堿醋酶 抑制劑（如多奈贓齊(donepezil)，加蘭他敏(galantamine)，利斯的明（rovastigmine)和他 克林(tacrine))，NMDA受體括抗劑(如下苯那嗦(memantine))，淀粉樣蛋白朗太聚集抑制劑， 抗氧化劑，丫-分泌酶調(diào)節(jié)物，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)模擬物或NGF基因療法，PPARy激動(dòng)劑， 歷S-CoA還原酶抑制劑(他汀類(lèi)），丙嗦類(lèi)，巧通道阻斷劑，GABA受體括抗劑，糖原合酶激酶抑 制劑，靜脈內(nèi)免疫球蛋白，毒葦堿(muscarinic)受體激動(dòng)劑，煙堿(nicrotiniC)受體調(diào)節(jié) 物，主動(dòng)或被動(dòng)淀粉樣蛋白朗太免疫，憐酸二醋酶抑制劑，5-徑色胺受體括抗劑和抗淀粉樣 蛋白朗太抗體。在某些實(shí)施方案中，因其減輕神經(jīng)藥物的一種或多種副作用的能力而選擇至 少一種另外的治療劑。
[0092] 運(yùn)樣的W上所述的組合療法包括聯(lián)合給藥(其中兩種W上治療劑被包含在相同或 分開(kāi)的制劑中）和分別給藥，在每種情形中，本發(fā)明的融合構(gòu)建體的給藥可W發(fā)生在另外的 治療劑和/或輔藥的給藥之前、同時(shí)和/或之后。本發(fā)明的融合蛋白也可W與其它介入療法 組合使用，介入療法諸如，但不限于，放射療法，行為療法，或本領(lǐng)域中已知的且對(duì)于待治療 或預(yù)防的神經(jīng)病癥來(lái)說(shuō)是合適的其它療法。本發(fā)明的針對(duì)R/BBB的單價(jià)結(jié)合實(shí)體及任何 另外的治療劑)可W通過(guò)任何合適的方法給藥，包括胃腸外給藥，肺內(nèi)給藥和鼻內(nèi)給藥，并 且，如果局部治療需要，病灶內(nèi)給藥。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮 下給藥。
[0093] 給藥可W是通過(guò)任何適合途徑，例如通過(guò)注射，例如靜脈內(nèi)或皮下注射，部分地取 決于給藥是短期的還是長(zhǎng)期的。本文中涵蓋各種定量給藥方案，包括，但不限于，單次 (monovalent)給藥或在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)多次給藥、推注給藥及脈沖輸注。
[0094] 轉(zhuǎn)運(yùn)所述融合構(gòu)建體或化合物穿過(guò)BBB的基于脂質(zhì)的方法包括，但不限于，將所述 融合構(gòu)建體或化合物包封在與單價(jià)結(jié)合實(shí)體偶聯(lián)的脂質(zhì)體中，其與BBB的血管內(nèi)皮上的受 體結(jié)合(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)20020025313)，并且將所述單價(jià)結(jié)合實(shí)體涂敷在低 密度脂蛋白顆粒(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)20040204354)或載脂脫脂蛋白E(例如，參 見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)20040131692)上。
[0095] 為了預(yù)防或治療疾病，本發(fā)明的融合蛋白的合適劑量（當(dāng)單獨(dú)或與一種或多種其 它另外的治療劑組合使用時(shí))將取決于待治療疾病的類(lèi)型、融合構(gòu)建體的類(lèi)型、疾病的嚴(yán)重 性和進(jìn)程、所述抗體是W預(yù)防目的施用還是W治療目的施用、W前的治療、患者的臨床病史 和對(duì)融合構(gòu)建體的應(yīng)答，和主治醫(yī)師的判斷力。所述融合蛋白W-次治療或經(jīng)過(guò)一系列治 療合適地施用于患者。根據(jù)疾病的類(lèi)型和嚴(yán)重性，約化g/kg-15mg/kg(例如0.Img/kg-lOmg/ kg)的融合構(gòu)建體可W是用于向患者施用的最初候選劑量，例如，無(wú)論是通過(guò)一次或多次分 別施藥，還是通過(guò)連續(xù)輸注。一個(gè)典型的日劑量可W在約化g/kg-lOOmg/kg或更多的范圍 內(nèi)，其取決于上文提及的因素。為了重復(fù)施用數(shù)日或更久，根據(jù)病癥，通常將持續(xù)治療直至 出現(xiàn)理想的疾病癥狀抑制。所述抗體的一個(gè)示范性劑量應(yīng)該在約0.05mg/kg-約lOmg/kg范 圍內(nèi)。因此，約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.Omg/kg或lOmg/kg(或其任意組合)的一個(gè)或多個(gè)劑量 可W施用于患者。運(yùn)樣的劑量可W間隔地，例如每周或每Ξ周施用（例如，W使得患者接受 約2-約20或例如約6個(gè)劑量的所述抗體）?？蒞施用最初較高的負(fù)荷劑量，隨后是一個(gè)或多 個(gè)較低的劑量。但是，其它治療方案可W是有用的。該療法的進(jìn)展可W容易地通過(guò)常規(guī)技術(shù) 和測(cè)定來(lái)監(jiān)測(cè)。 實(shí)施例
[0096] 用于實(shí)施例的融合多膚
[0097] 在實(shí)施例中進(jìn)一步表征的Ξ功能性多膚（TriGant)包含針對(duì)Αβ的全長(zhǎng)抗體 (ΜΑΒ31)、針對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單一化b和中性溶酶。
[009引抗Αβ抗體:Mab31 =Gantene;rumab(I順）。針對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單一化13(3?；?3): 小鼠8D3抗-轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體(Boado，R.J.Zhang，Υ.Wang,Y和化r化idge，W.M.biotechnology andBioengineering(2009)102,1251-1258)0
[0099] 實(shí)施例的Ξ功能性多膚的重鏈和可變鏈的序列如下所述：
[0100] Mab31 重鏈凸起-s化b8D3:
[0101] MAB31-IgGl-KN0B-SS_G4S-4_Vk8D3-CK_G4S-6-GG_VH-8D3-CHl(Seq.Id.No.11)
[0102] 869.1(1.齡.11的組成：
[0103] 參沒(méi)有C-端Lys的Mab31人IgGl重鏈
[0104] ?甘氨酸絲氨酸-接頭
[0105] 參小鼠8D3抗-轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(VL)變體化596V和L5981) (Boado， R.J.Slang,Y.Wang,Y和化rdridge'W.Μ.'BiotechnologyandBioenginee;ring(2009)102， 1251-1258)
[0106] 參人C-K輕鏈
[0107] ?甘氨酸絲氨酸-接頭
[010引 ?小鼠8D3抗-轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體的可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH) (Boado，R.J.Zhang，Y.Wang，Y和化rdridge'W.Μ.'BiotechnologyandBioenginee;ring(2009) 102,1251-1258)
[0109] 參人IgGlC冊(cè)重鏈結(jié)構(gòu)域
[0110] Mab31 重鏈孔桐-中性溶酶:MAB31_8D3_肥-冊(cè)LEJCPRI(Seq.Id.No. 12)。
[0111] 869.1(1.齡.12的組成：
[0112] 參沒(méi)有C-端Lys的Mab31人IgGl重鏈
[0113] ?甘氨酸絲氨酸-接頭
[0114] 參Seq.Id.No.2(人中性溶酶)的氨基酸52-750
[0115] Mab31 輕鏈：TPIP:5170_MAB31-LC(Seq.Id.No.l3)
[0"y實(shí)施例1:在體外通過(guò)化ISA確定與A化-40纖維的結(jié)合
[0117]融合多膚與纖維狀Αβ的結(jié)合通過(guò)化ISA測(cè)定進(jìn)行測(cè)量。簡(jiǎn)言之，將Αβ(1-40)在37°C W在PBS中化g/mL包被到Maxiso巧平板上3天，W產(chǎn)生纖維狀的Αβ，然而在RT干燥3小時(shí)。將 該平板在RT用在PBS中的1%CroteinC和0.1 %RSA(封閉緩沖液)封閉1小時(shí)，然后用洗涂緩 沖液洗涂一次。將融合多膚或?qū)φ誛多至lOOnM的濃度添加到封閉緩沖液中，并且在4°C溫 育過(guò)夜。4次洗涂步驟之后，通過(guò)加入在封閉緩沖液中1:10,000稀釋的抗-人-IgG-HRP (JacksonImmunoresearch) (1RT)，然后6次洗涂并在TMB(Sigma)中溫育而檢測(cè)構(gòu)建體。在 用1N肥1終止顯色后，在450nm讀出吸光度(見(jiàn)圖1)。
[0"引實(shí)施例2:在體外確定與鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合
[0119] 融合多膚與鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合通過(guò)針對(duì)小鼠X63.AG8-563骨髓瘤細(xì)胞的FACS 分析檢測(cè)。由于Αβ抗體mAb31化ΕΚ)表現(xiàn)出與Ag8細(xì)胞非特異性結(jié)合的某種趨勢(shì)，所W通過(guò)與 20倍過(guò)量的抗-小鼠-TTR抗體共同溫育來(lái)定量特異性結(jié)合。通過(guò)離屯、收集細(xì)胞，用PBS洗涂 一次，并且將5x104個(gè)細(xì)胞在10化LRPMI/10%FCS中用1.5pM-10nM稀釋系列的多膚融合 物、加入或不加入200nM抗-小鼠TfR抗體、在冰上溫育1.5小時(shí)。用RPMI/10%FCS洗涂2次后， 將細(xì)胞用在RPMI/19%FCS中1:600稀釋的偶聯(lián)到藻紅蛋白（JacksonImmunoresearch)上的 山羊-抗-人IgG在冰上溫育1.5小時(shí)。將細(xì)胞再次洗涂，重懸在RPMI/10%FCS中，并且在 FACS-陣列儀器(Becton-Dickinson)上測(cè)量藻紅蛋白巧光(見(jiàn)圖2)。
[0120] 實(shí)施例3:在體外確定中性溶酶的酶活性(表觀Km)
[0121] 在25護(hù)在低體積黑色Costar384-孔平板上進(jìn)行20μ1的測(cè)定。在50mM化is-HCl抑7.8,25mMNa(n和5mMZnC12中制備 160μΜ膚底物MCA-RPPGFSAFK(E)噸）-〇H(R&DSystems Cat.No.ES005)的工作液。將10μl在測(cè)定緩沖液中稀釋至lnM的中性溶酶(R&DSystems， 化t.No1182-ZNC)或中性溶酶融合多膚轉(zhuǎn)移到平板中。為了確定表觀Km值，加入不同濃度的 底物（在2-倍稀釋度的稀釋液中，0.078-80nM)，并且開(kāi)始酶反應(yīng)。在化vision讀數(shù)儀上W 320nm激發(fā)和405nm發(fā)射監(jiān)測(cè)巧光增加。使用XLFit液軟件（IDBS)計(jì)算水解速率和表觀Km值 (見(jiàn)圖3和表1)。
[0122] 表1:
[0123]
[0124]實(shí)施例4:通過(guò)間接的免疫巧光將針對(duì)來(lái)自阿爾茨海默病患者腦切片的天然人0-淀粉樣蛋白斑的融合多膚染色
[0125] 利用間接免疫巧光通過(guò)免疫組織化學(xué)分析，檢測(cè)融合多膚對(duì)天然人β-淀粉樣蛋白 斑染色的能力。證實(shí)真正的人β-淀粉樣蛋白斑的特異性和靈敏的染色。將由來(lái)自診斷為阿 爾茨海默病陽(yáng)性的患者的尸檢獲得的顛葉皮層的未固定的組織的低溫恒溫切片用間接免 疫巧光標(biāo)記。利用兩步溫育來(lái)檢測(cè)結(jié)合的融合多膚，其通過(guò)綴合到Alexa555染料上的親和 純化的山羊抗-人(GA冊(cè)55)IgG化+L)(Mole州larProbes)掲示。對(duì)照包括不相關(guān)的人IgGl 抗體(Sigma)和單獨(dú)的二級(jí)抗體，它們均給出陰性結(jié)果。在lOng/ml-扣g/ml的檢測(cè)的融合多 膚濃度，均清楚且一致地顯現(xiàn)所有類(lèi)型的β-淀粉樣蛋白斑。真正的人淀粉樣蛋白-β斑的特 異性和靈敏性染色針對(duì)濃度為0.95yg/ml和1.化g/ml的融合多膚顯現(xiàn)(見(jiàn)圖4)。
[01%]實(shí)施例5:在小鼠阿爾茨海默病模型中通過(guò)融合多膚的體內(nèi)0-淀粉樣蛋白斑裝飾
[0127] 在APP/PS2雙重轉(zhuǎn)基因小鼠中檢測(cè)融合多膚在體內(nèi)免疫裝飾β-淀粉樣蛋白斑的能 力，所述轉(zhuǎn)基因小鼠是關(guān)于AD-相關(guān)的淀粉樣蛋白病變的小鼠模型（Richards(2003)， J.Neuroscience，23,8989-9003)。運(yùn)允許評(píng)估腦滲透和由淀粉樣蛋白-β斑結(jié)合的程度。與 裸露的抗-Αβ單克隆抗體相比較，W不同的劑量施用所述融合多膚，并且6天后將動(dòng)物用憐 酸緩沖鹽水灌注，將腦在干冰上冷凍，并且制備用于低溫切片。所述融合多膚在體內(nèi)表現(xiàn)出 基本上改善的和高度有效的腦滲透(與所述裸露的抗-Αβ單克隆抗體相比較而言）。
[0128] 使用未固定的低溫恒溫切片，通過(guò)使用濃度為15yg/ml的綴合到Alexa555染料 (GA冊(cè)55)上的山羊抗-人IgG(H+L)(MolecularProbes)在室溫1小時(shí)的單一標(biāo)記的間接免 疫巧光，評(píng)估與0-淀粉樣蛋白斑結(jié)合的抗體的存在。通過(guò)在室溫用濃度為0.扣g/ml的綴合 至IjAlexa488上的針對(duì)Αβ的小鼠單克隆抗體BAP-2溫育1小時(shí)進(jìn)行淀粉樣蛋白斑的復(fù)染。將 載玻片包埋在巧光封固介質(zhì)（S3023化ko)中，并且通過(guò)共聚焦激光顯微鏡進(jìn)行成像(圖5)。
[012