柴胡皂苷在制備調(diào)節(jié)多藥耐藥相關(guān)蛋白活性藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及柴胡皂苷的一種新的醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)是存在于機(jī)體多種組織細(xì)胞膜上,通過外排內(nèi)源性及 外源性毒物、信號(hào)傳導(dǎo)分子等發(fā)揮防御功能與信息交換功能的蛋白,在腫瘤細(xì)胞如有高表 達(dá),是造成腫瘤多藥耐藥的原因之一,"Chen, Z. S. and Tiwari, A. K. Multidrug Resistance Proteins(MRPs/ABCCs)in Cancer Chemotherapy and Genetic Diseases,2011, FEBS Journal, 278 (18) : 3226-3245"文獻(xiàn)公開了所述的MRP的相關(guān)信息和資料。而目前尚缺乏高 效低毒的抑制劑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種柴胡皂苷在制備調(diào)節(jié)多藥耐藥相關(guān)蛋白活性藥物中的 應(yīng)用,以滿足人們的需要。
[0004] 試驗(yàn)證明,所述的柴胡皂苷,可以調(diào)節(jié)MRP的活性,其對(duì)正常組織中的MRP的表達(dá) 無影響,但可降低高表達(dá)組織中MRP的表達(dá)及活性,可在增強(qiáng)療效的同時(shí)降低其毒副作用。
[0005] 可以將治療有效量的所述的柴胡皂苷與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體,采用本領(lǐng)域公知 的方法,制備成為藥物制劑,如乳劑、片劑、顆粒劑、口服液、膠囊、滴丸、丸劑、注射劑等,所 述載體如香料、甜味劑、液體或固體填料或稀釋劑等常用載體物質(zhì),制劑通常含有重量百分 比為1-90%的有效成分,較佳重量含量為30-70% ;
[0006] 可以通過口服或注射途徑施加于需要治療的患者,劑量一般為IOmg~50mg/體重 /天,具體可根據(jù)患者的具體情況,由醫(yī)師決定。
[0007] 所述柴胡皂苷可采用商業(yè)化的產(chǎn)品,或者根據(jù)"柴胡皂苷a、c、d對(duì)照品的制備"文 獻(xiàn)報(bào)道的方法制備獲得。
[0008] 本發(fā)明的MRP蛋白的抑制劑,可以調(diào)節(jié)MRP的活性,其對(duì)正常組織中的MRP的表達(dá) 無影響,但可降低高表達(dá)組織中MRP的表達(dá)及活性,可在增強(qiáng)療效的同時(shí)降低其毒副作用, 有利于逆轉(zhuǎn)由于MRP活性導(dǎo)致的腫瘤多藥耐藥,能夠滿足臨床應(yīng)用的需要。
【具體實(shí)施方式】 [0009] 實(shí)施例1
[0010] 方法:
[0011] (1)攝取實(shí)驗(yàn):分別采用給予谷胱甘肽(GSH)刺激和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法,得到高表達(dá) 的MRP1-HEK293和MRP2-HEK293細(xì)胞;其中MRPl轉(zhuǎn)運(yùn)底物選用秋水仙堿、MRP2底物選用順 鉬,以HPLC法分別測定各組細(xì)胞內(nèi)底物含量,并以BCA法測定細(xì)胞總蛋白含量,計(jì)算單位蛋 白攝取底物的含量。
[0012] 具體操作過程:
[0013] 1)HEK293細(xì)胞接種于IOOmm培養(yǎng)皿中,采用含GSH(2mM)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng), 于對(duì)數(shù)生長期時(shí)加入相應(yīng)的藥物;細(xì)胞經(jīng)藥物處理48h后,移除藥液;后加入秋水仙堿 (50 μ mol *L-1)與細(xì)胞共孵育30min。隨后收集細(xì)胞,預(yù)冷的PBS清洗3次,加入超純水重 懸細(xì)胞,-80°C凍融裂解;15000g離心15min,移取上清。
[0014] 樣品的處理以及細(xì)胞內(nèi)秋水仙堿的含量測定方法參照文獻(xiàn)"馮麗敏,張嫻,趙瑞 芝,醋柴胡對(duì)HEK293細(xì)胞中MRPl蛋白攝取活性、蛋白表達(dá)及mRNA水平的影響,遼寧中醫(yī)雜 志,2014,41(2):310-312"
[0015] 2)MRP2-HEK293細(xì)胞的構(gòu)建:HEK293細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞匯合度達(dá)80% 時(shí),每孔加入Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋的MRP2質(zhì)粒(4 μ g/孔、4 μ g/孔和4 μ g/孔比例加入), 按質(zhì)粒:轉(zhuǎn)染試劑(W/V) = 1:3比例加入轉(zhuǎn)染試劑MegaTranL 0室溫孵育IOmin ;反應(yīng)IOh 后換液為完全培養(yǎng)基。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后,加入400 μ g · mL-1的G418溶液(氨基糖苷類抗 生素)篩選8周。
[0016] MRP2-HEK293細(xì)胞接種于六孔板中,于對(duì)數(shù)生長期加入相應(yīng)的藥物處理24h后,再 加入50 μ g · mL 1的順鉬溶液孵育4h ;收集細(xì)胞、預(yù)冷PBS清洗,裂解細(xì)胞,通過HPLC法測 定細(xì)胞內(nèi)的順鉬含量。
[0017] MRPl 的具體信息,可參見 "Cole SP, Deeley RG, Transport of glutathione and glutathione conjugates by MRPl, Trends in pharmacological sciences2006, 27 (8) :438_446"、"Elaine M.Leslie, Roger G.Deeley,Susan P. C., Multidrug resistance proteins : role of P-glycoprotein, MRPl, MRP2,and BCRP(ABCG2)in tissue defense, Toxicology and Applied Pharmacology2005, 204(3):21 6-237"
[0018] MRP2 的具體信息,可參見 "C C Paulusma, M Kool, P J Bosma, G L Scheffer, F ter Borg, R J Scheper, G N Tytgat, P Borst, F Baas and R 0 Elferink, A mutation in the human canalicular multispecific organic anion transporter gene causes the Dubin-Johnson syndrome Hepatologyl997,25(6):1539 - 1542","TP Schaub,J Kartenbeck,J Konig, o Vogel, R. WitzgalI,Wkriz and D. Kepplerj Expression of the conjugate export pump encoded by the mrp2gene in the apical membrane of kidney proximal tubules,Journal of the American Society of Nephrology,1997:1213-1221,'、"Aldo D. Mottino, Tim Hoffman,Lothar Jennes,Jingsong Caoj Mary Vore Expression of multidrug resistance-associated protein2in small intestine from pregnant and postpartum rats,American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 2001. 280:G1261-G1273,?.
[0019] HEK293的具體信息,可從美國菌種典藏中心(ATCC)獲得,且附有詳細(xì)介紹和說 明。
[0020] (2)以Western Blot法測定各組細(xì)胞中MRPl或MRP2相對(duì)蛋白表達(dá)量。
[0021] 結(jié)果:
[0022] 以高表達(dá)細(xì)胞組攝取量和蛋白表達(dá)量為100 %計(jì)算,柴胡皂苷對(duì)各組細(xì)胞中底物 攝取的影響見表1,對(duì)蛋白影響的結(jié)果見表2。
[0023] 表1柴胡皂苷對(duì)MRPl及MRP2底物攝取的影響
[0025] 表2柴胡皂苷對(duì)MRPl及MRP2蛋白表達(dá)的影響
[0027] 從上表可以看出,柴胡皂苷不影響正常細(xì)胞MRPl及MRP2的蛋白表達(dá)以及底物攝 ??;但顯著減低過表達(dá)細(xì)胞株中這兩種蛋白的表達(dá),并增加其底物攝取,提示其作為腫瘤輔 助治療用藥可增強(qiáng)療效且具有較低的毒性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 柴胡皂苷在制備調(diào)節(jié)多藥耐藥相關(guān)蛋白活性藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述藥物,包括治療有效量的柴胡皂苷與 醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于,所述藥物為乳劑、片劑、膠囊、顆粒劑、口 服液、滴丸、丸劑或注射劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于,所述制劑含有重量百分比為1-90%的有 效成分。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,通過口服或注射途徑施加于需要治療的 患者。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,劑量為20mg~50mg/體重/天。
【專利摘要】本發(fā)明公開了柴胡皂苷在制備調(diào)節(jié)多藥耐藥相關(guān)蛋白活性藥物中的應(yīng)用,試驗(yàn)證明,所述的柴胡皂苷,可以調(diào)節(jié)MRP的活性,其對(duì)正常組織中的MRP的表達(dá)無影響,但可降低高表達(dá)組織中MRP的表達(dá)及活性,可在增強(qiáng)療效的同時(shí)降低其毒副作用。本發(fā)明的MRP蛋白的抑制劑,可以調(diào)節(jié)MRP的活性,其對(duì)正常組織中的MRP的表達(dá)無影響,但可降低高表達(dá)組織中MRP的蛋白表達(dá),增加其底物的攝取活性,可在增強(qiáng)療效的同時(shí)降低其毒副作用,有利于逆轉(zhuǎn)由于MRP活性導(dǎo)致的腫瘤多藥耐藥,能夠滿足臨床應(yīng)用的需要。
【IPC分類】A61K31/704, A61P35/00, A61K31/7048
【公開號(hào)】CN105267229
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410230543
【發(fā)明人】趙瑞芝, 馮麗敏, 陳振興, 王銀潔, 肖傅文, 樊丹彩
【申請(qǐng)人】廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院
【公開日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2014年5月28日