漢黃芩素在治療急性腎損傷中的用途及其制備的治療急性腎損傷藥物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物工業(yè)領域，涉及漢黃芩素的醫(yī)藥新用途，具體涉及漢黃芩素在治 療急性腎損傷時的用途。
【背景技術】
[0002] 急性腎損傷（Acute Kidney Injury, AKI)是臨床常見危重疾病，可導致腎臟不完 全修復、持續(xù)慢性炎癥和進展性纖維化，是引起繼發(fā)性慢性腎臟病、腎衰竭及住院患者死亡 的重要原因。迄今為止AKI尚無任何有效治療措施，因此，尋找可以減輕組織損傷、促進修 復、防止慢性纖維化發(fā)生的腎臟保護藥物具有重要意義。
[0003] 漢黃苳素（Wogonin)是從唇形科植物黃苳、半枝蓮及夾竹桃科植物鱔藤等植物中 分離得到的一種重要的黃酮類化合物，它主要存在于以上植物的根和莖中。以往研究結果 顯示，漢黃芩素具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒及神經(jīng)保護作用等， 其中抗腫瘤活性是目前國、內外研究的熱點之一，但其防治急性腎損傷時的藥理學作用尚 未報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供漢黃芩素新的藥物用途，具體涉及漢黃芩素在防治急性腎 損傷時的用途。
[0005] -種漢黃苳素，分子式為C16H1205，其化學結構式如下：
[0007] 其作為防治急性腎損傷藥物的應用。
[0008] 所述的漢黃芩素制備的治療急性腎損傷藥物，其特征在于：該藥物由所述的漢黃 芩素以及藥學上可接受的輔助劑制得。
[0009] 所述的利用漢黃芩素制備的治療急性腎損傷藥物，其特征在于其劑型為注射劑、 片劑、丸劑、膠囊、懸浮劑或乳劑。
[0010] 本發(fā)明的有益效果為：實驗結果證實漢黃芩素可有效減輕急性腎損傷，保護腎功 能，其作用機制與漢黃芩素降低炎癥因子水平有關，應用前景廣泛。
【附圖說明】
[0011] 圖1漢黃芩素（wog)減輕體外實驗中順鉑（Cisplatin)引起的腎小管上皮細胞損 傷。如圖（a) :MTT結果表明漢黃芩素明顯減輕順鉑對HK2細胞的生長抑制作用；圖（b): Western Blot及半定量分析結果顯示漢黃芩素可抑制順鉑刺激的腎臟損傷分子（IQM-1) 的蛋白表達水平。
[0012] 圖2漢黃芩素（wog)抑制體外實驗中順鉑（Cisplatin)誘導的炎癥因子水平。圖 (a) :Real-time PCR結果表明漢黃芩素能明顯降低順鉑誘導HK2細胞中TNF-α的mRNA水 平；圖（b):漢黃芩素能明顯降低順鉑誘導HK2細胞中IL-Ιβ的mRNA水平。
[0013] 圖3漢黃芩素（wog)降低小鼠急性腎損傷模型中血肌酐和血尿素氮水平，提示其 對腎功能的保護作用。圖（a):不同濃度的漢黃芩素可不同程度地降低小鼠急性腎損傷模 型中血肌酐的含量；圖（b):漢黃芩素降低小鼠急性腎損傷模型中血尿素氮的含量。
[0014] 圖4漢黃芩素（wog)降低小鼠急性腎損傷模型腎臟組織中的炎癥因子水平。圖 (a) :Real-time PCR結果顯示漢黃芩素能明顯降低小鼠急性腎損傷模型中TNF- a mRNA水 平；圖（b):漢黃芩素明顯降低小鼠急性腎損傷模型中E-li3mRNA水平。
【具體實施方式】
[0015] 實施案例1 :漢黃芩素在體外對順鉑誘發(fā)腎小管上皮細胞損傷的保護作用；
[0016] MTT法：將人腎小管上皮細胞（HK2)細胞接種于96孔板中，接種密度約為 4000個細胞/孔。培養(yǎng)24h，換用無血清培養(yǎng)基饑餓12小時后，分組加入順鉑和漢黃芩 素，分別為正常組（NC)、模型組（Cisplatin 3.0μg/ml)、漢黃芩素低劑量（Cisplatin 3. 0 μ g/ml+WogO. 625 μ g/ml)、中劑量（Cisplatin 3. 0 μ g/ml+Wogl. 25 μ g/ml)、高劑量組 (Cisplatin 3. 0 μ g/ml+Wog2. 5 μ g/ml)，繼續(xù)培養(yǎng) 24h。培養(yǎng)結束后每孔加入 5g，L 1 的 MTT 溶液20 μ L，繼續(xù)培育4h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μ L的DMS0,振蕩，混勻。用酶標儀在 492nm處測定各孔0D值，記錄結果。以細胞存活率（Cell viability)對劑量作圖。結果計 算：細胞存活率=(試驗組細胞0D值-空白組細胞0D值）八對照組細胞00值-空白組細 胞 0D 值）X100%。
[0017] Western Blot :將對數(shù)生長期的HK2細胞接種于6孔板中，分別分為正常組（NC)、 模型組（Cisplatin 3.0μg/ml)和漢黃苳素組（Cisplatin 3.0以8/1111+1〇82.5以8/1111)，每 組重復3-4次實驗。接種密度約為1. OX 105個細胞/ml，孵育24小時用無血清培養(yǎng)基饑餓 12小時后分別加入刺激及藥物。繼續(xù)培養(yǎng)24小時。PBS洗三遍，收集細胞，提取總蛋白，通 過Western Blot法檢測腎臟損傷分子KIM-1的蛋白表達并進行半定量分析。
[0018] 實驗結果如圖1中圖（a)，即MTT結果顯示，順鉑刺激的HK2細胞經(jīng)過低、中、 高濃度的漢黃芩素處理后，該細胞的相對存活率值從順鉑刺激組的46. 44%分別升高到 76. 72%、68. 12%和84. 32%，存活率增加約1. 8倍。說明漢黃芩素對順鉑刺激的腎小管上 皮細胞具有較好的保護作用。
[0019] 圖（b)即Western Blot及半定量分析結果顯示，順鉬刺激的HK2細胞經(jīng)過漢黃苳 素處理后，腎臟損傷分子MM-1的蛋白表達水平明顯受到抑制，證明漢黃芩素對順鉑引起 腎小管上皮損傷的保護作用。
[0020] 實施案例2 :漢黃芩素對體外順鉑誘導炎癥因子的抑制作用；
[0021] 將HK2細胞接種于12孔板中，分別分為正常組（NC)、模型組（Cisplatin3. 0 μ g/ ml)和漢黃苳素組（Cisplatin 3. 0 μ g/ml+Wog2. 5 μ g/ml)，每組重復3-4次實驗。接種密 度約為0. 5 X 105個細胞/孔，孵育24小時用無血清培養(yǎng)基饑餓12小時后分別加入刺激及 藥物。繼續(xù)培養(yǎng)24小時。PBS洗三遍，收集細胞，提RNA，逆轉錄，擴增。
[0022] Real time PCR結果如圖2中圖（a)，順鉑明顯誘導腎小管上皮細胞中TNF-amRNA 水平的升高，而漢黃芩素處理組TNF-a mRNA表達明顯被抑制，圖（b)結果顯示腎小管上皮 細胞受到順鉑刺激后經(jīng)漢黃芩素處理，其IL-1 β mRNA表達明顯下降，提示漢黃芩素可顯著 抑制順鉑誘發(fā)的炎癥反應。
[0023] 實施案例3 :漢黃芩素對急性腎損傷模型中血肌酐（Creatinine)和血尿素氮 (BUN)的影響。
[0024] 將6-8周齡C57BL/6小鼠適應性培養(yǎng)1-2天，分為正常對照組（NC)、模型組 (Cisplatin 20mg/kg)、漢黃苳素低劑量組（Cisplatin 20mg/kg+Wog 12.5mg/kg)、中劑量 組（Cisplatin 20mg/kg+Wog 25mg/kg)、高劑量組（Cisplatin 20mg/kg+Wog50mg/kg)，每 組6-10只。小鼠腹腔注射20mg/kg順鉑建立急性腎損傷模型并注射低、中、高劑量的漢黃 芩素進行藥物干預，3天后麻醉狀態(tài)下收取血清樣本及腎組織，并根據(jù)血肌酐和尿素氮試劑 盒說明書檢測動物模型血清中肌酐和尿素氮的含量（購自南京建成生物工程研究所），
[0025] 肌酐測試
[0027] 肌酐含量（μ mol/L)=[(測定A2-K*測定A1)-(空白A2-K*空白Al)]/[(標準 A2-K*標準A1)-(空白A2-K*空白）]*標準品濃度（442 μ mol/L)
[0028] 注：稀釋因子K =(加樣量+酶溶液A體積V (加樣量+酶溶液A體積+酶溶液 B 體積）=186/246
[0029] 尿素氮測試
[0030]
[0031 ] 尿素氮含量（mmol/L)=(測定0D值-空白測定值）八標準00值-空白00值）* 標準濃度（10mm〇l/L)*樣本測試前稀釋倍數(shù)
[0032] 實驗結果如圖3中圖（a)顯示，順鉑誘導模型組中血肌酐含量明顯升高，腎功能惡 化，而不同濃度的漢黃芩素有效降低模型組血肌酐水平，圖（b)結果同樣顯示不同濃度的 漢黃芩素有效降低模型組尿素水平，進一步證實漢黃芩素對急性腎損傷時腎功能具有保護 作用。
[0033] 實施案例4 :漢黃芩素對急性腎損傷模型中炎癥的抑制作用；
[0034] 將6-8周齡C57BL/6小鼠適應性培養(yǎng)1-2天，分為正常對照組（NC)、模型組 (Cisplatin 20mg/kg)、漢黃苳素低劑量組（Cisplatin 20mg/kg+Wog 12.5mg/kg)、中劑量 組（Cisplatin 20mg/kg+Wog 25mg/kg)、高劑量組（Cisplatin 20mg/kg+Wog50mg/kg)，每 組6-10只。小鼠腹腔注射20mg/kg順鉑建立急性腎損傷模型并注射低、中、高劑量的漢黃 芩素，3天后麻醉狀態(tài)下收取血樣及腎組織，提取組織RNA，逆轉錄，擴增。
[0035] Real-time PCR結果如圖4中圖（a)，急性腎損傷模型中炎癥因子TNF- a mRNA水 平顯著上升，而漢黃芩素可明顯降低炎癥因子水平，改善炎癥，圖（b)結果同樣顯示，漢黃 芩素可降低順鉑引起的模型組腎臟IL-1 β mRNA高表達，這可能是漢黃芩素保護急性腎損 傷的作用機制之一。
【主權項】
1. 一種漢黃苳素，分子式為C16H1205，其化學結構式如下：其作為防治急性腎損傷藥物的應用。2. -種利用如權利要求1所述的漢黃芩素制備的治療急性腎損傷藥物，其特征在于： 該藥物由所述的漢黃芩素以及藥學上可接受的輔助劑制得。3. 根據(jù)權利要求2所述的利用漢黃芩素制備的治療急性腎損傷藥物，其特征在于其劑 型為注射劑、片劑、丸劑、膠囊、懸浮劑或乳劑。
【專利摘要】，涉及漢黃芩素的醫(yī)藥新用途，具體涉及漢黃芩素有效降低急性腎損傷所引起的炎癥反應，進而發(fā)揮腎臟保護作用。
【IPC分類】A61K31/352, A61P13/12
【公開號】CN105287488
【申請?zhí)枴緾N201510665468
【發(fā)明人】孟曉明, 李俊, 李增, 李海迪, 吳偉鋒, 任桂靈, 高麗, 黃成 , 張磊, 徐濤, 李小楓, 馬陶陶, 黃艷
【申請人】安徽醫(yī)科大學
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年10月12日