一種實(shí)現(xiàn)活體兔角膜擴(kuò)張模型的裝置及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種實(shí)現(xiàn)活體兔角膜擴(kuò)張模型的裝 置及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 圓錐角膜是一種非炎性角膜擴(kuò)張性疾病，它可導(dǎo)致角膜中央或旁中央進(jìn)行性變薄 膨出、高度散光或角膜瘢痕，嚴(yán)重影響患者視力。圓錐角膜多在青春期發(fā)病，據(jù)報(bào)道該病發(fā) 病率約為1/2000。臨床上圓錐角膜以散發(fā)獨(dú)立病例較為常見(jiàn)，但圓錐角膜可與許多疾病相 關(guān)，包括某些先天性遺傳病如Down綜合征、Marfan綜合征等和某些結(jié)蹄組織異常疾病如 Ehlers-Danlos綜合征、二尖瓣脫垂等。
[0003]目前圓錐角膜病因尚不清楚，通常認(rèn)為圓錐角膜是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作 用引起的。在圓錐角膜中可發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子和酶的表達(dá)發(fā)生改變，有學(xué)者認(rèn)為蛋白水解 酶和下調(diào)的蛋白酶抑制劑可導(dǎo)致膠原退化，從而引起角膜基質(zhì)變薄。而膠原酶可以降解天 然膠原；因此，局部應(yīng)用膠原酶建立角膜擴(kuò)張模型存在一定可行性。圓錐角膜動(dòng)物模型可 模擬臨床上圓錐角膜的病理狀態(tài)，而且活體的模型相對(duì)于離體的模型更接近于真實(shí)體內(nèi)情 況，對(duì)于指導(dǎo)圓錐角膜治療以及愈后檢測(cè)及觀察有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，也更加有利于探索圓 錐角膜的發(fā)病機(jī)制，由此建立這種近乎理想的活體圓錐角膜模型顯得非常有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是建立一種可靠的角膜擴(kuò)張模型，為探索圓錐角膜的 發(fā)病機(jī)制提供極大便利。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種實(shí)現(xiàn)兔角膜擴(kuò)張模型的裝置，所述 裝置密封保存在一個(gè)操作箱中或其它可以放置下述工具的容器，用于構(gòu)建兔角膜擴(kuò)張模 型，所述裝置具體包括：
[0006] 去上皮工具，用于除去兔角膜的上皮；
[0007] 角膜浸泡工具，用于對(duì)除去上皮的兔角膜進(jìn)行浸泡處理，得到浸泡處理后的兔角 膜；
[0008] 涂膏工具，用于將防感染劑涂抹在浸泡處理后的兔角膜上。
[0009] 特別是，所述裝置還包括麻醉工具，用于除去兔角膜的上皮之前，對(duì)兔角膜進(jìn)行麻 醉處理。
[0010] 其中，所述去上皮工具包括：小圓刀、角膜刮刀。
[0011] 其中，所述的角膜浸泡工具包括：
[0012] 作用于角膜上，用于浸泡角膜的II型膠原酶溶液；
[0013] 用于將所述II型膠原酶溶液施用于角膜上的移液器；
[0014] 用于沖洗角膜的PBS溶液和用于將PBS溶液對(duì)角膜進(jìn)行沖洗處理的注射器。
[0015] 特別是，所述II型膠原酶溶液中II型膠原酶的濃度為3-18mg/ml。
[0016] 尤其是，所述II型膠原酶溶液中包含質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10-24%的右旋糖酐。
[0017] 尤其是，所述II型膠原酶溶液還包括PBS溶液，溶液pH值為7. 4。
[0018] 其中，所述涂膏工具包括：
[0019] 用于防止病原菌侵入浸泡處理后的兔角膜上的防感染處理劑；
[0020] 用于將所述放感染處理劑涂抹在兔角膜上的無(wú)菌棉簽。
[0021] 特別是，所述防感染處理劑為迪可羅眼膏、紅霉素眼膏或者托百士眼膏。
[0022] 特別是，所述用于將所述放感染處理劑涂抹在兔角膜上的無(wú)菌棉簽，也可以將眼 藥膏直接用手涂入兔結(jié)膜囊內(nèi)。
[0023] 其中，所述麻醉工具包括：
[0024] 用于麻醉兔角膜，使其失去感知能力的麻醉劑；
[0025] 用于將麻醉劑作用于兔角膜的注射器。
[0026] 特別是，所述麻醉劑為鹽酸奧布卡因滴眼液、奧布卡因凝膠或奧布卡因滴眼液。
[0027] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明另一方面提供一種兔角膜擴(kuò)張模型的構(gòu)建方法，包 括：
[0028] 使用去上皮工具，除去兔角膜的上皮結(jié)構(gòu)，得到除去上皮的兔角膜；
[0029] 使用角膜浸泡工具，對(duì)除去上皮的兔角膜進(jìn)行浸泡處理，使角膜上的膠原發(fā)生降 解，得到膠原含量降低的兔角膜；
[0030] 利用涂膏工具，將防感染劑涂抹在膠原降解的兔角膜上，得到具有抵抗病原菌侵 入的兔角膜；
[0031] 將所述具有抵抗病原菌侵入的兔角膜飼養(yǎng)5-15天，得到兔角膜擴(kuò)張模型。
[0032] 特別是，所述還包括麻醉工具，用于除去兔角膜的上皮之前，對(duì)兔角膜進(jìn)行麻醉處 理。
[0033] 其中，所述去上皮工具是小圓刀、角膜刮刀。
[0034] 其中，所述的角膜浸泡工具包括：
[0035] 作用于角膜上，用于浸泡角膜的II型膠原酶溶液；
[0036] 用于將所述II型膠原酶溶液施用于角膜上的移液器；
[0037] 用于沖洗角膜的PBS溶液和用于將PBS溶液對(duì)角膜進(jìn)行沖洗處理的注射器。
[0038] 特別是，所述II型膠原酶溶液中II型膠原酶的濃度為3_18mg/ml。
[0039] 尤其是，所述II型膠原酶溶液中包含質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10-24%的右旋糖酐。
[0040] 尤其是，所述II型膠原酶溶液還包括PBS溶液。
[0041] 其中，使用角膜浸泡工具，對(duì)除去上皮的兔角膜進(jìn)行浸泡處理的包括：
[0042] 使用移液器將II型膠原酶溶液滴加在角膜表面，進(jìn)行浸泡處理，使角膜中的膠原 發(fā)生降解；
[0043] 在所述浸泡處理結(jié)束后，使用棉簽吸干角膜上的II型膠原酶溶液；
[0044] 最后利用注射器將PBS溶液在所述吸干II型膠原酶溶液后的角膜表面對(duì)角膜進(jìn) 行沖洗，得到去除II型膠原酶溶液的角膜。其中，所述浸泡處理時(shí)間為20-40min。
[0045] 優(yōu)選地，所述浸泡處理時(shí)間為30min。
[0046] 其中，所述涂膏工具包括：
[0047] 用于防止病原菌侵入浸泡處理后的兔角膜上的防感染處理劑；
[0048] 用于將所述放感染處理劑涂抹在兔角膜上的無(wú)菌棉簽。
[0049] 特別是，所述防感染處理劑為迪可羅眼膏、紅霉素眼膏或者托百士眼膏。
[0050] 特別是，所述用于將所述放感染處理劑涂抹在兔角膜上的無(wú)菌棉簽，也可以將眼 藥膏直接用手涂入兔結(jié)膜囊內(nèi)。
[0051 ] 其中，所述麻醉工具包括：
[0052] 用于麻醉兔角膜，使其失去感知能力的麻醉劑；
[0053] 用于將麻醉劑作用于兔角膜的注射器。
[0054] 特別是，所述麻醉劑為鹽酸奧布卡因滴眼液、奧布卡因凝膠或奧布卡因滴眼液。
[0055] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0056] 1、本發(fā)明提供的實(shí)現(xiàn)兔角膜擴(kuò)張模型的裝置僅包括麻醉工具、去皮工具、角膜浸 泡工具和涂膏工具就可以建立兔角膜擴(kuò)張模型，所述工具都是市售產(chǎn)品，成本低，容易獲 得。
[0057] 2、使用本發(fā)明提供的兔角膜擴(kuò)張模型的工具構(gòu)建兔角膜擴(kuò)張方法簡(jiǎn)單，僅需對(duì)兔 角膜進(jìn)行麻醉、去上皮、浸泡角膜、涂抹眼膏即可完成構(gòu)建過(guò)程，不需要投入人員培訓(xùn)費(fèi)用， 因此該方法成本低，操作人員沒(méi)有特別要求。
[0058] 3、使用本發(fā)明提供的裝置構(gòu)建的兔角膜擴(kuò)增模型的曲率增加與中央厚度減少與 臨床圓錐角膜的病理狀態(tài)所呈現(xiàn)的曲率增加、中央厚度減少是一致的，可用于圓錐角膜曲 率變化機(jī)理性研究。
[0059] 4、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)使用的人角膜建立的角膜擴(kuò)張模型，本發(fā)明提供的兔角膜擴(kuò)張 模型的角膜來(lái)源于兔子，因此成本低，容易獲得。
【具體實(shí)施方式】
[0060] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0061] 實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵循ARVO關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的聲明。
[0062] 材料：
[0063] 新西蘭白兔：北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，健康狀況良好，雌性成年體重 2. 0-3. 0kg，眼部檢查未見(jiàn)異常，30只。
[0064] II型膠原酶（美國(guó)Worthington公司）
[0065] 右旋糖苷（美國(guó)Adamas公司）
[0066] 手持電子角膜曲率計(jì)（天津市索維電子技術(shù)有限公司）
[0067] 手持角膜超聲測(cè)厚儀（美國(guó)Accutome公司）
[0068] 回彈式眼壓計(jì)（芬蘭iCare公司）
[0069] 實(shí)施例1
[0070] 1、II型膠原酶溶液的配制
[0071] I. IPBS溶液的配制
[0072]將0? 27g的磷酸二氫鉀（KH2P04)、1?42g的磷酸氫二鈉（Na2HP(M)、8g的氯化鈉 (NaCl)、0. 2g的氯化鉀（KCl)用800mL的去離子水充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?L，并使用濃鹽酸 調(diào)pH至7. 4,得到PBS溶液。
[0073] I. 211型膠原酶溶液的配制
[0074] 將15mg右旋糖酐粉末和0. 3g II型膠原酶粉末溶解于100mL的PBS緩沖液中， 輕輕渦旋振蕩，使其充分溶解，然后用低蛋白結(jié)合的0. 22um的濾膜過(guò)濾除菌，分裝成小份 量，-20°C保存避光凍存。
[0075] 2、活體圓錐角膜模型的建立
[0076] 術(shù)前對(duì)10只實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行常規(guī)裂隙燈、直接眼底線、角膜曲率、中央角膜厚度等檢 查，排除眼前節(jié)病變，10只新西蘭白兔采用右眼為實(shí)驗(yàn)眼和左眼為對(duì)照眼。將實(shí)驗(yàn)兔固定 于試驗(yàn)操作臺(tái)上，將5%戊巴比妥鈉注射液以0. 5ml/Kg行實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈緩慢推注將兔麻 醉，鹽酸奧卡因滴眼液滴3滴，使兔角膜表面浸潤(rùn)麻醉；采用手持角膜曲率計(jì)和手持角膜超 聲測(cè)厚儀觀測(cè)右眼角膜曲率Ki(i = 1、2…10)、左眼角膜曲率K'i(i = 1、2…10)及角膜中 央厚度（CCT)Hi (i = 1、2…10);隨后使用小圓刀片和角膜刮刀去除角膜中心直徑8mm的角 膜上皮），采用移液器將步驟1配置的3mg/ml的膠原酶溶液滴入右眼，滴入量為200ul，浸 泡右眼角膜30min，同時(shí)左眼角膜使用含有15 %右旋糖苷的PBS溶液浸泡30min。隨后采用 棉簽吸干溶液，PBS溶液沖洗多次洗凈殘留溶液，在手術(shù)眼部涂抹迪可羅眼膏預(yù)防感染，在 處理15