ces)于450nm下讀取培養(yǎng)盤。所有數(shù)據(jù)皆以平均值 土標準偏差(SD)表示。以未配對單尾Student's t檢定評估平均值之間任何差異的顯著性。 P值〈0.05視為具有統(tǒng)計顯著性。
[0155] 分析巖藻糖專一性凝集素
[0156] 使用胺基反應(yīng)性玻片容許藉由形成酰胺鍵而共價結(jié)合含有末端胺的聚醣，并容許 能依據(jù)微數(shù)組制造機制推測FMS ( Img )及F3 (Img )印刷于N-羥基琥?自酰亞胺（N-hydr〇XySuCCinimide;NHS)活化玻片上。在凝集素反應(yīng)性聚醣檢測方面，各生物素化凝集素 以含1%BSA的TBS緩沖液稀釋（1~10μg/ml)并加至玻片上各子數(shù)組。在以TBS緩沖液清洗 后，玻片以PE共輒連接的抗生物素蛋白鏈菌素（1:500)探測，并以GenepiMOOOB微數(shù)組掃描 儀(Molecular Devices)掃描。以GenepiX軟件(Molecular Devices)抽取影像并分析。各測 試樣本的凝集素結(jié)合強度以五重復(fù)的平均相對熒光強度(RFUs)表示。
[0157] 細胞培養(yǎng)及FACS分析
[0158] 在檢測細胞表面Globo H抗原表現(xiàn)方面，小鼠路易氏肺癌(LLCl)細胞及組織培養(yǎng) 物I (Tissue culture I; TC-I)細胞系購自BCRC(生物資源保存及研究中心（Bioresource Collection and Research Center)，臺灣）。以一級mAb MBrl進行約2xl05個細胞的染色、 再以PBS清洗、且隨后以DyLight 649共輒之山羊抗小鼠 IgM二級抗體培養(yǎng)。在鑒定小鼠腹腔 細胞變化方面，以冰冷PBS灌洗法收取腹腔滲出液細胞，接著細胞同時以FITC共輒連接之抗 IgD、PerCP共輒連接之抗IgM、及APC共輒連接之抗⑶lib mAbs進行染色。利用FACSAria Cell Sorter(BD Biosciences)，藉由閘控IgMhiIgDintCDllbhi細胞以取得B-I B細胞，且藉 由閘控IgDhlIgMintCDllblci以分類B-2 B細胞。將新鮮分離的B細胞(2xl06個細胞/ml)培養(yǎng)于 含有10%熱失活性FBS(Hycl 〇ne)、青霉素/鏈霉素（lOOunits/ml)及2-巰乙醇(50μΜ)的RPMI 1640培養(yǎng)基（Invitrogen)，并于指定時間分別處理FMS或DFMS(100μg/ml)。所有的流式細胞 分析皆以FACSCanto(BD Biosciences)進行，并以Flow Jo軟件進行結(jié)果分析。
[0159 ]小鼠細胞介素/趨化介素檢測
[0160] 在最后一次FMS免疫注射后第7天，自腫瘤經(jīng)受小鼠采血，并依據(jù)制造商提供的方 法，以Beadlyte mouse 21-plex細胞介素/趨化介素檢測套組(Upstate/MiIlipore)測定經(jīng) 稀釋的小鼠血清樣本，再以Luminex 100系統(tǒng)(Luminex)判讀。
[0161] CDC 試驗
[0162] 選取Globo H陽性與陰性腫瘤細胞株、LLCl及TC-I進行補體依賴性細胞毒性(CDC) 試驗。在定量CDC活性方面，發(fā)明人使用CytoTox9_6? :Non_Radioactive Cytotoxicity Assay kit (Promega)，依據(jù)制造商之指示，其為一種測定培養(yǎng)基中LDH釋放的非放射性方 法。直接以血清樣本作為多株抗體及補體來源。藉由將血清培養(yǎng)于56°C中30min，制備經(jīng)FMS 處理小鼠的熱失活血清(HI抗血清），以測定補體缺乏效應(yīng)。簡單而言，將細胞(5xl04)懸浮 于無血清培養(yǎng)基，并以稀釋的測試血清處理，使得最終小鼠血清濃度達到1、5、10、及20%。 在37°C下培養(yǎng)90min之后，以乳糖脫氫酶(LDH)受質(zhì)混合上清液(I: I，vol/vol)，接著收集吸 光值數(shù)據(jù)。依據(jù)LDH之釋放量，計算細胞溶解百分比(細胞毒性百分比），其系使用下列公式： 100 X [ (A-C)/(B-C)]，其中A代表稀釋測試血清的吸光值(實驗中LDH釋放量）、B代表以溶解 液溶解所有目標細胞的吸光值(最大LDH釋放量）、及C代表培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基之目標細胞 的吸光值并作為基線值（自發(fā)性LDH釋放量）。
[0163] 結(jié)合競爭試驗
[0164] 欲測定醣類競爭劑對于抗血清與Globo H間之交互作用的影響，測定血清學(xué)反應(yīng) (以1:100稀釋比例進行血清測試），其系于醣類競爭劑(0.05mg/ml)存在下使用Globo H印 刷玻片。除了完整多醣(FMS-I及藻褐素-I)以外，以前述酸水解法制備其分解的寡醣混合物 (FMS-H及藻褐素-H)，并重復(fù)測定各組的相對結(jié)合親和力且將各組標準化為結(jié)合百分比。
[0165] 表4:參考文獻



[0170]本說明書引用的所有公開文獻、專利、及專利申請案在此并入本案以作為參考資 料，如同個別的公開文獻或?qū)＠暾埌?，其系特定地且單獨地?jīng)指定以并入本案作為參考 數(shù)據(jù)。本文之公開文獻、專利、或公開專利申請案之引用并非承認該公開文獻、專利、或公開 專利申請案為先前技藝。
[0171]雖然前述之
【發(fā)明內(nèi)容】
已由圖式及實例方式詳盡說明，其系旨在提供清楚之理解， 熟習(xí)本領(lǐng)域之技術(shù)人員應(yīng)能顯見的是，鑒于本發(fā)明之內(nèi)容，可進行其之特定變化及改良而 不背離后附本發(fā)明申請專利范圍之精神或范疇。
【主權(quán)項】
1. 一種免疫原性組合物，其包含： 富含巖藻糖之靈芝區(qū)分多醣區(qū)分(FMS)，其平均分子量為35kDa，其中FMS自靈芝F3分 離，且其中FMS包含多醣，其主要具有選自于1，4_甘露聚糖及1，6-α_半乳聚糖的主鏈，其中 該主鏈連接至末端含巖藻糖的側(cè)鏈;以及 可視需要的佐劑。2. 如權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中該主鏈經(jīng)由一或多個選自于Fucal-2Gal、Fuca 1 -3/4Man、Fuca 1 -4Xy 1及Fuca 1 -2Fuc的鍵聯(lián)而連接至末端含巖藻糖的側(cè)鏈。3. 如權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中FMS主要包含巖藻糖、木糖、半乳糖及甘露糖， 其比例為 2:1.5:2.5:3.5。4. 如權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中FMS包含小量的葡萄糖、葡萄糖胺及半乳糖胺。5. 如權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中該佐劑為醣脂質(zhì)。6. 如權(quán)利要求5的免疫原性組合物，其中該佐劑為a-GalCer的合成類似物，其選自于： 7DW8-5及C34: 9Η ,-'-ΟΗ g f.戶Υ』 HO ? ! OH 八 八八、， un 7DW8-5 r 〇 H0 ? i k，、 、，丫 ^ OH C34s7. 如權(quán)利要求5的免疫原性組合物，其中投予該組合物至哺乳類動物可誘發(fā)IgG抗體。8. 如權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中投予該組合物至哺乳類動物可誘發(fā)IgM抗體。9. 如權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中該免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一性地結(jié)合至腫瘤 相關(guān)抗原之至少一者，該抗原選自于由Globo !1、663、664、階段專一"性胚胎抗原_3(SSEA_3; Gb-5;Gaim-3GalNAcm-3Galca-4Gaim-4Glc0)及 SSEA-4(Neu5Aca2-3Gaim_3GalNAcm-3Galal-4Gaim_4Glc0)組成之群組。10. 如權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中該免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一性地結(jié)合至聚醣 抗原，該抗原包含常見結(jié)構(gòu):Fucal-2Gal01_3GalNAc-R位于非還原末端。11. 如權(quán)利要求10的免疫原性組合物，其中該免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一性地結(jié)合至抗 原，該抗原更包含額外的雙醣延伸，其位于Fucal-2GalPl-3GalNAc_R的還原端，其中該雙醣 部分選自于：Fuca 1 -2Ga 1-R、Fuca 1 -3/4Man_R、Fuca 1 -4Xy 1-R 及 Fuca 1 -2Fuc-R。12. 如權(quán)利要求11的免疫原性組合物，其中該免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一性地結(jié)合至a-L-巖藻糖專一性凝集素、UEA-I (刺金雀花凝集素-I)。13. 如權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中該免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一性地結(jié)合至聚醣 抗原，該抗原包含s血型ABH決定位。14. 如權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中該免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體可于癌癥細胞觸發(fā)補 體依賴性細胞毒性(CDC)。15. 如權(quán)利要求14的免疫原性組合物，其中CDC活性足以減少肺癌細胞的腫瘤大小。16. 如權(quán)利要求14的免疫原性組合物，其中投予該組合物造成單核球趨化蛋白-UMCP-1)的血清濃度下降。17. 如權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中FMS是藉由粒徑排阻層析法由靈芝F3分離。18. -種癌癥疫苗，其包含如權(quán)利要求1的免疫原性組合物；以及 醫(yī)藥上可接受賦形劑， 其中相較于誘發(fā)癌癥后的治療，以該組合物預(yù)處理會大幅減少非小細胞肺癌(NSCLC) 的腫瘤體積。19. 如權(quán)利要求17的癌癥疫苗，其中于以該組合物預(yù)處理的哺乳類動物中，單核球趨化 蛋白-l(MCP-l)、趨化介素(C-X-C模體)配體1(CXCL1/KC)及顆粒球群落刺激因子(G-CSF)的 濃度減少。20. 如權(quán)利要求18的癌癥疫苗，其中所述佐劑是醣脂質(zhì)。21. 如權(quán)利要求18的癌癥疫苗，其中所述佐劑是α-GalCer的合成類似物，其選自于： 7DW8-5及C34， 9Η ,-?Η g HO 丨 ξ· OH i 、 7DW8-5 9H ,, oh q -人八~'八，丫、f，Y.F Hd A f 〇H 、人人.J 人......丫、〇 C34〇22. 如權(quán)利要求20的癌癥疫苗，其中所述組合物投予至哺乳類動物誘發(fā)IgG抗體。23. 如權(quán)利要求18的癌癥疫苗，其中所述組合物投予至哺乳類動物誘發(fā)IgM抗體。24. -種對抗癌細胞的治療藥劑，該治療藥劑包含： 富含巖藻糖之靈芝多醣區(qū)分(FMS)，其平均分子量為35kDa，其中FMS系藉由粒徑排阻層 析法自靈芝F3分離，且其中FMS包含多醣，其主要具有選自于1，4_甘露聚糖及1，6-α-半乳聚 糖的主鏈，其中該主鏈連接至末端含巖藻糖的側(cè)鏈;以及 可視需要的佐劑。25. 如權(quán)利要求24的治療藥劑，其中投予該治療藥劑至個體誘發(fā)抗體產(chǎn)生，該抗體識別 表現(xiàn)于癌癥細胞的Globo Η或GloboH相關(guān)的抗原。26. 如權(quán)利要求24的治療藥劑，其中Globo Η或GloboH相關(guān)的抗原選自于由Globo H、 Gb3、Gb4、階段專一性胚胎抗原-3(SSEA-3;Gb-5;Gaim-3GalNAcm-3Galal-4Gaim-4Glc0) 及 SSEA-4(Neu5Aca2-3Gaim-3GalNAcm-3Galal-4Gaim-4Glc0)組成之群組。27. 如權(quán)利要求24的治療藥劑，其中該癌癥細胞為非小細胞肺癌(NSCLC)細胞。28. 如權(quán)利要求24的治療藥劑，其中該主鏈經(jīng)由一或多個選自于Fucal-2Gal、Fucal-3/ 41&111、？11〇€[1-4乂71及?11〇€[1-2?11〇的鍵聯(lián)而連接至末端含巖藻糖的側(cè)鏈。29. 如權(quán)利要求24的治療藥劑，其中FMS主要包含巖藻糖、木糖、半乳糖及甘露糖，其比 例為2:1.5:2.5:3.5。30. 如權(quán)利要求24的治療藥劑，其中FMS包含小量的葡萄糖、葡萄糖胺及半乳糖胺。31. -種治療腫瘤的方法，所述方法包括： (a) 投予免疫原性組合物至有需求的個體，該組合物包含富含巖藻糖之靈芝多醣區(qū)分 (FMS)，其平均分子量為35kDa，其中FMS藉由粒徑排阻層析法自靈芝F3分離，且其中FMS包含 多醣，其主要具有選自于1，4_甘露聚糖及1，6-α_半乳聚糖的主鏈，其中主鏈連接至末端含 巖藻糖的側(cè)鏈;以及可視需要的佐劑；以及 (b) 誘發(fā)致使抑制腫瘤生長的免疫反應(yīng)。32. 如權(quán)利要求31的的方法，其中該主鏈經(jīng)由一或多個選自于Fuca l-2Gal、Fucal-3/ 41&111、？11〇€[1-4乂71及?11〇€[1-2?11〇的鍵聯(lián)而連接至末端含巖藻糖的側(cè)鏈。33. 如權(quán)利要求31的方法，其中FMS主要包含巖藻糖、木糖、半乳糖及甘露糖，其比例為 2:1.5:2.5:3.5〇34. 如權(quán)利要求31的方法，其中所述佐劑是醣脂質(zhì)。35. 如權(quán)利要求33的方法，其中所述佐劑是a-GalCer的合成類似物，其選自于：7DW8-5 及 C34， 9H ,OH 〇 f:，'::、、.··' HO ! f OH Αμ 7DW8-5 9Hr-〇H 〇 Hf''、、八'、、'\'、丫、1 r'Y'F HO ： ! OH U、 >、'i 〇'，丫 OH (34。36. 如權(quán)利要求34的方法，其中所述組合物投予至哺乳類動物誘發(fā)IgG抗體。37. 如權(quán)利要求31的方法，其中所述組合物投予至哺乳類動物誘發(fā)IgM抗體。38. 如權(quán)利要求31的方法，其中該免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一性地結(jié)合至腫瘤相關(guān)抗原 之至少一者，該抗原選自于由Globo H、Gb3、Gb4、階段專一性胚胎抗原-3(SSEA-3;Gb-5;Gal m-3GalNAcm-3Galca-4Gaim_4Glc0)及 SSEA-4(Neu5Aca2-3Gaim-3GalNAcm_3Galca-4Gaim-4Glc0)組成之群組。39. 如權(quán)利要求31的方法，其中該免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一性地結(jié)合至聚醣抗原，該抗 原包含常見結(jié)構(gòu):Fucal-2Gaim-3GalNAc_R位于非還原末端。40. 如權(quán)利要求31的方法，其中該免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體專一性地結(jié)合至抗原，該抗原更 包含額外的雙醣延伸，其位于Fucal-2Gaim_3GalNAc-R的還原端，其中該雙醣部分選自于： Fuca1-2Ga1-R、Fuca1-3/4Man_R、Fuca1-4Xy1-R及Fuca1-2Fuc_R。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于治療癌癥的免疫原性組合物、癌癥疫苗、及方法，其包含靈芝F3(Reishi？F3)的富含巖藻糖之多醣區(qū)分FMS。組合物包含分子量為～35kDa的富含巖藻糖之靈芝多醣區(qū)分(FMS)，其中FMS以粒徑排阻層析法自靈芝F3分離，且FMS包含多醣，其主要具有選自于1,4-甘露聚糖及1,6-α-半乳聚糖的主鏈，其中主鏈連接至末端含巖藻糖的側(cè)鏈。本發(fā)明提供一種含有醣脂質(zhì)佐劑的免疫原性組合物。本發(fā)明的免疫原性組合物產(chǎn)生的抗體結(jié)合至癌癥細胞，該細胞表面含有抗原Globo？H、Globo？H、Gb3、Gb4、Gb5(SSEA-3)、及SSEA-4。
【IPC分類】A61K36/074, A61K31/736, A61K31/715
【公開號】CN105473149
【申請?zhí)枴緾N201480042265
【發(fā)明人】翁啟惠, 吳宗益, 許先業(yè), 廖詩芬, 梁其輝
【申請人】中央研究院
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2014年7月26日
【公告號】US20160166661, WO2015026484A1, WO2015026484A9