衍生自TGFβ的多肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及TGF0分子的突變型變體 (其天然同源物的信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑）的用途，以及其治療應(yīng)用。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 細(xì)胞因子TGF |3因其刺激細(xì)胞集落形成的能力而被發(fā)現(xiàn)（Roberts AB等人，Proc Natl Acad Sci USA，78:5339-43, 1981)，由于該過程是細(xì)胞轉(zhuǎn)化的典型標(biāo)志，因而該分子被 稱為轉(zhuǎn)化生長因子0?，F(xiàn)今，配體TGF0 (TGFM、TGF0 2、TGF0 3)被認(rèn)為是多功能生長 因子的原型。生物體中的幾乎任何細(xì)胞類型都產(chǎn)生它們并且表達(dá)其受體復(fù)合物。這些分 子是上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞增殖的強(qiáng)有力的抑制劑（Ravitz MJ等人，Adv Cancer Res, 71:165-207, 1997)，是細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積（Massague J. The Annu Rev Cell Biol, 6:597-641，1990)和組織修復(fù)級(jí)聯(lián)（Roberts AB 等人，Plenum, 275-308, 1996)的最 強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)劑之一。它們還在胚胎發(fā)育期間調(diào)節(jié)各種不同的機(jī)制，例如細(xì)胞分化、迀移 和血管發(fā)生（Taya Y?等人，Development, 126:3869-79, 1999 ;Lidral A.等人，Am J Hum Genet, 63:557-68, 1998)〇
[0004] 在免疫系統(tǒng)中，由TGF0介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)是一個(gè)非常重要的調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)。其最突出 的功能之一是通過抑制在淋巴細(xì)胞減少環(huán)境中由自身抗原誘導(dǎo)的幼稚T細(xì)胞增殖來維持淋 巴細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和免疫耐受（Bevan M.等人，Nat Immunol.，27, 13(7) :667-73, 2012)。該分子 還取消或改變天然殺傷細(xì)胞（Laouar, Y?等人，Nature Immunol, 6:600-607, 2005)、樹突細(xì) 胞（Luo, X?等人，Proc. Natl Acad. Sci. USA, 104:2821-2826, 2007 ;Bekeredjian-Ding，I. 等人，Immunology, 128:439-450,2009)、巨細(xì)胞（Sica，A?等人，Semin.Cancer Biol.，18, 349-355, 2008 ;Torroella.M 等人，Cancer Res，69:4800-09, 2009)、嗜中 性粒細(xì)胞（Fridlender, Z. G?等人，Cancer Cell, 16:183-194, 2009)以及效應(yīng)和記 憶 T 細(xì)胞群（6〇代111^，1.&卩1&￥611，1?.六.，恥七11代]^(1.，7:1118-22,2001 丨1&￥611，1?. A.，Immunity，31:131-44, 2009)的激活、成熟和分化。TGF0在天然的和誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)T 細(xì)胞（⑶4+Foxp3+)和效應(yīng)T細(xì)胞群T⑶4+IL17+(TH17)的誘導(dǎo)、分化和維持中起著必 不可少的作用（Kryczek, I?等人，J. Immunol.，178:6730-33, 2007 ;Moo_Young, T. A?等 人，J. Immunother, 32:12-21, 2009 ;Fantini, MC 等人，J. Immunol.，172:5149-53, 2004 ; Flavell, R. A. , Cell, 134:392-404, 2008)〇
[0005] 成熟的配體TGF0是具有112個(gè)氨基酸殘基的同二聚體。它們衍生自由朝向 N-末端的潛伏狀態(tài)相關(guān)前肽（LAP :latency associated pro-peptide)和朝向C-末端的 活性結(jié)構(gòu)域形成的前體分子。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞內(nèi)通過蛋白水解而分開，并且所述配 體作為無活性前體（其由可逆地與活性結(jié)構(gòu)域相連接的前結(jié)構(gòu)域形成）被分泌，由此調(diào) 節(jié)其向細(xì)胞受體的接近（Geoffrey D. Young 和 Joanne E. Murphy-Ullrich, JBC, Vol. 279， No. 36:38032-39, 2004)。已提出，所述潛伏狀態(tài)相關(guān)前肽對(duì)于成熟結(jié)構(gòu)域的分泌來說也是重 要的（Gray A?和 A Mason, Science, 247:1328-30, 1990) 〇
[0006] 三種同種型（TGF0 1、TGF0 2、TGF0 3)在質(zhì)膜上與受體 T0RI、T0RII 和 T0RIII 相互作用。該最后一個(gè)（也已知為e聚糖）并非在所有的細(xì)胞類型中表達(dá)，并且盡管它 對(duì)于由配體TGFM和TGF0 3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)來說是可有可無的，但是當(dāng)T 0 RII被飽 和時(shí)它構(gòu)成了這些配體的儲(chǔ)庫（Wang, X.F.等人，Cell, 67:797-805, 1991 ;Lebrin F.等 人，Cardiovasc. Res.，65:599-608, 2005)。T 0 RIII 與受體 T 0 RI 和 T 0 RII 形成復(fù)合物，以 將該配體呈遞給它們。這些配體首先與T 0 RII結(jié)合，并且復(fù)合物T 0 RII/TGF0協(xié)作地且 以高親和力招募和激活受體T0RI，這導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)的異三聚體復(fù)合物的形成。TGFM和 TGF 0 3可以以高親和力（5-30pM)與T 0 RII結(jié)合，而TGF 0 2僅可以在T 0 RIII存在下同樣 地如此做（De Crescenzo 等人，J. Biol. Chem, 279:26013-18, 2004 ;De Crescenzo 等人，J. Mol. Biol, 328:1173-1183, 2003 ;Groppe 等人，Molecular Cell, 29, 157-168, 2008) 〇
[0007] 迄今還未報(bào)道，配體TGF0 1、TGF0 2和TGF0 3可以與作為T0RII所屬于的 同一蛋白質(zhì)家族的成員的其他II型受體相結(jié)合（Huang F和YG, Chen, Cell Biosc, Mar 15, 2:9, 2012)。但是，它們可以與數(shù)種I型受體相結(jié)合。傳統(tǒng)地，ALK5被描述為該配體亞 家族的受體T0RI。在其被招募到復(fù)合物Tf3RII/TGF-f3中后，誘導(dǎo)了蛋白SMAD2/3的磷 酸化（Huang F 和 YG Chen, Cell Biosc, Mar 15,2:9,2012)。ALKl 響應(yīng)于在內(nèi)皮細(xì)胞中復(fù) 合物TGF 0 /T 0 RII的形成而被激活，并且通過SMADl和SMAD5來進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)（Goumans MJ等人，Mol Cell, 12 (4) :817-28, 2003)。在一些上皮細(xì)胞中，SMAD1/5信號(hào)傳導(dǎo)由受體 ALK2、ALK3 和 ALK6 誘導(dǎo)（Daly AC 等人，Mol Cell Biol, 28:6889-6902, 2008)。ALK2 還 與涉及體內(nèi)心血管發(fā)育的過程相關(guān)（Olivey HE等人，Dev Dyn，235(1):50-9, 2006)。反 過來，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，T0 RII和ALK5均是配體TGF0 1、TGF0 2和TGF0 3的家族所專有的，而 ALK1/2/6/3是更混雜的，還被激活蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白所共享（Sebald W.等人，Biol Chem.，385(8) :697-710, 2004)。
[0008] 由ALK5介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)在確定的疾病中與數(shù)種致病機(jī)制相關(guān)。例如在癌癥中， 其作用是復(fù)雜的并且與其取消或促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的能力有關(guān)。腫瘤進(jìn)展的取消主要在腫瘤 發(fā)生的早期階段期間運(yùn)作。然而，其作為腫瘤進(jìn)展劑的作用出現(xiàn)在癌發(fā)生的晚期階段，這 通過誘導(dǎo)侵入性和轉(zhuǎn)移性表型以及取消抗腫瘤免疫應(yīng)答來進(jìn)行（Miyazono K.，Nat. Rev. Cancer,10:415-24, 2010 ；Miyazono K., Cancer Sci,101 (2):306-12, 2010 ；HawinkeIs U.等人，Growth Factors, 29(4) : 140-52, 2011)。其中TGF 0也具有有害效應(yīng)的其他例子 為由病原體例如HIV、HBV、HCV、CMV、分枝桿菌和寄生蟲克氏錐蟲（Tripanosoma cruzi)引 起的慢性感染。TGF0對(duì)于保護(hù)性免疫應(yīng)答施加負(fù)的影響，由此有益于這些細(xì)胞內(nèi)病原體 的生長和存活（Reed GS. ,Microbes and Infection, 1:1313-1325, 1999)。在許多疾病中， TGF0的過度產(chǎn)生有助于纖維組織的病理學(xué)過量，其危害受損器官的正常功能。一些例子尤 其為肺纖維化、結(jié)節(jié)病、心臟纖維化、心肌病、肝硬化、系統(tǒng)性硬化癥、腎小球硬化癥和原發(fā) 性膽汁性肝硬化（Kopp JB 等人，Microbes and Infection, 1:1349-1365, 1999) 〇
[0009] TGF0信號(hào)傳導(dǎo)是多種抑制策略的目標(biāo)。已經(jīng)在臨床前模型中評(píng)價(jià)了大多數(shù)的 抑制劑，盡管它們中的一些已開始在臨床研宄中在數(shù)種類型的癌癥和纖維化中進(jìn)行檢驗(yàn) (Flavell RA.，Nat Rev Immunol.，10 (8) :554_67, 2010 ;Connolly EC 等人，Int J Biol Sci. ,8(7) :964-78, 2012 ;Hawinkels LJ?等人，Growth Factors, 29