電勢(shì)向低電勢(shì)自動(dòng)轉(zhuǎn)移的特性。所述不銹鋼、鈦金屬或鈦合金接骨板拓?fù)淇咕Y(jié)構(gòu)表面復(fù)合微膠粒(3)間距范圍約0.5?4 μπι。
[0007]一種智能化納米水凝膠拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)抗菌接骨板的制造方法，其關(guān)鍵在于，按如下步驟進(jìn)行:
[0008]步驟1，鈦金屬或鈦合金接骨板(I)表面預(yù)處理和鈦表面帶電處理。鈦金屬或鈦合金接骨板(I)依次以蒸餾水、丙酮、75%乙醇、蒸餾水超聲清洗、等離子plasma進(jìn)行親水處理各10?20分鐘，置入0.2mg/mL，平均分子量為30?50k，pH9的多聚L賴氨酸(poly-l-lysine,PLL)2?3小時(shí)，在鈦合金基體形成帶正電高分子層，進(jìn)行初始底層沉積，取出后用去離子水洗凈，在室溫下干燥待用。
[0009]步驟2，制備PEGDA/AA乳液(2)。分別取平均分子量500?600的聚乙二醇丙烯酸醋(Polyethylene Glycol Diacrylate, PEGDA) 200 μ 1，丙稀酸單體(acrylic acid, AA)在50°C蒸餾后留取0?20 μ 1，以及光引發(fā)劑(Darocur 1173，Ciba) 10 μ 1，共同溶解在二氯甲燒(dichloromethane，DCM) Iml中形成油相。I?10%聚乙稀醇(PVA) I?3ml作為乳化劑，被溶解在1ml去離子水中形成水相。在高速磁子(100rpm)的攪拌10?20分鐘，油相被分散到連續(xù)的水相中形成乳液。通過調(diào)整PVA的含量，油相/水相的比例，以及磁子攪拌的時(shí)間，控制乳液直徑大小約1.0?1.5 μπι。
[0010]步驟3，合成PEG-co-AA微凝膠核(2)。制成的乳液被置于10w的紫外燈下20分鐘。紫外光激發(fā)光引發(fā)劑產(chǎn)生自由基，在自由基聚合的原理下，油滴中的PEGDA以及AA的雙鍵被打開，導(dǎo)致鏈增長(zhǎng)和鏈之間交聯(lián)反應(yīng)。因此，油滴中的PEGDA和AA形成了微凝膠核，以70%乙醇懸浮一離心的方法反復(fù)三次進(jìn)行純化，用去離子水懸浮一離心的方法去除酒精。通過控制PEGDA與AA的比例10:0.1?I，控制微凝膠核的電荷密度，形成電勢(shì)約范圍約負(fù)6?40mv。制成的微膠粒核通過16000?50000r/min高速離心收集，用不同孔徑的濾膜可以選擇性的得到所需的粒徑大小I?lOOOnm，最后收集到的微膠粒核被分散在1mlPBS磷酸鹽緩沖液中。
[0011 ] 步驟4，PEG-co-AA微凝膠核表面修飾PMAA高電荷密度殼層⑵。純化后的微凝膠核首先被分散到聚乙稀卩比略燒酮(poly(N-vinylpyrrolidone)，PVP0N)的PBS溶液中(0.2mg/mL，pH 2,0.0lM PBS)，15分鐘后，將微凝膠粒通過過濾，離心的方式洗凈。隨后，將PVPON處理過的膠粒分散在聚甲基丙烯酸PMAA的PBS溶液中(0.2mg/mL，pH 2,0.0lM PBS)，15分鐘后，用上述方法洗凈。重復(fù)以上方法5?30次，形成有氫鍵交聯(lián)的5?30層PVPON/PMAA凝膠層。
[0012]步驟5，交聯(lián)穩(wěn)定PMAA凝膠殼層(2)。微凝膠顆粒被分散在1_乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽5mg/mL和羥基硫代琥珀酰亞胺5mg/mL的0.0lM PBS溶液(PH5)中1.5小時(shí)；之后，將膠粒從溶液中分離，并且浸泡到10mg/mL的乙二胺(ethylenediamine,EDA)溶液(ρΗ5.8)中14小時(shí)進(jìn)行PMAA層之間的共價(jià)交聯(lián)；最后，為了去除PVPON和未反應(yīng)的其他試劑，PEG-co-AA/PMAA復(fù)合微凝膠粒被浸泡在ρΗ7.5的0.0lMPBS中2小時(shí)，離心一過濾之后復(fù)合微凝膠粒被懸浮在PBS中(pH7.4,0.1Μ)。應(yīng)用動(dòng)態(tài)光散射和Zeta電勢(shì)測(cè)定方法在不同ρΗ4?9及離子強(qiáng)度的情況下復(fù)合微凝膠的大