一種殼聚糖攜載siRNA涂層血管支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于血管支架的技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種羥丁基殼聚糖攜載組織因子SiRNA涂層血管支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]冠狀動脈支架置入術(shù)后，刺激血管平滑肌細胞(VSMC)的過度增殖和迀移，激發(fā)體內(nèi)局部組織因子表達明顯增高，使體內(nèi)呈高血栓負荷狀態(tài)，極易形成支架內(nèi)血栓及支架內(nèi)再狹窄。對于血管平滑肌細胞(VSMC)的過度增殖可以利用局部直接給藥策略，比如藥物洗脫支架(DES)，來降低再狹窄的發(fā)生率。與此同時，血管內(nèi)皮細胞受到不同程度的抑制，在此期間，平滑肌細胞(SMC)極易過度增殖、迀移，并釋放組織因子，引起血小板聚集形成支架內(nèi)血栓。最近的研究表明，藥物洗脫支架(DES)的置入也可能刺激組織因子(TF)的表達，從而促進體內(nèi)動脈血栓的形成。TF參與復(fù)雜的機制包括細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過調(diào)節(jié)VSMC迀移、增殖，進而引發(fā)血栓形成和血管壁重構(gòu)。因此，干預(yù)血管組織因子的過度增殖是非常有意義的。
[0003]基因載體的選擇是基因治療中的一個關(guān)鍵因素。病毒載體雖有$父尚的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但它存在致突變或癌變的潛能，對宿主免疫原性及生產(chǎn)成本高等問題，大大限制了它們的應(yīng)用。脂質(zhì)體具有良好的脂質(zhì)生物相容性，然而，不借助于轉(zhuǎn)染試劑，并不能保證高效的細胞攝取和基因沉默效應(yīng)，并且陽離子脂質(zhì)體具有細胞膜活性，可能對細胞產(chǎn)生一定的破壞作用等問題，限制了它在體內(nèi)的應(yīng)用。非病毒載體是目前研究的重點，殼聚糖作為藥物遞送載體、生物涂層和DNA和siRNA等基因轉(zhuǎn)染材料的廣泛研究，具有生物相容性、生物可降解、抑菌活性、藥物緩釋控釋能力和無毒性聚合物等優(yōu)點。但是，其同時也存在轉(zhuǎn)染效率相對較低、水溶性差、靶向性不好的缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種殼聚糖攜載SiRNA涂層血管支架及其制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中血管支架極易形成支架內(nèi)血栓、再狹窄及其涂層載體存在轉(zhuǎn)染效率低、水溶性差和靶向性不好的問題。
[0005]本發(fā)明的一種殼聚糖攜載SiRNA涂層血管支架的制備方法，其主要是通過以下技術(shù)方案加以實現(xiàn)的:包括以下步驟:
(1)構(gòu)建TF-siRNA 靶序列 JtTF-mRNA 167_186bp 序列，序列為 5-GCG CTT CAG GCACTA CAA AT-3，標記上熒光素，得TF-siRNA組織因子；
(2)羥丁基殼聚糖攜載組織因子siRNA納米顆粒的制備:
(a)取羥丁基殼聚糖片層狀樣品，用潔凈的鑷子撕成薄片，平鋪玻璃培養(yǎng)皿中，置于紫外燈下正反面各照射50-80min后，溶于乙酸溶液，過濾除菌，得羥丁基殼聚糖乙酸溶液；
(b)取TPP，添加水溶解，攪拌均勻，過濾除菌，得TPP水溶液；
(c)取步驟(I)所得TF-siRNA組織因子添加到DEPC水中，溶解，得siRNA溶液； (d)將步驟(c )所得siRNA溶液加入到步驟(b )所得TPP水溶液中，攪拌混勻，然后，將其緩慢滴加到步驟(a)所得羥丁基殼聚糖乙酸溶液中，滴加速度40-50滴/min，繼續(xù)攪拌，室溫孵育15-60min，分裝，避光保存，得羥丁基殼聚糖納米復(fù)合物；
(3)支架表面堿化:將裸金屬血管支架依次于丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗，并真空干燥20-40min ;然后，將其置入堿性溶液中，浸泡處理，取出后用雙蒸水沖洗3次以上，再放入雙蒸水中超聲清洗，真空干燥20-40min ;
(4)羥丁基殼聚糖納米粒支架涂層的制備:將步驟(3)中所得血管支架浸入步驟(2)所得羥丁基殼聚糖納米復(fù)合物中，調(diào)節(jié)溶液的PH值為3.4-6.4，以血管支架為陰極、鉑電極為陽極、飽和甘萊電極為參比電極，于30-60°C和電流強度為0.5-2mA/cm2下，電沉積30-120min，然后，采用蒸餾水清洗血管支架，并干燥，得到羥丁基殼聚糖攜載組織因子siRNA涂層的金屬支架。
[0006]優(yōu)選地，所述步驟(4)中，采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)羥丁基殼聚糖納米復(fù)合物的pH值；陰極和陽極兩個電極的距離為5-20mm，電位低壓為-2-0V ;電沉積完畢之后，在空氣中采用自然晾干的方法進行干燥。
[0007]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，步驟(d)所得羥丁基殼聚糖納米溶液中，羥丁基殼聚糖的濃度為714.5ug/mL，siRNA的濃度為1.13umol/L ;步驟(a)所得羥丁基殼聚糖乙酸溶液中，羥丁基殼聚糖的濃度為0.5-2mg/mL，所用乙酸的濃度為0.2M，其pH值為5.5 ;步驟(b)所得TPP水溶液中，TPP的濃度為0.25-1.0mg/mL，采用0.22um的濾膜進行過濾除菌；步驟(c)所得siRNA溶液中，siRNA的濃度為10_30umol/L。
[0008]優(yōu)選地，所述步驟(3)中，超聲時間為30-60min，堿性溶液的濃度為3-5M，浸泡時間為24-72h，浸泡溫度為40-70°C，堿性溶液為氫氧化鈉水溶液。
[0009]進一步優(yōu)選地，所述步驟(I)中，熒光素為FAM熒光。
[0010]本發(fā)明的一種殼聚糖攜載siRNA涂層血管支架，其主要是通過以下技術(shù)方案加以實現(xiàn)的:包括支架本體；所述支架本體的外表面設(shè)有納米涂層，所述納米涂層為羥丁基殼聚糖攜載組織因子siRNA的納米涂層。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
(I)、本發(fā)明采用強堿處理金屬血管支架，會在其表面產(chǎn)生微孔和-OH基團，該微孔和-OH基團能儲存藥物，并有利于緊密結(jié)合羥丁基殼聚糖(HBCS:TF- siRNA)納米顆粒復(fù)合物，有利于藥物緩慢釋放。
[0012](2)、本發(fā)明中羥丁基殼聚糖攜載組織因子siRNA可以抑制組織因子表達，同時可以干預(yù)血管平滑肌細胞增殖且能顯著誘導(dǎo)細胞凋亡，對支架內(nèi)再狹窄的起始因素實現(xiàn)一靶多效，即可治療細胞增殖疾病，同時又可緩解高血栓負荷狀態(tài)，為冠狀動脈支架植入術(shù)后再狹窄的防治提供了新的思路和方向。
[0013](3)、本發(fā)明使用殼聚糖衍生物，即羥丁基殼聚糖，由于羥丁基基團的高親水性，羥丁基殼聚糖獲得一個在生理的PH范圍可以完全溶解的特性，同時仍然保留其母體殼聚糖的良好的生物活性。所得羥丁基殼聚糖運載系統(tǒng)滿足了非毒性載體的各種參數(shù)。本發(fā)明通過構(gòu)建組織因子siRNA、制備攜載組織因子siRNA的羥丁基殼聚糖納米復(fù)合物、裸金屬血管支架表面堿化處理和制備羥丁基殼聚糖攜載組織因子siRNA的納米涂層而制得。該技術(shù)是納米載藥技術(shù)與基因靶向治療在支架表面涂層材料的最新研究成果，羥丁基殼聚糖組織因子siRNA通過緩慢控制釋放組織因子，具有抑制平滑肌細胞過度增生，防止支架內(nèi)血栓和再狹窄。
[0014](4)、本發(fā)明采用TPP (三聚磷酸鈉)作為離子交聯(lián)，保證了一個很好的包封的效率；高分子量的殼聚糖和較高的脫乙酰度能夠濃縮siRNA為分散的納米顆粒，對復(fù)合物的穩(wěn)定和促進細胞吸收是有必要的。
[0015](5)、本發(fā)明采用殼聚糖衍生物納米載體運用電化學(xué)沉積技術(shù)攜載組織因子siRNA制備新型涂層血管支架，該血管支架可以從基因水平抑制平滑肌細胞增生，從而根源上解決了目前支架內(nèi)再狹窄的問題。
【附圖說明】
[0016]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明一些實施例的部分附圖，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0017]圖1為本發(fā)明所得HBCS:TF-siRNA納米復(fù)合物的TEM圖片；
圖2為本發(fā)明所得HBCS:TF-siRNA納米復(fù)合物的粒徑分布圖；
圖3為本發(fā)明所得HBCS:TF-siRNA在轉(zhuǎn)染后24h的細胞內(nèi)定位圖片；
圖4為靜息細胞和TOGF-BB刺激細胞轉(zhuǎn)染后不同時間下上清液中TF濃度的測定結(jié)果圖；
圖5為CCK-8分析HBCS:TF-siRNA在不同的時間段對細胞活性的影響圖；
圖6為Α0/ΕΒ染色的HUVSMC使用熒光顯微鏡放大200倍的圖片；
圖7為細胞轉(zhuǎn)染72 h后HUVSMC的凋亡率結(jié)果分析圖；
圖8為