15,16-二氫丹參酮Ⅰ在制備保護血管內(nèi)皮的藥物中的用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及天然藥物領域，具體涉及一種化合物在制備血管內(nèi)皮保護藥物中的用 途。
【背景技術】
[0002] 近年來，我國人群心血管疾病的發(fā)病率和病死率在不斷增長，目前估計有心血管 病患者約2. 9億人，且發(fā)病的年齡段提前?？梢?，心血管疾病已嚴重威脅當今人類生命健 康。心血管疾病包括動脈粥樣硬化、高血壓等，病因和發(fā)病機制復雜多樣，給治療帶來困難。 與西藥相比，傳統(tǒng)中藥具有確切的療效和較小的毒副作用，且有幾千年臨床經(jīng)驗。從傳統(tǒng)中 藥中發(fā)現(xiàn)和制備前體藥物為心血管疾病新藥的開發(fā)與應用開辟了嶄新的道路。丹參為唇 形科鼠尾草屬植物（Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血調(diào) 經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效。丹參被報道具有保護血管內(nèi)皮細胞功能，改善血液循環(huán)，有利于心血 管疾病的治療。丹參含有多種化學成分，其藥理活性各有側重，其中最主要的活性成分是水 溶性的丹參酚酸類成分和脂溶性的丹參酮類成分。有文獻報道，丹參中脂溶性成分具有血 管內(nèi)皮保護作用（馬敏，丹參對血管內(nèi)皮細胞的保護作用，碩士論文，2001)。15, 16-二氫丹 參酮I就是其中的一種活性成分，但目前對它的單獨藥理活性研究較少。了解研究藥物保 護作用及機制對于新藥開發(fā)和應用具有巨大價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 申請人通過大量的試驗篩選，意外發(fā)現(xiàn)15, 16-二氫丹參酮I對于血管內(nèi)皮具有 良好的保護作用，探究其保護機制有利于進一步發(fā)掘丹參-作用靶點和功效，也有利于心 血管疾病新藥的發(fā)現(xiàn)。
[0004] 本申請的一個目的在于保護15, 16-二氫丹參酮I在制備保護血管內(nèi)皮的藥物中 的用途。所述保護血管內(nèi)皮的藥物用于治療心血管疾病，特別是用于預防或治療冠心病、 高血壓、腦出血、腦血栓等。所述保護血管內(nèi)皮的作用是通過調(diào)節(jié)Nrf2_ARE通路進行的。
[0005] 本申請的另一個目的在于保護15, 16-二氫丹參酮I在制備抗氧化的藥物中的用 途。
[0006] 本發(fā)明對15, 16-二氫丹參酮I進行了血管內(nèi)皮保護作用的活性評價試驗： 15, 16-二氫丹參酮I對ox-LDL刺激EA. hy926細胞造成的氧化損傷表現(xiàn)出明顯的保護 作用，并且呈現(xiàn)濃度依賴性。15, 16-二氫丹參酮I的預處理能升高ox-LDL刺激引起的 EA. hy926細胞中SOD酶活力的下降。將15, 16-二氫丹參酮I加入到轉染過質粒的293T 細胞中，可以激活Nrf2下游的ARE元件，增強熒光酶活性的表達。該化合物能直接誘導 EA. hy926細胞中的Nrf2表達，同時增加內(nèi)皮細胞中H0-1、NQ01、GCLC、GCLM基因的表達。 這說明15, 16-二氫丹參酮I可能在激活Nrf2-ARE通路后，成功誘導了下游基因中二相解 毒酶的基因轉錄及表達，從而推測15, 16-二氫丹參酮I保護內(nèi)皮細胞的作用是通過激活 Nrf2-ARE通路后誘導表達多種抗氧化酶而產(chǎn)生的。
【附圖說明】
[0007] 圖1為15, 16-二氫丹參酮I對血管內(nèi)皮細胞作用的表型指標檢測（MTT檢測存活 率）圖，橫坐標為15, 16-二氫丹參酮I濃度（μ M)，縱坐標為細胞活力。
[0008] 圖2為15, 16-二氫丹參酮I對血管內(nèi)皮細胞作用的表型指標檢測（LDH檢測存活 率）圖，橫坐標為15, 16-二氫丹參酮I濃度（μ M)，縱坐標為LDH指標。
[0009] 圖3為15, 16-二氫丹參酮I對血管內(nèi)皮細胞作用的酶功能水平檢測（SOD)圖，橫 坐標為15, 16-二氫丹參酮I濃度（μ M)，縱坐標為SOD指標。
[0010] 圖4為15, 16-二氫丹參酮I對激活ARE-相關熒光素酶活性檢測，橫坐標為 15, 16-二氫丹參酮I濃度（μ M)，縱坐標為熒光素酶倍數(shù)值。
[0011] 圖5為15, 16-二氫丹參酮I對Nrf2、Η0-1、GCLC、GCLM的mRNA水平的影響，橫坐 標為15, 16-二氫丹參酮I濃度（μ M)，縱坐標為目的基因與內(nèi)參基因 GAPDH的比值。
【具體實施方式】：
[0012] 實施例1 :15, 16-二氫丹參酮I化合物的制備
[0013] 1材料與儀器
[0014] 柱層析硅膠（100~200目，200~300目）、薄層層析硅膠H購自青島海洋化工有 限公司（化學純）。提取分離用試劑石油醚（無錫亞盛）、乙酸乙酯（南京化學試劑）、氯仿 (上海凌峰）、甲醇（江蘇漢邦）、丙酮（南京化學試劑）均為分析純，鑒定用試劑甲醇（江 蘇漢邦）、乙腈（默克）為色譜純。丹參酮提取物：購買于山東華信制藥有限公司，丹參總 酮含量約8%。
[0015] AgilentllOO液相色譜-飛行時間質譜系統(tǒng)（Agilent公司）；中壓制備系統(tǒng)（瑞 士 _Β?:_〇?Ι 公司）；旋轉蒸發(fā)儀 Β?(:?Ι Rotavapor R-200(瑞士孩OCHI 公司）。
[0016] 2 方法
[0017] 2.1提取與分離
[0018] 取丹參酮粗提物500g，用適量的乙酸乙酯溶解，加500g 200~300目硅膠拌勻， 水浴上將乙酸乙酯揮干，過60目篩。采用干法裝硅膠柱，裝入約860g拌勻物，約含430g粗 提物。粗分后用中壓制備柱反復進行細分純化，最后細分得到各化合物單體。分離過程中， 根據(jù)待分離化合物性質的不同選用了不同的洗脫系統(tǒng)，包括：石油醚-乙酸乙酯，二氯甲 烷-甲醇，正己烷-乙酸乙酯。
[0019] 2. 2儀器分析條件
[0020] T0F/MS條件：電噴霧離子源參數(shù)：干燥氣流速（N2 Drying gas flow-rate): 10.0 L/min;干燥氣溫度（Drying gas temperature) :33〇°C ;霧化氣壓力（Nebulizer): 241kPa(35psig);毛細管電壓（Capillary voltage) :3000V;裂解電壓（Fragmentor): 120 ~420V ;skimmer voltage，60V ;octapole DC 1，37V ;octapole radio frequency，250VD 數(shù)據(jù)米集和分析分別由 Agilent MassHunter Acquisition 軟件 (Agilent，美國）和 Applied Biosystems/MDS-Sciex Analyst QS 軟件（Frankfurt，德國） 完成。
[0021] 3 結果
[0022] 15, 16-二氫丹參酮I為棕紅色針晶，mp 215~216°C，TOF MS顯示[M+H]+為m/ z 279. 1048, [M+Na]+為 m/z 301. 1，[2M+Na] + 為 m/z 579. 2,可鑒定該化合物分子式為： C18H14O3D
[0023] IH-匪R(300MHz，CDC13) δ :9. 29(1H，d，J = 8. 7Hz，H-1)，7. 57(1H，dd，J = 8.7Hz，H-2)，7.39(lH，d，J = 6.9Hz，H-3)，8.30(lH，d，J = 8.7Hz，H-6)，7.75(lH，d，J = 8. 7Hz，H-7)，4. 43 (1H，dd，J = 6. 3Hz，H-15)，4. 96 (1H，t，J = 9. 6Hz，H-15)，3. 65 (1H，M，H-16 )，I. 41 (3H，d，J = 6. 9Hz，Me-17)，2. 70 (3H，s，Me-18)，以上數(shù)據(jù)與文獻（章敏·丹參中具有 醌還原酶誘導活性化合物的發(fā)現(xiàn)[D].浙江大學碩士學位論文，2010年）報道的15, 16-二 氫丹參酮I (15, 16-dihydrotanshinone I )數(shù)據(jù)一致，此化合物鑒定為15, 16-二氫丹參 酮I。其結構式如下：
[0025] 將實施例1制備的15, 16-二氫丹參酮I，進行了下述藥效學實驗。
[0026] 實驗例2 :15, 16-二氫丹參酮I對血管內(nèi)皮細胞作用的表型指標檢測（MTT、LDH)
[0027] 1材料與儀器
[0028] EA. hy926細胞：購自ATCC公司，由本實驗室保存。DMEM高糖培養(yǎng)基（ATCC公 司），胎牛血清、〇· 25%胰酶、青霉素 lOkU/mL、鏈霉素10kU/mL(Invitrogen公司），PBS(北 京博奧森生物技術有限公司），RIPA裂解液、氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)(北京協(xié)生生物 科技有限責任公司），PhosSTOP、complete ULTRA Tablets，MiniEASYpack(Roche 公司）， MTT(Bi〇Sharp公司），乳酸脫氫酶（LDH)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。
[0029] 超凈臺（美國 Thermo 公司，ThermoScientif ic 13〇ΟΑ2 型），酶標儀（Biotek 公司， Synergy 2型），電熱恒溫水浴鍋（國華電器有限公司，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋），CO2培養(yǎng)箱 (美國 Thermo 公司，series 2 Water Jacket)，離心機（美國 Thermo 公司，F(xiàn)rescol7)，天 平（北京賽多利斯科學儀器有限公司，BT 224S)，細胞培養(yǎng)耗材、微量移液器：美國Thermo 公司。
[0030] 2 方法
[0031] 2. I EA. hy926細胞的培養(yǎng)與傳代
[0032] EA.hy926 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，置飽和濕度、37 °C的5 % CO2培養(yǎng)孵箱中培養(yǎng)。EA. hy926細胞用含EDTA的0. 25 % 胰蛋白酶處