[0046]步驟六，將所述步驟五中的支氣管上皮細胞生物復(fù)合材料和軟骨細胞生物復(fù)合材料分別置于兩只低溫墨倉內(nèi)，安裝直徑為0.2毫米的打印針頭，加載于3D打印機上備用；將所述步驟四中的硬材料混合物置于高溫墨倉內(nèi)，安裝直徑為0.1毫米的打印機針頭，加載于3D打印機上備用；
[0047]步驟七，使用建模軟件構(gòu)建三維立體圓筒狀結(jié)構(gòu):首先構(gòu)建一圈輪輻狀結(jié)構(gòu)，作為水平穩(wěn)固支架，指定打印材料為所述硬材料混合物；然后構(gòu)建4個同心圓結(jié)構(gòu)，重疊于所述輪輻狀結(jié)構(gòu)之上，四圓由內(nèi)向外依次指定材料為:硬材料混合物、支氣管上皮細胞生物復(fù)合材料、軟骨細胞生物復(fù)合材料和硬材料混合物；將全部模型結(jié)構(gòu)復(fù)制并累加，得到完整人工氣管模型；
[0048]步驟八，將結(jié)構(gòu)模型導(dǎo)入打印機并進行3D打印，得到生物性復(fù)合人工氣管。
[0049]下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0050]實施例一
[0051]利用支氣管鏡，無菌移植受體刷取支氣管上皮細胞，體外培養(yǎng)擴增；手術(shù)提取耳廓軟骨，消化分散，體外培養(yǎng)擴增。
[0052]將10%膠原和5%透明質(zhì)酸按照質(zhì)體積比與去離子水混合，經(jīng)濾菌器過濾除菌，得到軟材料。將殼聚糖經(jīng)乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射24小時徹底滅菌，以8%質(zhì)量體積比分散于培養(yǎng)液中。
[0053]將上述兩種溶液1:1混合，制成用于重懸細胞的軟材料混合物。
[0054]體外擴增的兩種細胞分別消化、重懸、計數(shù)后離心，棄去上清液，按照100萬/毫升的細胞濃度重懸于前述軟材料混合物中，制成含細胞的軟材料混合物(支氣管上皮細胞生物復(fù)合材料和軟骨細胞生物復(fù)合材料)。
[0055]將含細胞的軟材料混合物分別置于兩只低溫墨倉內(nèi)，安裝直徑為0.2毫米的打印針頭，加載于打印機上備用。
[0056]將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇按照19:1溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風(fēng)處內(nèi)使二氯甲烷自然揮發(fā)，得到硬材料混合物。
[0057]將硬材料混合物剪碎置于高溫墨倉內(nèi)，安裝直徑為0.1毫米的打印機針頭，加載于打印機上備用。
[0058]使用建模軟件構(gòu)建三維立體圓筒狀結(jié)構(gòu):
[0059]首先構(gòu)建一圈輪輻狀結(jié)構(gòu)(圖1)，作為水平向穩(wěn)固支架。輪輻高度為I毫米，間距為15°，內(nèi)徑30毫米，外徑37毫米，指定打印材料為硬材料。
[0060]構(gòu)建4個同心圓結(jié)構(gòu)(圖2)，重疊于輪輻狀結(jié)構(gòu)之上(圖3)。圓高均為I毫米，寬均為0.5毫米。四圓圓心重合，半徑等差0.5毫米，最小圓直徑與輪福結(jié)構(gòu)內(nèi)徑相同，最大圓直徑與輪輻結(jié)構(gòu)外徑相同。四圓由內(nèi)向外依次指定材料如下:硬材料、含上皮細胞軟材料、含軟骨細胞軟材料、硬材料(圖4)。
[0061]將上述全部模型結(jié)構(gòu)復(fù)制并累加，得到完整人工氣管模型(圖5)。
[0062]將模型導(dǎo)入打印機驅(qū)動程序，分層解析。
[0063]將一片無菌載玻片置于打印機作業(yè)平臺上，校準定位打印針頭。
[0064]設(shè)置打印機運行參數(shù):硬材料混合物加熱溫度為185°C，內(nèi)部結(jié)構(gòu)間隙為0.01毫米，墨倉內(nèi)驅(qū)動氣壓為0.3Bar，針頭運行速度為7毫米/秒；軟材料(支氣管上皮細胞生物復(fù)合材料和軟骨細胞生物復(fù)合材料)溫度為室溫，內(nèi)部結(jié)構(gòu)間隙為0.1毫米，墨倉內(nèi)驅(qū)動氣壓為0.1Bar，針頭運行速度為10毫米/秒。
[0065]啟動打印流程，按照上述參數(shù)打印。
[0066]全部支架打印完成后，用超聲霧化機將8%三聚磷酸鈉水溶液均勻噴于人工氣管上。經(jīng)過20分鐘，使之充分交聯(lián)。
[0067]封閉制作完成的人工氣管兩端，將其浸沒于培養(yǎng)液中，檢查氣密性良好。
[0068]本發(fā)明一種生物性復(fù)合人工氣管的制備方法所制備的人工氣管，采用生物相容性好的生物材料配方用于打印人工氣管，并能直接在臨床應(yīng)用，避免了對于供體氣管的依賴；其次，本發(fā)明所用材料具有同時具備柔韌性和一定機械強度，滿足氣管作為胸腔內(nèi)空腔臟器的物理機械性能；再次，本發(fā)明的人工氣管結(jié)構(gòu)多孔疏松，有利于養(yǎng)份的擴散和自體血管的長入；另外，本發(fā)明將由受體自己的氣道上皮細胞和軟骨細胞擴增得到的種子細胞打印在氣管壁內(nèi)，避免了患者對于細胞的排異反應(yīng)；而且，種子細胞由終末分化的成熟細胞組成，避免了使用干細胞所帶來的誘導(dǎo)分化難題和成瘤風(fēng)險；同時，本發(fā)明中的細胞的空間分布在打印中精確可控，按照組織學(xué)規(guī)律分布(上皮朝向管腔，軟骨朝向縱膈)加速了修復(fù)過程；最后，氣管支架可在體內(nèi)降解，減少了異物殘留體內(nèi)所帶來的并發(fā)癥，避免了二次手術(shù)取出的風(fēng)險。
[0069]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種生物性復(fù)合人工氣管的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一，利用支氣管鏡，無菌刷取支氣管上皮細胞，體外培養(yǎng)擴增；提取耳廓軟骨細胞，消化、分散，體外培養(yǎng)擴增； 步驟二，將膠原和透明質(zhì)酸與去離子水混合，經(jīng)濾菌器過濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經(jīng)乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射徹底滅菌，均勻分散于滅菌培養(yǎng)液中； 步驟三，將所述步驟二中所得的軟材料和培養(yǎng)液以1:1的體積比相混合，制成重懸細胞的軟材料混合物； 步驟四，將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風(fēng)櫥內(nèi)使二氯甲烷自然揮發(fā)，制得硬材料混合物； 步驟五，分別將所述步驟一中擴增培養(yǎng)的支氣管上皮細胞和軟骨細胞消化、重懸、計數(shù)并離心，棄去上清后，重懸于所述步驟三的軟材料混合物中，分別制得支氣管上皮細胞生物復(fù)合材料和軟骨細胞生物復(fù)合材料； 步驟六，將所述步驟五中的支氣管上皮細胞生物復(fù)合材料和軟骨細胞生物復(fù)合材料分別置于兩只低溫墨倉內(nèi)，安裝直徑為0.2毫米的打印針頭，加載于3D打印機上備用；將所述步驟四中的硬材料混合物置于高溫墨倉內(nèi)，安裝直徑為0.1毫米的打印機針頭，加載于3D打印機上備用； 步驟七，使用建模軟件構(gòu)建三維立體圓筒狀結(jié)構(gòu):首先構(gòu)建一圈輪輻狀結(jié)構(gòu)，作為水平穩(wěn)固支架，指定打印材料為所述硬材料混合物；然后構(gòu)建4個同心圓結(jié)構(gòu)，重疊于所述輪輻狀結(jié)構(gòu)之上，四圓由內(nèi)向外依次指定材料為:硬材料混合物、支氣管上皮細胞生物復(fù)合材料、軟骨細胞生物復(fù)合材料和硬材料混合物；將全部模型結(jié)構(gòu)復(fù)制并累加，得到完整人工氣管模型； 步驟八，將結(jié)構(gòu)模型導(dǎo)入打印機并進行3D打印，得到生物性復(fù)合人工氣管。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟八具體包括: 步驟1，將結(jié)構(gòu)模型導(dǎo)入打印機驅(qū)動程序，分層解析； 步驟2，將一片無菌載玻片置于打印機作業(yè)平臺上，校準定位打印機針頭； 步驟3，設(shè)置打印機運行參數(shù):硬材料混合物加熱溫度為180-220°C，內(nèi)部結(jié)構(gòu)間隙為0.01-0.25毫米，墨倉內(nèi)驅(qū)動氣壓為0.2-0.4Bar，針頭運行速度為5-10毫米/秒；支氣管上皮細胞生物復(fù)合材料和軟骨細胞生物復(fù)合材料保持室溫，內(nèi)部結(jié)構(gòu)間隙為0.01-0.1毫米，墨倉內(nèi)驅(qū)動氣壓為0.1-0.3Bar，針頭運行速度為10毫米/秒； 步驟4，啟動打印流程，按照設(shè)置的運行參數(shù)打?。? 步驟5，全部生物性復(fù)合人工氣管打印完成后，用超聲霧化機將5-10%三聚磷酸鈉水溶液均勻噴于生物性復(fù)合人工氣管上，使之充分交聯(lián)； 步驟6，封閉制作完成的生物性復(fù)合人工氣管兩端，將其浸沒于培養(yǎng)液中，檢查氣密性并保存。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟二為將5-10%膠原和3-7%透明質(zhì)酸按照質(zhì)體積比與去離子水混合，經(jīng)濾菌器過濾除菌，得到軟材料；將殼聚糖經(jīng)乙醇熏蒸后，于紫外燈下照射24小時徹底滅菌，以5-10%質(zhì)量體積比分散于滅菌培養(yǎng)液中。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟四為將聚乳酸-羥基乙酸共聚物與聚乙二醇按照19:1的比例溶于二氯甲烷中，超聲攪拌使分散均勻后，置于通風(fēng)櫥內(nèi)使二氯甲烷自然揮發(fā)，制得硬材料混合物。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟五為分別將所述步驟一中擴增培養(yǎng)的支氣管上皮細胞和軟骨細胞消化、重懸、計數(shù)并離心，棄去上清后，按照IX16A/毫升的細胞濃度重懸于所述步驟三的軟材料混合物中，分別制得支氣管上皮細胞生物復(fù)合材料和軟骨細胞生物復(fù)合材料。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟七中構(gòu)建的輪輻高度為I毫米，間距為15°，內(nèi)徑為30毫米，外徑為37毫米。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟七中構(gòu)建的4個同心圓結(jié)構(gòu)高均為I毫米，寬均為0.5毫米；四個同心圓圓心重合，半徑等差0.5毫米，最小圓直徑與輪福結(jié)構(gòu)內(nèi)徑相同，最大圓直徑與輪福結(jié)構(gòu)外徑相同。8.一種根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項方法所制備的生物性復(fù)合人工氣管。9.一種根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項方法所制備的生物性復(fù)合人工氣管的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明結(jié)合3D打印技術(shù)提供了一種生物性人工氣管及其制備方法，本發(fā)明所用材料具有同時具備柔韌性和一定機械強度，滿足氣管作為胸腔內(nèi)空腔臟器的物理機械性能；其次，本發(fā)明的人工氣管結(jié)構(gòu)多孔疏松，有利于養(yǎng)份的擴散和自體血管的長入；另外，本發(fā)明將由受體自己的氣道上皮細胞和軟骨細胞擴增得到的種子細胞打印在氣管壁內(nèi)，避免了患者對于細胞的排異反應(yīng)；而且，種子細胞由終末分化的成熟細胞組成，避免了使用干細胞所帶來的誘導(dǎo)分化難題和成瘤風(fēng)險；同時，本發(fā)明中的細胞的空間分布在打印中精確可控，按照組織學(xué)規(guī)律分布加速了修復(fù)過程；最后，氣管支架可在體內(nèi)降解，減少了異物殘留體內(nèi)所帶來的并發(fā)癥，避免了二次手術(shù)取出的風(fēng)險。
【IPC分類】A61F2/04, A61L27/38, A61L27/56, B33Y10/00, A61L27/26, B33Y80/00, A61L27/58
【公開號】CN105056302
【申請?zhí)枴緾N201510532268
【發(fā)明人】李牧, 章文俊, 張洪波, 陳昶, 殷瑞雪, 鄭卉, 邢天龍, 王龍
【申請人】上海市肺科醫(yī)院, 華東理工大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年8月26日