含膠原蛋白與透明質(zhì)酸的細(xì)胞組織膠體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于一種含膠原蛋白與透明質(zhì)酸的細(xì)胞組織膠體。
【背景技術(shù)】
[0002] 在治療退化性疾病中，干細(xì)胞療法被視為是一種相當(dāng)有希望的方法。然而，將干細(xì) 胞保留在病患體內(nèi)的植入位置（implantationsite)并且維持其存活度以實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)仍 具有一定的挑戰(zhàn)性。因此，研發(fā)一種介質(zhì)（例如細(xì)胞組織膠體）使干細(xì)胞伴隨著高存活度 地移植于特定位置為目前相關(guān)產(chǎn)學(xué)界亟需達(dá)到的重要目標(biāo)之一。
[0003] 傷口愈合是一種對(duì)組織損傷的自然修復(fù)反應(yīng)。愈合是由細(xì)胞一連串復(fù)雜的交互作 用而產(chǎn)生，使受傷皮膚的抗拉強(qiáng)度能重鋪（resurfacing)、重建（reconstitution)和修復(fù) (restoration)。與非糖尿病患者相比，糖尿病患者的傷口需要更長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行愈合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種含膠原蛋白與透明質(zhì)酸的細(xì)胞組織膠體，其中以整體重量為基 礎(chǔ)，該膠原蛋白與該透明質(zhì)酸的比例介于0.01 :1-100 :1之間，例如0.05-100 :1、1-50 :1、 100 :1、75 :1、50 :1、30 :1、25 :1、15 :1、10 :1、5 :1、1 :1、0· 5 :1、0· 2 :1 或 0· 1 :1。該透明質(zhì)酸 的濃度可為 〇· 〇〇l_l〇〇mg/ml(例如：0· 01 至 1mg/ml、0. 5 至 100mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、 1 · 5mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、75mg/ ml或lOOmg/ml)，而該膠原蛋白的濃度可為0.OOlmg/ml至lOOmg/ml(例如，l-100mg/ml、 10-100mg/ml、100mg/ml、75mg/ml、50mg/ml、30mg/ml、25mg/ml、15mg/ml、10mg/ml或 5mg/ ml)。舉例來(lái)說(shuō)，膠原蛋白的濃度介于0.l-100mg/ml，而透明質(zhì)酸的濃度為0. 01-35mg/ml。 在一實(shí)施例中，膠原蛋白的濃度介于3-40mg/ml(例如6mg/ml或9mg/ml)，而透明質(zhì)酸的濃 度為0. 2-20mg/ml。在另一實(shí)施例中，透明質(zhì)酸的濃度為0. 5-100mg/ml，而膠原蛋白的濃度 為 5_50mg/ml〇
[0005] 本發(fā)明的細(xì)胞組織膠體可進(jìn)一步包含可供細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)素（例如：細(xì)胞培 養(yǎng)基或維他命）、生物活性劑、一個(gè)或多個(gè)基質(zhì)要素以及/或干細(xì)胞。該生物活性劑可 為生長(zhǎng)因子，例如上皮生長(zhǎng)因子（epidermalgrowthfactor)、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (fibroblastgrowthfactor,FGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelialgrowth factor,VEGF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connectivetissuegrowthfactor)、血小板衍生性 生長(zhǎng)因子（platelet-derivedgrowthfactor,F1DGF)、類膜島素生長(zhǎng)因子（insulin-like growthfactor)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nervegrowthfactor)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growthfactor,HGF)、細(xì)胞聚落刺激因子（colony-stimulatingfactor)、干細(xì)胞因子 (stemcallfactor)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocytegrowthfactor)、顆粒球細(xì)胞 聚落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor)、顆粒球巨細(xì)胞聚落刺激 因子（granulocytemacrophagecolony-stimulatingfactor)、膠質(zhì)衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子（glial-derivedneurotropicfactor)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ciliaryneurotrophic factor)、內(nèi)皮單核細(xì)胞活化多勝肽（endothelial-monocyteactivatingpolypeptide)、 上皮中性粒細(xì)胞活化勝肽（epithelialneutrophilactivatingpeptide)、紅血球生成 素（erythropoietin)、骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein)、大腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 因子（brain-derivedneurotrophicfactor)、BRAK、車專化生長(zhǎng)因子-β(transforming growthfactorbeta)或腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor)中的一種或多種。所 述基質(zhì)要素包括，但不限于：明膠（gelatin)、纖維連接蛋白（fibronectin)、彈性蛋白 (elastin)、細(xì)胞黏合素（tenacin)、層黏蛋白（laminin)、玻璃連接蛋白（vitronectin)、多 勝肽（polypeptides)、硫酸肝素（heparansulfate)、軟骨素（chondroitin)、硫酸軟骨素 (chondroitinsulfate)、角質(zhì)素（keratan)、硫酸角質(zhì)素（keratansulfate)、硫酸皮膚素 (dermatansulfate)、鹿角菜膠（carrageenan)、肝素（heparin)、幾丁質(zhì)（chitin)、幾丁聚 糖（chitosan)、褐藻膠（alginate)、瓊脂糖（agarose)、瓊脂（agar)、纖維素（cellulose)、 甲基纖維素（methylcellulose)、駿基甲基纖維素（carboxylmethylcellulose)或肝 醣（glycogen)中的一種或多種。當(dāng)所述細(xì)胞組織膠體含有明膠時(shí)，明膠的濃度可介于 0. 01-100mg/ml之間（例如lmg/ml)。較佳的，于所述含有明膠的細(xì)胞組織膠體中，膠原蛋 白以及透明質(zhì)酸的濃度分別介于6-40mg/ml之間以及0. 2-20mg/ml之間。
[0006] 本發(fā)明亦提供一種輸送細(xì)胞（例如干細(xì)胞）至一受體的方法，包含（i)提供一含 有上述細(xì)胞組織膠體的細(xì)胞植入體，使細(xì)胞生長(zhǎng)于所述細(xì)胞組織膠體中；以及（ii)將所述 細(xì)胞植入體置于受體內(nèi)的某一位置。此外，使用所述細(xì)胞組織膠體制備一種用于細(xì)胞輸送 的細(xì)胞植入體的方法也屬于本發(fā)明的范疇。
[0007] 本發(fā)明的細(xì)胞組織膠體可用于一個(gè)體的傷口中，以治療或促進(jìn)傷口愈合。
[0008] 下文特舉一些實(shí)施例作本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的其他目的或特征將呈現(xiàn)于下 述實(shí)施例及申請(qǐng)專利范圍中。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1顯示不同配比的細(xì)胞組織膠體對(duì)細(xì)胞增生的影響。圖1A為各種細(xì)胞組織膠 體對(duì)于活化的HL-60細(xì)胞的增生效果。圖1B為各種細(xì)胞組織膠體對(duì)于RAW264. 7細(xì)胞的增 生效果。圖1C為各種細(xì)胞組織膠體對(duì)于NIH3T3細(xì)胞的增生效果。
[0010] 圖2顯示不同配比的細(xì)胞組織膠體對(duì)發(fā)炎細(xì)胞的影響。圖2A為各種細(xì)胞組織膠 體對(duì)于活化的HL-60細(xì)胞的影響。圖2B為各種細(xì)胞組織膠體對(duì)于U937細(xì)胞的影響。
[0011] 圖3顯示不同分子量的透明質(zhì)酸對(duì)細(xì)胞趨化作用的影響。圖3A為各透明質(zhì)酸對(duì) 于活化的HL-60細(xì)胞的趨化作用結(jié)果。圖3B為各透明質(zhì)酸對(duì)于RAW264. 7細(xì)胞的趨化作 用結(jié)果。
[0012] 圖4顯示不同濃度及不同分子量的透明質(zhì)酸（HA)對(duì)TGF-βl、TGF-f3 2與TGF-0 3 表現(xiàn)的影響。
[0013] 圖5顯示各種細(xì)胞組織膠體對(duì)傷口愈合的影響。圖5A為不同的處理天數(shù)下，傷口 愈合的狀況。圖5B為不同的處理天數(shù)下，傷口大小的改變。
[0014] 圖6顯示在傷口植入各細(xì)胞組織膠體后1個(gè)月（圖6A)及2個(gè)月（圖6B)的組織 切片。
[0015] 圖7顯示各細(xì)胞組織膠體對(duì)糖尿病患者傷口愈合的影響。圖7A為不同的處理天 數(shù)下，傷口愈合的狀況。圖7B為不同的處理天數(shù)下，傷口大小的改變。
[0016] 圖8顯示豬傷口的矩陣模式，A為2個(gè)月大的蘭嶼豬側(cè)面?zhèn)谑疽鈭D；B為豬傷口 矩陣放大圖。
[0017] 圖9顯示在各細(xì)胞組織膠體處理下，豬傷口的愈合情況。
[0018] 圖10顯示豬的傷口在細(xì)胞組織膠體處理后2個(gè)月（圖10A)及6個(gè)月（圖10B) 的結(jié)果。
[0019] 圖11顯示在不同處理下，豬傷口愈合情況。
[0020] 圖12顯示膠原蛋白（圖12A)與透明質(zhì)酸（圖12B)對(duì)干細(xì)胞增生的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明是關(guān)于一種含有膠原蛋白與透明質(zhì)酸的細(xì)胞組織膠體，所述膠原蛋白與所 述透明質(zhì)酸的重量比為 〇· 01:1-100 :1(例如：〇· 05-100 :1、1-50 :1、100 :1、75 :1、50 :1、30 : 1、25 :1、15 :1、10 :1、5 :1、1 :1、0. 5 :1、0. 2 :1或0. 1 :1)，且所述細(xì)胞組織膠體可選擇性地 包括一個(gè)或多個(gè)其他成分，例如基質(zhì)要素、生物活性劑以及可供細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)素。
[0022] 膠原蛋白
[0023] 任何自然產(chǎn)生的膠原蛋白或具有其功能性的膠原蛋白變異體均可被用來(lái)制備 本發(fā)明的細(xì)胞組織膠體。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有28種帶有不同遺傳訊息的膠原蛋白。膠 原蛋白可以從富含膠原蛋白的組織（例如皮膚、肌腱、韌帶及人類或動(dòng)物的骨頭）中單 獨(dú)分離或純化出來(lái)。分離及純化膠原蛋白的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員皆知的方法，亦可 參見(jiàn)所附的文獻(xiàn)：美國(guó)第5, 512, 291號(hào)專利、美國(guó)第2004/0138695號(hào)專利、Methodsin Enzymology,vol. 82,ρρ· 33-64, 1982、ThePreparationofHighlypurifiedInsoluble Collagen,Oneson,I. ,etal. ,Am.LeatherChemistsAssoc. ,Vol.LXV,pp. 440-450, 1970 以及美國(guó)第6, 090, 996號(hào)專利。膠原蛋白也可通過(guò)重組技術(shù)，如AdvancedTissue Sciences(LaJolla,Calif.)所述的重組技術(shù)制備而成，或市售購(gòu)得，例如Fibergen或 SouthSanFrancisco,Calif. 〇
[0024] 以下利用實(shí)例進(jìn)行說(shuō)明。將小牛的深屈肌腱移除脂肪與筋膜（fascia)后，用水清 洗并冷凍，之后切成數(shù)個(gè)厚度均為〇. 5毫米的肌腱薄片。取適量的肌腱薄片置入50毫升的 水中，于室溫下進(jìn)行第一次萃取，所需時(shí)間為24小時(shí)。將水溶性部份去除后，將肌腱薄片置 入酸性溶液（例如0.2N鹽酸溶液）中，于適當(dāng)溫度下（例如室溫下）進(jìn)行一段時(shí)間（例如 12-24小時(shí)）的萃取，隨后將酸性溶液去除，并以水沖洗肌腱薄片以去除殘留的酸。經(jīng)沖洗 后的肌