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      二氧化硅納米顆粒及其用于疫苗接種的用圖_4

      文檔序號(hào):9405557閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

      [0068] (a)提供含有基本上純的二氧化硅的納米顆粒,該納米顆粒具有表面官能團(tuán),在該 表面官能團(tuán)上固定有至少一種抗原,
      [0069] (b)將所述納米顆粒施用給在細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、器官或哺乳動(dòng)物中含有的抗原呈 遞細(xì)胞,
      [0070] (C)以如下方式將抗原經(jīng)組織間液靶向到抗原呈遞細(xì)胞:通過(guò)納米顆粒的粒徑調(diào) 節(jié)靶向效率,兩者至少部分地呈反比。
      [0071] 在本發(fā)明方法的步驟(a)中,納米顆粒優(yōu)選通過(guò)以下步驟提供:
      [0072] (a')在含有水、至少一種增溶劑和至少一種胺或氨的介質(zhì)中水解縮聚四烷氧基硅 烷和/或有機(jī)三烷氧基硅烷,其中首先產(chǎn)生初級(jí)粒子的溶膠,并隨即通過(guò)連續(xù)地、按照終止 反應(yīng)措施地控制地計(jì)量加入相應(yīng)的硅烷阻止進(jìn)一步成核,使獲得的納米顆粒達(dá)到所期望的 粒徑,和
      [0073] (a")將至少一種抗原固定在所述納米顆粒的表面官能團(tuán)上,和任選地
      [0074] (a"')分散納米顆粒。
      [0075] 在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(b)中,納米顆粒優(yōu)選施用給動(dòng)物,特別優(yōu)選哺乳動(dòng)物, 完全特別優(yōu)選人類(lèi)。特別是進(jìn)行腸胃外,特別優(yōu)選皮內(nèi)或皮下給藥。
      [0076] 目前在步驟(C)中出乎意料地顯示,可以通過(guò)納米顆粒的粒徑影響二氧化硅顆粒 的革巴向。當(dāng)約150nm的粒徑是上限時(shí),在該上限處還觀(guān)察到一些革El向,而在較小的粒徑時(shí)革巴 向效率提高。顆粒的粒徑范圍優(yōu)選大于Onm小于150nm,特別優(yōu)選5-50nm,完全特別優(yōu)選 10-30nm,最優(yōu)選 13-29nm。
      [0077] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中,靶向效率和納米顆粒在整個(gè)范圍內(nèi)呈反比。效率可 在此線(xiàn)性和非線(xiàn)性地提高,優(yōu)選非線(xiàn)性。
      [0078] 在本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】中可能的是,靶向效率和粒徑之間的反比例不在整個(gè) 粒徑范圍內(nèi)顯示,而是并非在最小的粒徑(并由此在粒徑范圍的端點(diǎn))時(shí)觀(guān)察到與本發(fā)明 相關(guān)地接近靶向效率的最大值。在根據(jù)本發(fā)明方法的實(shí)施方案中,優(yōu)選通過(guò)具有大于/等 于2的自然偶次冪的冪函數(shù)描述靶向效率(在縱坐標(biāo)上)對(duì)粒徑(在橫坐標(biāo)上)的依賴(lài)性, 其拋物線(xiàn)向下開(kāi)口,使得頂點(diǎn)是最大效率。二次函數(shù)是特別優(yōu)選的。換言之,在0_150nm的 上述粒徑范圍內(nèi)直至頂點(diǎn)(轉(zhuǎn)折點(diǎn))觀(guān)察到反比例。
      [0079] 按照該方法可以針對(duì)性地調(diào)節(jié)部分靶向或達(dá)到靶向最大化。在本方法的具體實(shí)施 方式中,超過(guò)50 %的抗原呈遞細(xì)胞導(dǎo)向到淋巴結(jié),優(yōu)選超過(guò)70 %,特別優(yōu)選超過(guò)85 %,完全 特別優(yōu)選超過(guò)95%。反之,為此優(yōu)選,使用具有5-50nm粒徑的納米顆粒。粒徑包括至少二 氧化娃基質(zhì),優(yōu)選整個(gè)納米顆粒。
      [0080] 在根據(jù)本發(fā)明方法的另一實(shí)施方式中,在步驟(C)之后還有其它步驟:
      [0081 ] (d)將納米顆粒攝入抗原呈遞細(xì)胞,和任選地
      [0082] (e)在胞內(nèi)體中釋放抗原。
      [0083] 優(yōu)選的是,在步驟(c)之后進(jìn)行步驟(d)和步驟(e)這兩個(gè)步驟。在細(xì)胞內(nèi)吞作 用后顆粒狀結(jié)合基質(zhì)釋放抗原的動(dòng)力學(xué)可以在步驟(e)中控制,其中抗原通過(guò)所謂的可裂 解的接頭共價(jià)連接到載體上。例如可以構(gòu)建pH敏感鍵、酶切位點(diǎn)(如蛋白酶敏感的接頭) 和/或還原性或氧化性可裂解的接頭作為表面官能團(tuán)。本發(fā)明優(yōu)選的pH敏感鍵通過(guò)某些 酯、二硫化物鍵、腙接頭、酸酐連接、自我裂解的內(nèi)蛋白序列、PH-敏感的螯合劑或聚合物,如 聚乙烯氧化物改性的聚-β-氨基酯來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于步驟(e),通過(guò)不穩(wěn)定接頭作為表面官能 團(tuán)的抗原的共價(jià)連接是必要的,其中腙接頭、二硫化物接頭或酶易接近的肽序列是優(yōu)選的。 此外優(yōu)選的是,抗原在早期胞內(nèi)體中釋放。
      [0084] 本發(fā)明的前述教導(dǎo)及其涉及納米顆粒、其分散體、藥物制劑和應(yīng)用的具體實(shí)施方 式是有效的,且不限于可用在將抗原靶向到抗原呈遞細(xì)胞的方法上,只要這看起來(lái)是有意 義的。
      [0085] 本發(fā)明另一目的還在于在哺乳動(dòng)物中活化免疫系統(tǒng)的方法,在該方法中,在第一 步驟(a)中根據(jù)如上所述的本發(fā)明的方法將納米顆粒導(dǎo)向抗原呈遞細(xì)胞,并且在第二步驟 (b)中活化免疫系統(tǒng)。優(yōu)選活化補(bǔ)體系統(tǒng)。在步驟(b)中,活化效率可以通過(guò)顆粒特性調(diào) 節(jié),為此特別考慮粒徑、表面官能團(tuán)、表面電荷和種類(lèi)、比例、配體(如抗原、PEG、佐劑)的數(shù) 量和密度。在步驟(b)中優(yōu)選的是,活化效率通過(guò)粒徑調(diào)節(jié),兩者至少部分地呈反比。特別 是,活化效率隨粒徑減小而升高。本發(fā)明的前述教導(dǎo)及其涉及將抗原靶向到抗原呈遞細(xì)胞 的方法的【具體實(shí)施方式】是有效的,且不限于可用在哺乳動(dòng)物中用于活化免疫系統(tǒng)或補(bǔ)體系 統(tǒng)的方法上,只要這看起來(lái)是有意義的。
      [0086] 本發(fā)明此外教導(dǎo)了免疫(Vakzinierung),其中將有效量的根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒 和/或具有該顆粒的分散體施用給需要此類(lèi)治療的哺乳動(dòng)物。待治療的哺乳動(dòng)物優(yōu)選是 人。本發(fā)明的前述教導(dǎo)及其【具體實(shí)施方式】是有效的,且不限于可用在治療方法上,只要這看 起來(lái)是有意義的。
      [0087] 本發(fā)明進(jìn)一步教導(dǎo)了誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答、抗體應(yīng)答和/或樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的方法,其 特征在于,將作為分散體和/或藥物制劑存在的根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒施用給哺乳動(dòng)物, 并誘導(dǎo)T細(xì)胞和/或樹(shù)突狀細(xì)胞的增殖和/或中和抗體的形成。在本發(fā)明中,優(yōu)選的有機(jī) 體是人類(lèi)或動(dòng)物。由于根據(jù)本發(fā)明納米顆粒的公開(kāi),使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)⑵溆糜谡T導(dǎo) T細(xì)胞和/或中和抗體。
      [0088] 在此,本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的是,可以將本發(fā)明的納米顆粒(其明顯還可作為根 據(jù)本發(fā)明的藥物制劑使用)以各種劑量施用給有機(jī)體,特別是人類(lèi)患者。在此應(yīng)如此施用, 使得產(chǎn)生盡可能大的量的T細(xì)胞和/或中和抗體。施用的濃度和類(lèi)型可由本領(lǐng)域技術(shù)人員 通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。
      [0089] 與納米顆?;蚱渌幬镏苿┙佑|可以進(jìn)行預(yù)防或治療。例如預(yù)防接種,以便在病毒 性傳染病之前產(chǎn)生主動(dòng)接種防護(hù),應(yīng)至少如此阻止病毒感染,使得在單次病毒入侵后,例如 在傷口中,強(qiáng)烈減少病毒的進(jìn)一步增殖,或幾乎完全殺死入侵的病毒。在免疫應(yīng)答的治療性 誘導(dǎo)中,患者已存感染,進(jìn)行T細(xì)胞和/或中和抗體的誘導(dǎo),以便殺死已在機(jī)體中存在的病 毒或抑制其擴(kuò)增。
      [0090] 本發(fā)明的另一目的在于有機(jī)體的被動(dòng)免疫,其特征在于,獲得通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明 的納米顆粒施用于哺乳動(dòng)物而誘導(dǎo)的T細(xì)胞和/或抗體,并將其施用于其它哺乳動(dòng)物。本 發(fā)明中"其它哺乳動(dòng)物"是指同類(lèi)的和不同類(lèi)的有機(jī)體,雖然不是同類(lèi)有機(jī)體,但其誘導(dǎo)所 述的T細(xì)胞和/或抗體。也可獲得單克隆抗體,尤其在相應(yīng)的人源化后使用。此外同樣可 以從接種的或感染的個(gè)體中獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞,該細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體,該中和抗體針對(duì) 本發(fā)明的納米顆粒,并且以單克隆抗體的形式在被動(dòng)免疫中施用。
      [0091] 在被動(dòng)免疫的情況下,在患者機(jī)體中,例如對(duì)于某些病毒基本上不產(chǎn)生自身的免 疫反應(yīng),而是將T細(xì)胞和/或抗體例如以血清的形式輸給患者。被動(dòng)免疫具有與主動(dòng)免疫 相反的任務(wù),盡可能快地治愈已發(fā)生的感染,或立即保護(hù)免于病毒感染。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人 員而言,例如針對(duì)甲肝、乙肝或FSME的用于被動(dòng)免疫的各種免疫計(jì)劃是已知的。此類(lèi)免疫 計(jì)劃可以通過(guò)針對(duì)特殊的逆轉(zhuǎn)錄病毒,如HIV、貓白血病病毒和其它的病毒通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)來(lái) 調(diào)整。用于被動(dòng)免疫的抗體優(yōu)選是單克隆抗體。其特別是用作聯(lián)合治療的組分。
      [0092] 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,所有上述的以及其它的成分均是常用的,并能夠在常 規(guī)試驗(yàn)中獲得根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的特殊實(shí)施方案。
      [0093] 在本發(fā)明范圍內(nèi)首次提供了超小的二氧化硅一抗原一綴合物,其在免疫后提高有 效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。該綴合物以如下方式描述雙重作用機(jī)制:用于能夠特異性靶向抗原呈 遞細(xì)胞和同時(shí)活化補(bǔ)體。與現(xiàn)有技術(shù)大的納米顆粒相比,小于50nm的納米顆粒具有數(shù)倍高 的靶向效率。由于有效地運(yùn)輸?shù)搅馨凸苤?,可以如下有利地利用組織間液的生物物理學(xué)機(jī) 制:將樹(shù)突狀細(xì)胞導(dǎo)向到淋巴結(jié)。以這種新型運(yùn)輸途徑的納米顆粒的對(duì)流使被動(dòng)靶向成為 可能,由于樹(shù)突狀細(xì)胞在淋巴結(jié)中大量存在使特別多的細(xì)胞被抵達(dá),因此昂貴的細(xì)胞特異 性靶向成為多余。這些性質(zhì)形成可靠地識(shí)別淋巴結(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞的基礎(chǔ)一其中包括交叉反應(yīng) 性(包括靶向外周樹(shù)突狀細(xì)胞)的缺失一并形成可重復(fù)的、可靠的和完全的吞噬作用進(jìn)入 這種抗原呈遞細(xì)胞的基礎(chǔ)。在靶向目標(biāo)上,基于二氧化硅的納米顆粒承擔(dān)了第二個(gè)有利的 性質(zhì),其固有的佐劑效應(yīng)活化了免疫系統(tǒng)和特別是補(bǔ)體系統(tǒng)。當(dāng)活化強(qiáng)度獨(dú)立于所選抗原 時(shí),它可通過(guò)粒徑而改變。為了活化免疫系統(tǒng)或補(bǔ)體系統(tǒng)無(wú)需額外的輔料和/或納米顆粒 表面改性(如聚羥基化)是明顯簡(jiǎn)單化和成本節(jié)約的。
      [0094] 根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒以無(wú)機(jī)、惰性和生物相容性材料為特征,該材料特別可用 于預(yù)防或治療性免疫。為了改善細(xì)胞毒性活性物質(zhì)的治療指數(shù),在此由二氧化硅-抗原-綴 合物開(kāi)發(fā)設(shè)想的納米顆粒同樣是大有希望的策略。特別地,組分的不穩(wěn)定連接確保抗原性 治療劑在身體的特定腔室釋放,使得可期望降低可能的副作用。納米顆粒還以高藥學(xué)穩(wěn)定 性為特征,并且不僅僅是由于其較小的粒徑而能良好操作。該具有單分散體粒徑的超小型 納米分散體有利地適于可無(wú)菌過(guò)濾性。
      [0095] 可理解,本發(fā)明不限于特定的方法、顆粒和條件,如其在此所述的那樣,因?yàn)檫@些 事物可以變化。此外還可理解,目前所用的術(shù)語(yǔ)僅用于特殊實(shí)施方式的描述目的,不應(yīng)限制 本發(fā)明的保護(hù)范圍。如目前在包括從屬權(quán)利要求的說(shuō)明中所使用的一樣,單數(shù)形式,如"一 個(gè)"或"這個(gè)"的詞形包括相應(yīng)的復(fù)數(shù)形式,只要文中沒(méi)有給出明確的其它說(shuō)明。例如,"一 個(gè)抗原"包括單個(gè)抗原或多個(gè)抗原,反之,其可以是相同或不同的,或"一種方法"包括相當(dāng) 的步驟和方法,其對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
      [0096] 接下來(lái),參照【具體實(shí)施方式】的非限制性實(shí)施例更詳細(xì)地闡明本發(fā)明。該實(shí)施例特 別地如下解釋?zhuān)浩洳幌抻诰唧w詳細(xì)闡明的特征組合,而是反之可以自由組合示例性的特征, 只要能解決發(fā)明的問(wèn)題。
      [0097] 實(shí)施例1 :單分散的二氧化硅顆粒的制備
      [0098] 進(jìn)行單分散的二氧化硅顆粒的制備--如在EP 0 216 278 Bl所述的--通過(guò)在 水-醇-氨介質(zhì)中水解四烷氧基硅烷,其中首先產(chǎn)生初級(jí)粒子溶膠,隨后,通過(guò)連續(xù)地、按照 終止反應(yīng)措施地控制地計(jì)量加入四烷氧基硅烷,使所獲得的SiO2顆粒成為所期望的粒徑。 為了制備粒徑為25nm的50g SiO2顆粒,例如需要1.2L作為增溶劑的乙醇、860ml去離子水、 167ml正硅酸四乙酯(TEOS)和28. 5ml 25%的水性氨溶液。
      [0099] 借助于動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)用 Zetas izer Nano ZS (Malvern Instruments, Herrenbe rg, Deutschland)確定球狀二氧化娃顆粒。Malvern-PDI (多分散性指數(shù))的值<0· 1顯示 單分散的分布。通過(guò)REM攝像在圖1中描述了粒徑和顆粒形態(tài)。
      [0100] 實(shí)施例2 :具有N端鏈炔基團(tuán)的OVA肽片段SIINFEKL的制備
      [0101] 在Rink-酰胺樹(shù)脂上通過(guò)Fmoc化學(xué)合成所述肽。使用具有合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的 N-α-Fmoc-保護(hù)的氨基酸。N-甲基-吡咯烷酮用作溶劑。首先在自動(dòng)合成裝置(Applied Biosystems Modell ABI 433 A)上制備肽鏈。在序列合成結(jié)束后脫除末端Fmoc保護(hù)基團(tuán)。 在注射器中手工操作使該聚合物與鏈炔基羧酸偶聯(lián)。小心地用DMF,之后二氯甲烷和甲醇 清洗,并將樹(shù)脂在真空中干燥過(guò)夜。為了分離和去除保護(hù),將樹(shù)脂與5ml的TFA/H20/苯酚/ 三異丙基硅烷(37:1:1:1)混合物摻混,并在室溫下振蕩2小時(shí)。將TFA溶液轉(zhuǎn)移到離心玻 璃杯中,并在4°C下通過(guò)二乙醚的緩慢添加沉淀,離心,通過(guò)兩次添加二乙醚洗滌,干燥,并 溶于2ml H2O/乙腈(I: lv/v)中。通過(guò)具有RP-選擇B柱(150x IOmm)的RP-HPLC在7. 5 分鐘內(nèi)以0 % B-100 % B的梯度進(jìn)行純化(A = H2O和B =乙腈,兩
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