9] 發(fā)現(xiàn)等摩爾劑量(2和3.8mg/kg)的融合多膚在體內(nèi)實(shí)質(zhì)上更好地穿過(guò)血腦屏障， 并且強(qiáng)烈地免疫裝飾所有的β-淀粉樣蛋白斑。圖5中所示的代表性圖片表明，與W低得多的 程度穿過(guò)血腦屏障的裸露單克隆抗體相比，所述融合多膚具有改善的結(jié)合能力。
[0。0]實(shí)施例6:融合多膚的重組制備
[0131] DNA制備：
[0132] 收集500ml或5L過(guò)夜細(xì)菌LB培養(yǎng)物，并且按照供應(yīng)商的流程（高速大量試劑盒 巧ighspeedMaxi1^1:)，〇1日旨6]1，〔日1:.齡.12663)提取質(zhì)粒0魁。得到的質(zhì)粒0臟洗脫在11111TE緩沖液中，并且通過(guò)分光光度測(cè)量化poch，BioTek)確定DM濃度。
[0133] 表達(dá)質(zhì)粒：
[0134] 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中分別組裝包含用于表達(dá)重鏈和輕鏈的表達(dá)盒的表達(dá) 質(zhì)粒。
[0135] 關(guān)于由其可W推測(cè)密碼子使用的人輕鏈和重鏈的核巧酸序列的通用信息在 Kabat，E.A.，等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(免疫學(xué)感興趣 的蛋白質(zhì)序列），第5版，PublicHealthService,化tionalInstitutesofHealth, Bethesda，MD(1991)，NIHPublicationNo91-3242中給出。
[0136]a)不具有中性溶酶的抗體：
[0137]K-輕鏈的轉(zhuǎn)錄單位由下述元件組成：
[0138] -來(lái)自人巨細(xì)胞病毒化CMV)的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，其包含人輕鏈種系基因 的5'UTR，
[0139] -輕鏈可變區(qū)，其包含編碼人種系基因的基因組DM片段化1，信號(hào)-序列-內(nèi)含子， L2)的信號(hào)膚序列，
[0140] -人K-輕鏈恒定區(qū)，其包含小鼠K-輕鏈基因內(nèi)含子2，和
[0141] -SV40多聚腺巧酸化("聚A")信號(hào)序列。
[0142] 丫 ^重鏈的轉(zhuǎn)錄單位由下述元件構(gòu)成：
[0143] -來(lái)自人巨細(xì)胞病毒化CMV)的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，其包含人重鏈種系基因 的5'-UTR，
[0144] -丫 1-鏈可變區(qū)，其包含編碼人種系基因的基因組DM片段化1，信號(hào)-序列-內(nèi)含 子，L2)的信號(hào)膚序列，
[0145] -基因組人丫 1-重鏈基因恒定區(qū)，其包含小鼠重鏈內(nèi)含子2;
[0146] -SV40多聚腺巧酸化("聚A")信號(hào)序列。
[0147] 其他的質(zhì)粒包含：
[014引-新霉素抗性基因，
[0149] -來(lái)自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌化.coli)中復(fù)制，和
[0150] -β-內(nèi)酷胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨節(jié)青霉素抗性。
[0151]b)具有融合在重鏈C端的中性溶酶的抗體
[0152] 用于輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒包含：
[0153] -K-輕鏈的轉(zhuǎn)錄單位，其由下述元件構(gòu)成：
[0154] -來(lái)自人巨細(xì)胞病毒化CMV)的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，其包含人輕鏈種系基因 的5'UTR，
[0155] -輕鏈可變區(qū)，其包含編碼小鼠種系基因的基因組DM片段化1，信號(hào)-序列-內(nèi)含 子，L2)的信號(hào)膚序列，
[0156] -人K-輕鏈恒定區(qū)，其包含小鼠K-輕鏈基因內(nèi)含子2，和
[0157]-B細(xì)多聚腺巧酸化("聚A")信號(hào)序列；
[015引-新霉素抗性基因，
[0159]-來(lái)自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，和
[0160] -β-內(nèi)酷胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨節(jié)青霉素抗性。
[0161] 用于重鏈的表達(dá)質(zhì)粒包含：
[0162] -丫^重鏈的轉(zhuǎn)錄單位，其由下述元件構(gòu)成：
[0163] -來(lái)自人巨細(xì)胞病毒化CMV)的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，其包含人重鏈種系基因 的5'-UTR，
[0164] -丫 1-鏈可變區(qū)，其包含編碼人種系基因的基因組DM片段化1，信號(hào)-序列-內(nèi)含 子，L2)的信號(hào)膚序列，
[0165] -基因組人丫 1-重鏈基因恒定區(qū)，其包含小鼠重鏈內(nèi)含子2;
[0166] -中性溶酶編碼核酸，
[0167] -BGH多聚腺巧酸化("聚A")信號(hào)序列；
[016引-來(lái)自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，和
[0169] -β-內(nèi)酷胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨節(jié)青霉素抗性。
[0170] 轉(zhuǎn)染：
[0171] 在轉(zhuǎn)染前一天，將皿Κ293細(xì)胞稀釋至8χ105個(gè)細(xì)胞/ml。按照供應(yīng)商的流程，轉(zhuǎn)染 約1至1.6x106個(gè)細(xì)胞/ml。對(duì)于1000ml的最終轉(zhuǎn)染體積，將lOOOygDNA用Opti-MEM⑩I 簡(jiǎn)化血清培養(yǎng)基(G化CO,化t.No.31985070)稀釋至50ml的終體積。將2微升293fectin?試劑 (Invi化ogen，Cat.No.l2：M7019)ΛμgDNA同樣用Opti-MEMi)培養(yǎng)基稀釋至lml的終體 積，并且溫育5分鐘。溫育后，將稀釋的DNA添加到稀釋的293fectinTM試劑中，輕輕混合，再 溫育20-30分鐘，然后逐滴吸到950ml皿K293細(xì)胞混懸液中，W獲得1000ml的終體積。將細(xì) 胞在細(xì)胞培養(yǎng)條件(37°C，8 %C02，80 %濕度)下在W12虹pm旋轉(zhuǎn)的定軌搖床上溫育，并且在 72小時(shí)后收集。將收集物W1000巧m離屯、10分鐘，然后W3000巧m離屯、10分鐘，并且通過(guò)22皿 無(wú)菌濾器(Mi11ipore，Cat.No.SCGPU05RE)過(guò)濾。
[0172] 純化；
[0173] 通過(guò)離屯、將細(xì)胞從培養(yǎng)基中去除。通過(guò)蛋白質(zhì)A親和層析(MabSelect-瓊脂糖于 ΛΚΤΑ-AvarU-上)從上清中純化復(fù)合物。將洗脫的復(fù)合物用Amicon離屯、管濃縮至3mg/ml的 蛋白濃度。W大小排阻層析化PLCTSK膠GFC300Sys89)分析等分試樣。在Superdex200上進(jìn) 行制備級(jí)SEC，W去除聚集物，并且將融合蛋白緩沖在20mM組氨酸，140mM化Cl，pH6.0中。 將洗脫的復(fù)合物用Amicon離屯、管濃縮至Img/ml的蛋白濃度，并且無(wú)菌過(guò)濾(0.2皿的孔尺 寸)。
[0174] 分析學(xué)：
[0175] 復(fù)合物樣品用UV分光光度計(jì)通過(guò)0D280進(jìn)行分析，W確定溶液中的蛋白濃度。對(duì)此 需要的消光系數(shù)按照化ce(Pace等人，ProteinScience4(1995)2411-2423)由氨基酸序列 計(jì)算。在TSK-Gel300SW)(L或S叩erdex200柱上進(jìn)行大小排阻層析（SE-冊(cè)LC)，使用包含 0.25MKC1的0.2M憐酸鐘緩沖液，pH7.0作為移動(dòng)相，W確定樣品中單體的、聚集的和降解 的種類的含量。進(jìn)行十二烷基硫酸鋼(SDS)聚丙締酷胺凝膠電泳(還原的和非還原的），W關(guān) 于產(chǎn)物相關(guān)的降解產(chǎn)物和不相關(guān)的雜質(zhì)來(lái)分析復(fù)合物制劑的純度。使用還原的(TCEP)和去 糖基化的（N-糖巧酶F)樣品進(jìn)行電噴霧電離質(zhì)譜化SI-MS)，W證實(shí)每條鏈的正確質(zhì)量/身 份，并且檢測(cè)化學(xué)修飾。進(jìn)行去糖基化的樣品的ESI-MS，來(lái)分析完全組裝的蛋白的本性和特 性，并且檢測(cè)潛在的產(chǎn)物-相關(guān)的副產(chǎn)物(表2)。
[0176] 結(jié)果:表2
[0177]
[0178] 可W看出，與Mab31抗體的產(chǎn)率相比，中性溶酶結(jié)構(gòu)部分與Mab31的抗體重鏈之一 的融合增加融合多膚的表達(dá)產(chǎn)率。
[0179] 本發(fā)明的多膚序列
[0180]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 融合蛋白，其包含針對(duì)Αβ的抗體、與血腦屏障受體結(jié)合的單價(jià)結(jié)合實(shí)體、和中性溶酶 結(jié)構(gòu)部分。2. 權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述血腦受體選自由以下組成的組:轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，胰 島素受體，胰島素樣生長(zhǎng)因子受體，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8,低密度脂蛋白受體相關(guān) 蛋白1和肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子。3. 權(quán)利要求1或2的融合蛋白，其中所述單價(jià)結(jié)合實(shí)體是血腦屏障配體或單價(jià)抗體片 段，其優(yōu)選地選自scFv，F(xiàn)v，scFab，F(xiàn)ab，VHH。4. 權(quán)利要求1-3的融合蛋白，其包含： 針對(duì)A邱纟抗體，所述抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈， 與血腦受體結(jié)合的單價(jià)結(jié)合實(shí)體，所述單價(jià)結(jié)合實(shí)體通過(guò)第一接頭偶聯(lián)到所述針對(duì)Αβ的抗體的第一條重鏈的C端部分， 中性溶酶結(jié)構(gòu)部分，所述中性溶酶結(jié)構(gòu)部分通過(guò)第二接頭偶聯(lián)到所述針對(duì)Αβ的抗體的 第二條重鏈的C-末端部分。5. 權(quán)利要求4的融合蛋白，其中所述與血腦受體結(jié)合的單價(jià)結(jié)合實(shí)體通過(guò)第一接頭偶 聯(lián)到針對(duì)Α邱勺全長(zhǎng)抗體的第一條重鏈的Fc部分的C-末端，并且 所述中性溶酶結(jié)構(gòu)部分通過(guò)第二接頭偶聯(lián)到針對(duì)Αβ的全長(zhǎng)抗體的第二條重鏈的Fc部 分的C-末端。6. 權(quán)利要求1-5的融合蛋白，其中所述第一接頭和第二接頭是肽或化學(xué)接頭，優(yōu)選是肽 接頭。7. 權(quán)利要求1-6的融合蛋白，其中所述與血腦屏障受體結(jié)合的單價(jià)結(jié)合實(shí)體是針對(duì)轉(zhuǎn) 鐵蛋白受體的scFab。8. 權(quán)利要求1-7的融合蛋白，其中所述針對(duì)Αβ的抗體包含：（a)H-CDRl，其包含 569.1(1.如.5的氨基酸序列，（13)!1-〇)1?2，其包含369.1(^〇.6的氨基酸序列，（(3)!1-〇)1?3，其 包含Seq.Id.No. 7的氨基酸序列，（d)L-CDRl，其包含Seq.Id.No. 8的氨基酸序列，（e)L_ CDR2,其包含Seq.Id.No.9的氨基酸序列，和（f)L_CDR3,其包含Seq.Id.No.10的氨基酸序 列。9. 權(quán)利要求1 _8的融合蛋白，其中所述針對(duì)Αβ的抗體包含:含有Seq.Id.No. 3的氨基酸 序列的Vh結(jié)構(gòu)域和含有Seq.Id.No. 4的氨基酸序列的Vl結(jié)構(gòu)域。10. 權(quán)利要求4-9的融合蛋白，其中所述針對(duì)Αβ的抗體的重鏈之一包含第一個(gè)二聚化模 塊并且所述針對(duì)Α邱勺抗體的第二條重鏈包含第二個(gè)二聚化模塊，這允許這兩條重鏈的異源 二聚體化。11. 權(quán)利要求10的融合蛋白，其中，依據(jù)凸起進(jìn)入孔洞的策略，所述第一個(gè)二聚化模塊 包含凸起，并且所述第二個(gè)二聚化模塊包含孔洞。12. 權(quán)利要求1-11的融合蛋白，其包含一個(gè)與血腦屏障受體結(jié)合的單價(jià)結(jié)合實(shí)體，優(yōu)選 一個(gè)針對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的scFab。13. 編碼權(quán)利要求1 -12的融合蛋白的分離的核酸。14. 包含權(quán)利要求13的核酸的宿主細(xì)胞。15. 藥物制劑，所述藥物制劑包含權(quán)利要求1-12的融合蛋白和藥物載體。16. 權(quán)利要求1-12的融合蛋白，其用作藥物。17.權(quán)利要求1-12的融合蛋白在制備藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種融合蛋白，其包含針對(duì)Aβ的抗體、結(jié)合血腦屏障受體的單價(jià)結(jié)合實(shí)體和中性溶酶。
【IPC分類】C07K9/00, C07K14/47, C07K16/28, A61P25/28, C07K16/46, C07K16/18
【公開(kāi)號(hào)】CN105431203
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480043474
【發(fā)明人】貝恩德·博爾曼, 佩爾-奧拉·弗雷斯克加德, 亨德里克·克內(nèi)特根, 延斯·尼韋納
【申請(qǐng)人】豪夫邁·羅氏有限公司
【公開(kāi)日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2014年7月30日
【公告號(hào)】CA2919325A1, EP3027280A1, US20160168253, WO2015014884A1