50V。當步驟B所得山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)由水栗進入中 空纖維膜時，分子量小于膜孔徑的物質(zhì)隨溶劑透過膜流出設(shè)備，分子量大于膜孔徑的物質(zhì) 被截留在膜表面。經(jīng)過各級中空纖維膜的作用，將藥液進行超濾分離，得到山茱萸美拉德反 應(yīng)各分子量段截留產(chǎn)物。
[0032] D.超濾后樣品處理：對步驟C所得山茱萸美拉德反應(yīng)各分子量段截留產(chǎn)物進行濃 縮，再經(jīng)冷凍干燥制得山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物。
[0033] 實施例4 :山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物的抗氧化作用實驗研究
[0034] 本發(fā)明測定測定山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力，對鐵氰 化鉀的還原能力和對輕自由基的清除能力，步驟如下：
[0035] 1.實驗材料：上述實施例1方法制備的山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物；DPPH(1， 1-二苯-2-苦基肼）；甲醇（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司，14081211220);蘆丁對照品 (中國藥品生物制品檢定所，0080-9705);三氯乙酸（上海化學(xué)試劑有限公司，900420);三 氯化鐵（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，20140915);磷酸二氫鈉（汕頭金砂化工廠，010401); 磷酸氫二鈉（廣東汕頭西隴化工廠，030509);鐵氰化鉀（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司， 20140315)〇
[0036] 2.實驗方法與結(jié)果
[0037] 2· 1 DPPH自由基清除能力的測定
[0038] 將山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物分別配制成20mg·mL1的溶液，作為母液。再將各 山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物母液分別配制成0.l，〇. 2,0. 3,0. 4,0. 5mg·ιΛ1的溶液，分別取 2mL加入2mL0. 25mmol·L1的DPPH甲醇溶液中，輕微振蕩混勻，將反應(yīng)體系置于暗處反應(yīng) 30min，測定反應(yīng)液在517nm處的吸光值，記為以2mL純水（空白）代替樣品溶液，相 同操作，記為Ablank;以甲醇代替DPPH溶液，相同操作，記為Arantrol。計算DPPH自由基清除率 (%)，公式如下：
[0039]DPPH自由基清除率（％)=[Asanple-(Asaniple-A CDntrDl)]/AblankX100%
[0040] 結(jié)果見表1。
[0041] 表1山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物DPPH自由基清除率回歸方程及1(：5。值
[0042]
[0043] 由表1可知，清除DPPH自由基的能力由大到小依次為：山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn) 物 0· 45-0. 22μπι> 0· 22ym-lOOKDa> 50-10KDa> 100-50KDa> 10-4KDa> 小于 4KDa。 DPPH自由基清除率要達到50%，山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物0. 45-0. 22μm所需的濃度最 低，說明山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物0. 45-0. 22μm對DPPH自由基的清除能力最強。
[0044] 2. 2鐵氰化鉀還原能力的測定
[0045] 將山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物分別配制成2,4,6,8,10mg·mL1的溶液，分別取樣 品溶液11^加入111^磷酸鹽緩沖溶液（0.2111〇1.1/，？!16.6，以62.5%磷酸二氫鈉、37.5% 磷酸氫二鈉配制而成）和1 %的鐵氰化鉀溶液lmL，混勻。50°C水浴20min，加入lmL10 % 的三氯乙酸，振蕩搖勾，5000r·min1離心lOmin，取上清液lmL，加入lmL蒸餾水、200μL 0. 1 %的三氯化鐵溶液，振蕩數(shù)秒，靜置15min，測定其在700nm的吸光值，記為Asample。以 lmL蒸餾水代替樣品，相同操作，記為Ablank;以蒸餾水代替所加入的三種試劑，相同操作，記 為Arantrol。結(jié)果見表2和圖1。計算鐵氰化鉀還原能力，公式如下：鐵氰化鉀還原能力A=A-A-A ^sample ^blank ^control
[0046] 表2山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物鐵氰化鉀還原能力回歸方程
[0047]
[0048] 由表2和圖1也可以看出，山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物均對鐵氰化鉀具有不同程 度的還原能力，山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物〇. 45-0. 22μπι的還原鐵氰化鉀的能力明顯大 于其他山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物，當濃度大于6mg·mL1時，其還原能力甚至大于陽性對 照蘆丁。
[0049] 2. 3羥自由基清除能力的測定
[0050] 將山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物樣品配制成0.5,l，2,4,8mg?mL1的溶液作為樣品。 取lmL5mmol*L1鄰二氮菲水溶液于試管中依次加入2mLρΗ7. 4的0. 2mol*L1磷酸緩沖溶 液和lmL樣品溶液，充分混勾后，加入lmL5mmol*L1硫酸亞鐵溶液，混勾后加入lmL0. 1% 的雙氧水，于37°C水浴60min后，在波長536nm處測其吸光度得到Α__。以lmL蒸餾水代 替雙氧水，相同操作，測吸光度Arantrol。以lmL純水代替樣品，相同操作，測吸光度Ablank。計 算公式如下：羥自由基清除率=[(Asanple-AblankV(A_trol-Ablank)]X100%
[0051] 結(jié)果見表3:
[0052] 表3山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物對羥自由基的清除率
[0053]
[0054] 不同濃度山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物對羥自由基清除能力如表3所示。結(jié)果表 明，山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物具有顯著的羥自由基清除能力，不同分子量段山茱萸美拉 德反應(yīng)分級產(chǎn)物的清除羥自由基能力明顯不同，隨著濃度的升高，清除能力先顯著升高，然 后升高趨勢變緩，逐漸穩(wěn)定；而50-10KDa和0. 22ym-100KDa清除羥自由基的能力在顯著提 高達到平衡后不再提高。
[0055] 3結(jié)論
[0056]山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物均對DPPH自由基具有不同程度的清除能力，山茱萸 美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物0. 45-0. 22μm對DPPH自由基的清除能力最強。
[0057]山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物均對鐵氰化鉀具有不同程度的還原能力，山茱萸美拉 德反應(yīng)分級產(chǎn)物0. 45-0. 22μπι的還原鐵氰化鉀的能力明顯大于其他山茱萸美拉德反應(yīng)分 級產(chǎn)物，當濃度大于6mg·mL1時，其還原能力甚至大于陽性對照蘆丁。
[0058] 山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物具有顯著的羥自由基清除能力，不同分子量段山茱萸 美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物的清除羥自由基能力明顯不同。
[0059] 總而言之，山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物具有較強的抗氧化作用，特別是山茱萸美 拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物0. 45-0. 22μm，抗氧化作用最強，均可以制備具有抗氧化性能的保健品 或化妝品。
【主權(quán)項】
1. 一種分離山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物的方法，其特征在于包括以下步驟： A. 藥材的炮制：取凈山茱萸藥材，加入藥材質(zhì)量比例的15-25%黃酒，拌勻，悶潤，待黃 酒吸盡，常壓蒸制，取出，干燥，作為山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物粗品； B. 超濾前樣品處理：取步驟A酒蒸后山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物粗品，加水煎煮提取兩次， 每次40-80min，第一次加藥材質(zhì)量10-14倍量的水，第二次加藥材質(zhì)量8-12倍量的水，合并 水煎液，過濾得濾液，離心，上清液減壓抽濾，得到山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物； C. 超濾：取步驟B所得山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，采用中空纖維膜分級過濾，過膜級數(shù)為 0. 22μm~lKDa，經(jīng)過七級中空纖維膜的作用，將藥液進行超濾分離，得到七級截留分子量 的樣品，為山茱萸美拉德反應(yīng)各分子量段截留產(chǎn)物； D. 超濾后樣品處理：對步驟C所得山茱萸美拉德反應(yīng)各分子量段截留產(chǎn)物進行濃縮， 再經(jīng)冷凍干燥制得山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的方法，其特征在于，超濾過 程中，采用中空纖維膜分級過濾，連接在中空纖維膜設(shè)備上，設(shè)置其操作壓力為0. 1~ 1. OMPa，溫度為室溫，電壓為40-50V。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的方法，其特征在于，采用中空 纖維膜分級過濾，過膜級數(shù)七級分別為〇. 22μm，lOOKDa，50KDa，lOKDa，4KDa，2KDa，lKda，分 別得到分子量為0. 22μπι~lKDa之間的山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的山茱萸美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物在制備具有抗氧化性能保健品 或化妝品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明為中藥領(lǐng)域，具體公開了一種分離山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的方法及其應(yīng)用，它采用超濾技術(shù)對山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進行分離，包括以下步驟：①、藥材的炮制，②超濾前的樣品處理，③超濾，④超濾后樣品處理。經(jīng)超濾后的美拉德反應(yīng)分級產(chǎn)物在進行DPPH自由基清除作用測定、鐵氰化鉀還原能力的測定、羥自由基清除能力測定后，被證明其具有抗氧化的作用。
【IPC分類】A61P39/06, A61K8/97, A23L33/105, A61K36/40
【公開號】CN105250350
【申請?zhí)枴緾N201510783219
【發(fā)明人】楊光明, 潘揚, 李萌, 張玉玲, 燕珂, 蔡寶昌
【申請人】南京中醫(yī)藥大學(xué), 楊光明, 潘揚
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年11月16日