7’-甲基-8’-溴-2-甲氧基苯并[c]吡啶并[4,3,2-mn]吖啶-8-酮在血管生成抑制藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抑制血管生成的應(yīng)用。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及7'-甲基-8'-溴-2-甲 氧基苯并[c]吡啶并[4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮在血管生成抑制藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 視網(wǎng)膜病變、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生與血管生成有密切關(guān)系。
[0003] (1)腫瘤新生血管生成是指在腫瘤組織中，血管內(nèi)皮細(xì)胞在相關(guān)刺激血管生成信 號(hào)的作用下由相對(duì)靜止轉(zhuǎn)為快速生長(zhǎng)，在已存在的血管組織中產(chǎn)生新生血管的過(guò)程，是腫 瘤生長(zhǎng)的重要前提。腫瘤新生血管的生成滿(mǎn)足了腫瘤組織進(jìn)一步生長(zhǎng)代謝的需要，使腫瘤 細(xì)胞不斷分裂增殖，并成為腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要路徑。
[0004]Folkman教授于1971年首次提出了腫瘤的生長(zhǎng)需要新生血管形成。血管生成抑 制劑是通過(guò)抑制促血管生成的生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體及下游信號(hào)通路等抑制新生血管生 成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生?？鼓[瘤新生血管生成治療已成為惡性腫瘤綜合治 療中的重要方法之一。針對(duì)腫瘤新生血管形成或血管生成的治療手段在癌癥治療中占有重 要地位，貝伐單抗等針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)的單克隆抗體生物制劑在臨床上已被 廣泛運(yùn)用。
[0005] (2)在視網(wǎng)膜血管性疾病的病理改變過(guò)程中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)呈高表達(dá) 狀態(tài)；抗VEGF治療的臨床試驗(yàn)證實(shí)，治療可使脈絡(luò)膜新生血管膜縮小、液體滲漏減少，在新 生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性、各種病因的脈絡(luò)膜新生血管膜、糖尿病和靜脈阻塞導(dǎo)致的 黃斑水腫、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變及新生血管性青光眼的治療中，抗VEGF治療顯示出一定程度 的有效性。
[0006] (3)血管生成是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)早期滑膜病理改變的特征之一，也是產(chǎn)生和 維持RA血管翳的主要因素，新血管生成被認(rèn)為形成和維持RA血管翳的重要因素，抑制血管 生成的藥物可以有效緩解RA的病情。
[0007] (4)動(dòng)脈粥樣硬化引起血管阻塞的同時(shí)也涉及到動(dòng)脈新血管生成。新血管從動(dòng)脈 外膜的營(yíng)養(yǎng)血管開(kāi)始生長(zhǎng)并延伸入粥樣斑塊下內(nèi)膜層，這些新生毛細(xì)血管可以起到促進(jìn)粥 樣斑塊生長(zhǎng)的作用。因此抑制血管生成的藥物對(duì)于抗動(dòng)脈粥硬化治療有著重要意義。
[0008] 實(shí)驗(yàn)已經(jīng)建立體內(nèi)外的各類(lèi)血管生成模型，應(yīng)用于抗血管生成藥物篩選。近年來(lái) 新興的模式生物斑馬魚(yú)（Daniorerio)已成為一個(gè)較為理想的血管生成模型，并用于抗血 管生成藥物的篩選。研究表明，以斑馬魚(yú)為材料，成功地構(gòu)建了新血管生成的藥理模型，并 用血管生成抑制藥物（Su5416,TNP470)和vEGF進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與對(duì)哺乳動(dòng)物的作用效果 一致，用實(shí)驗(yàn)證明利用該模型可預(yù)測(cè)藥物對(duì)人的作用效果，即以斑馬魚(yú)作為血管生成模型 篩選小分子藥物是可行的。
[0009] 對(duì)于本發(fā)明涉及的7' -甲基-8' -溴-2-甲氧基苯并[C]吡啶并[4, 3, 2-mn]吖 啶-8-酮在治療糖尿病引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及抗動(dòng)脈粥樣硬化中的 用途屬于首次公開(kāi)，由于其對(duì)于上述疾病的治療強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出 任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí)用于抑制血管生成顯然具有顯著的進(jìn)步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了 7' -甲基-8' -溴-2-甲氧 基苯并[c]吡啶并[4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮在血管生成抑制藥物中的應(yīng)用，所述化合物的結(jié) 構(gòu)如式⑴所示；
[0012]
[0013] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括治療糖尿病引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷。
[0014] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0015] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括治療動(dòng)脈粥樣硬化。
[0016] 本發(fā)明至少包括以下有益效果：通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，7'-甲基-8' -溴-2-甲氧基苯并 [c]吡啶并[4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮可以有效地降低糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷，治 療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及動(dòng)脈粥樣硬化。
[0017] 本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本 發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū) 文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0019] 需要說(shuō)明的是，下述實(shí)施方案中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所 述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 7' -甲基-8' -溴-2-甲氧基苯并[c]吡啶并[4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮的制備，其 具體步驟如下：
[0022] 往盛有5-甲氧基-2- (3- (4-甲基-5-溴-2-氨基苯基）丙-2-炔氨基）-1，4-萘 醌（0. 3mmol)、3.OmL三氟乙酸的單頸瓶中，攪拌加入催化劑三苯基磷氯化金（4. 63mg， 0. 015mmol);升溫60°C反應(yīng)2小時(shí)。減壓濃縮、加入氯仿（30mL)溶解濃縮物。然后有機(jī)溶 液依次用水、飽和~&2〇)3溶液洗滌。有機(jī)層經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥、過(guò)濾后濃縮。濃縮液經(jīng)柱層 析分離提純得到7' -甲基-8' -溴-2-甲氧基苯并[C]吡啶并[4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮。
[0023] 實(shí)施例2
[0024] 2. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0025] 選擇出生l-3d的標(biāo)準(zhǔn)普通級(jí)SD大鼠，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)提供，符合國(guó)家醫(yī)用動(dòng)物 使用標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為清潔級(jí)。
[0026] 2. 2SD大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及高糖模型的建立
[0027] 2. 2. 1配制以下主要試劑
[0028] 含10%胎牛血清培養(yǎng)液、葡萄糖、5-溴-2'脫氧尿苷、4%多聚甲醛、PBS磷酸鹽緩 沖液。
[0029] 2. 2. 2多聚賴(lài)氨酸處理細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板
[0030] 為促進(jìn)所培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的貼壁，于接種前預(yù)先用多聚賴(lài)氨酸處理細(xì)胞培 養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板。方法：于實(shí)驗(yàn)前一天，25mm2培養(yǎng)瓶加入100μg/ml多聚賴(lài)氨酸2. 0ml，均勾 覆蓋瓶底，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜，吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)多聚賴(lài)氨酸，PBS洗三遍，放于37°C培養(yǎng)箱 內(nèi)干燥備用。擬行免疫熒光鑒定的細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)板中預(yù)先放置27_X29mm的蓋 玻片，并如上所述方法用多聚賴(lài)氨酸提前處理。
[0031] 2. 2. 3原代視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞懸液的制備
[0032] 將出生l-3d的SD大鼠浸泡至75%酒精中進(jìn)行消毒5min，超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌取眼 球，于冰浴PBS(含青霉素100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素）洗3遍，顯微鏡下自角鞏 膜緣后約1_處作環(huán)形切口，去除眼前節(jié)組織及玻璃體，鈍性分離出視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，冰 浴PBS漂洗2遍。顯微眼科剪將取出的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層剪成約1mm2大小的組織塊，收集 于離心管內(nèi)。加入約10倍體積的0. 125%胰蛋白酶，37°C消化10_15min。含10%胎牛血清 的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液后400目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾， 1000以1^11離心51^11，收集細(xì)胞沉淀，含1()%胎牛血清的01^1/^12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。細(xì)胞 計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1X1〇6個(gè)/ml。
[0033] 2. 2. 4原代視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的接種培養(yǎng)
[0034] 細(xì)胞懸液制備好后將其接種于事先置有包被了多聚賴(lài)氨酸蓋玻片的6孔板或者 多聚賴(lài)氨酸包被過(guò)的培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)24h時(shí)加入終濃 度為20μg/ml的5-溴-2'脫氧尿苷以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，48h時(shí)換液，此后每2-3d換 液一次。
[0035] 2. 2. 5高糖模型的建立
[0036] 將細(xì)胞懸液接種于24孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)3d時(shí)，選擇30mmol/L葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng) 48h，觀察細(xì)胞形態(tài)。
[0037] 2. 3實(shí)驗(yàn)分組及方法
[0038] ①正常細(xì)胞培養(yǎng)組；②高糖損傷組；③7'-甲基_8'_溴-2-甲氧基苯并[c]吡啶 并[4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮保護(hù)組（70μ mol/L) 〇
[0039] 第①組取原代視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞正常培養(yǎng)，第②組取高糖模型的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞進(jìn) 行培養(yǎng)，第③組取高糖模型的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞并加入7'-甲基_8'_溴-2-甲氧基苯并[c] 吡啶并[4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間在24h和48h時(shí)進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)計(jì) 算細(xì)胞存活率。具體步驟為：首先消化離心收集細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞量用適當(dāng)?shù)募?xì)胞重懸液重 懸細(xì)胞，吸取1〇〇μ1重懸的細(xì)胞至離心管中，加入1〇〇μ1臺(tái)盼藍(lán)染色液，輕輕混勻，染色 3min。吸取少量已染色的細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品至少計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。
[0040] 細(xì)胞存活率=(細(xì)胞總數(shù)一藍(lán)色細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)X100 %。
[0041] 2. 4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0042] 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Y±