[0074]本文使用的"流式細(xì)胞分析"或"FACS"等詞是指檢查懸浮于流體流之顆?；蚣?xì)胞 之物理及化學(xué)性質(zhì)的技術(shù)，其可經(jīng)由光學(xué)及電子學(xué)檢測裝置進(jìn)行。
[0075]勝肽的胺基酸殘基縮寫如下：苯丙胺酸為Phe或F;白胺酸為Leu或L;異白胺酸為 IIe或I;甲硫胺酸為Met或M;纈胺酸為Val或V;絲胺酸為Ser或S;脯胺酸為Pro或P;蘇胺酸為 Thr或T;丙胺酸為Ala或A;酪胺酸為Tyr或Y;組胺酸為His或H;麩酰胺酸為Gln或Q;天冬酰胺 酸為Asn或N;離胺酸為Lys或K;天門冬胺酸為Asp或D;麩胺酸為Glu或E;半胱胺酸為Cys或C; 色胺酸為Trp或W;精胺酸為Arg或R;以及甘胺酸為Gly或G。胺基酸之進(jìn)一步描述請參見 Proteins:Structure and Molecular Properties by Creighton,T.E.,ff.H.Freeman& Co.，New York 1983。
[0076] 本發(fā)明之組合物可包括于醫(yī)藥或營養(yǎng)組合物，并伴隨額外的活性試劑、載體、載 具、賦形劑、或助劑，其可由熟習(xí)本領(lǐng)域之技術(shù)人員閱讀本發(fā)明而理解。
[0077] 本發(fā)明之組合物可包括于醫(yī)藥或免疫原性組合物，并伴隨額外的活性試劑、載體、 載具、賦形劑或助劑，其可由熟習(xí)本領(lǐng)域之技術(shù)人員閱讀本發(fā)明而理解。
[0078] 醫(yī)藥或免疫原性組合物較佳為包含至少一醫(yī)藥上可接受載體。在此醫(yī)藥組合物 中，本發(fā)明之組合物形成"活性化合物"，亦可稱作"活性試劑"。本文使用的"醫(yī)藥上可接受 載體"一詞包括兼容于醫(yī)藥投予的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑與抗真菌劑、等張劑與吸收 延遲劑、及其類似物。補(bǔ)充型活性化合物亦可并入本組合物。醫(yī)藥組合物系配制成兼容于其 預(yù)期之投予途徑。投予途徑之實(shí)例包括非口服，如靜脈、皮內(nèi)、皮下、口服(如吸入）、經(jīng)皮(局 部）、經(jīng)黏膜、及直腸投予。用于非口服、皮內(nèi)、或靜脈施加的溶液或懸浮液可包括下列成分： 無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其他合成溶液;抗 菌劑如苯甲醇或?qū)αu苯甲酸甲酯;抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螫合劑如乙二胺四 醋酸;緩沖液如乙酸鹽、檸檬酸鹽、或磷酸鹽；以及張力調(diào)節(jié)劑如氯化鈉或葡萄糖。可以酸或 堿調(diào)整PH，如鹽酸或氫氧化鈉。可將非口服制劑封裝于玻璃或塑料制成的安瓿、拋棄式注射 器或多劑量小瓶。
[0079] 本文提及的個(gè)體是指人類或非人類靈長類(如大猩猩、彌猴、狨猿）、家畜動物(如 羊、牛、馬、驢、及豬）、伴侶動物（如狗、貓）、實(shí)驗(yàn)室測試動物（如小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、倉 鼠）、圈養(yǎng)野生動物(如狐、鹿）、及可由本發(fā)明試劑獲益的任何其他生物體?？捎杀景l(fā)明所述 之試劑獲益的動物類型無局限。個(gè)體不論是人類或非人類，皆可稱作病患、個(gè)人、動物、宿主 或接受者。
[0080] 適合注射用途的醫(yī)藥組合物包括無菌水溶液(其為水溶性)或分散液及用于臨時(shí) 制備成無菌注射液或分散液的無菌粉末。在靜脈投予方面，適用載體包括生理鹽液、抑菌 水、Cremophor EL?(BASF，Parsippany，N. J.)或磷酸鹽緩沖鹽液（phosphate buffered saline;PBS)。在所有情況中，組合物應(yīng)除菌且應(yīng)維持流動至易于注射的程度。其應(yīng)于制造 及保存條件下維持穩(wěn)定，并可防止微生物如細(xì)菌及真菌的滋生。載體可為含有如水、乙醇、 多元醇（如甘油、丙二醇、及液態(tài)聚乙二醇、及其類似物）、及其適當(dāng)混合物的溶劑或分散劑 介質(zhì)?？山逵墒褂冒氯缏蚜字?、于分散時(shí)維持所需顆粒大小及使用界面活性劑維持適當(dāng) 的流動性?？山逵筛鞣N抗菌劑及抗真菌劑如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及 其類似物達(dá)到預(yù)防微生物作用的效果。在許多情況中，組合物較佳為包括等張劑，如糖類、 多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化鈉?？山逵蓪⒀娱L吸收試劑(如單硬脂酸鋁及明膠)包括 于組合物以延長注射組合物的吸收。
[0081] "有效"量或"治療上有效"量的活性試劑是指提供有利功效的無毒且足量試劑。活 性試劑的"有效"量將依個(gè)體而變，其取決于個(gè)體的年齡及一般條件、特定活性劑或試劑及 其類似物。除非另有指明，本文使用的"治療上有效"量一詞旨在包括除了治療不良病況的 有效量以外，尚包括預(yù)防不良病況及/或改善不良病況的有效量。
[0082] 如本文所定義，活性化合物的治療上有效量（即有效劑量)范圍為約0.001至100g/ kg體重，或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員無需實(shí)驗(yàn)即可顯見及理解的范圍。本領(lǐng)域之技術(shù)人員應(yīng)理 解到，特定因素可影響有效治療個(gè)體所需的劑量及時(shí)間，這些因素包括但不局限于，病癥或 疾病嚴(yán)重程度、先前的治療、個(gè)體身體健康或年齡、及患有其他病癥。
[0083] 本文使用的不良狀況可能是常見于個(gè)體的"正常"狀況或可能與一確定病癥相關(guān) 或可能無關(guān)的病理狀況。
[0084] 本文使用的"脂質(zhì)" 一詞是指參與細(xì)胞傳訊途徑的任何脂溶性(親脂性)分子。
[0085] 本文使用的"醣脂質(zhì)"一詞是指連接醣類的脂質(zhì)，其可作為細(xì)胞識別的標(biāo)記物。
[0086] 依據(jù)另一態(tài)樣，熟習(xí)本領(lǐng)域之技術(shù)人員可設(shè)想到一或多個(gè)部件套組，該部件套組 可進(jìn)行本發(fā)明方法之至少一者，該部件套組包含二或多個(gè)組合物，該組合物系單獨(dú)使用或 結(jié)合前述方法之至少一者之一有效量本發(fā)明組合物。
[0087] 套組亦可包括組合物，其包含活性試劑、生物事件標(biāo)識物、或其他由熟習(xí)本領(lǐng)域之 技術(shù)人員閱讀本發(fā)明而理解的化合物。套組亦可包含至少一組合物，其包含一有效量之本 發(fā)明組合物或細(xì)胞株。依據(jù)熟習(xí)本領(lǐng)域之技術(shù)人員理解之流程，以部件套組之組合物及細(xì) 胞株進(jìn)行本發(fā)明之至少一方法。
[0088] 本文使用的"多勝肽"一詞是指胺基酸殘基的任何集合體或聚合體。多勝肽可由二 或多個(gè)多勝肽鏈組成。多勝肽包括蛋白質(zhì)、勝肽、及寡勝肽。多勝肽可為直鏈型或分枝型。多 勝肽可包含修飾的胺基酸殘基、胺基酸類似物、或非天然存在的胺基酸殘基，并可以非胺基 酸殘基將其中斷。定義中涵蓋經(jīng)修飾的胺基酸聚合體，不論是以天然或干預(yù)方式產(chǎn)生，如形 成雙硫鍵、醣化、脂質(zhì)化、甲基化、乙?；?、磷酸化、或藉由操縱方式，如以標(biāo)定成分連接。
[0089] 本文使用的"專一性結(jié)合"一詞是指結(jié)合配對體(如抗體與抗原）間之交互作用。在 各情況中，專一性結(jié)合可藉由親和力常數(shù)約HT 6莫耳/公升、約HT7莫耳/公升、或約HT8莫 耳/公升、或以下而實(shí)施。
[0090] 如熟習(xí)本領(lǐng)域之技術(shù)人員因閱讀本發(fā)明而顯見，本文所述及圖式的個(gè)別具體實(shí)施 例之每一者具有分立的組件及特征，其可易于與其他數(shù)個(gè)具體實(shí)施例之任一者之特征分開 或結(jié)合而不背離本發(fā)明之范疇或精神。可由列舉事件之順序或邏輯上可能的任何其他順序 的方式執(zhí)行任何列舉之方法。
[0091] 除非另有定義，本文所使用的技術(shù)性及科學(xué)性術(shù)語具有本發(fā)明領(lǐng)域之技術(shù)人員所 能常規(guī)理解的相同意義。若有沖突，將以本文件(包括定義)為準(zhǔn)。
[0092] 自靈芝分離富含巖藻糖之多醣區(qū)分(FMS)
[0093]最近的研究結(jié)果顯示，專一性B細(xì)胞亞群能建立記憶以提供專一性免疫球蛋白 (immunoglobulin; Ig)合成，以針對TI相關(guān)聯(lián)的多醣反應(yīng)（12-14)。欲了解由天然來源衍生 之多醣的生物學(xué)意義，先前已分離及確認(rèn)取自靈芝(一種長期作為中草藥的蕈類)的水溶性 及含巖藻糖多醣(F3)粗萃取物區(qū)分（15)。已證實(shí)，F(xiàn)3為調(diào)節(jié)細(xì)胞介素網(wǎng)絡(luò)、IgM產(chǎn)生、及造血 細(xì)胞增生所必需（16-19)。
[0094] 已發(fā)現(xiàn)多個(gè)可與F3交互作用的樣式辨識受體(pattern recognition receptor)， 包括Dectin-I、DC-SIGN、蘭格素(Langerin)、庫弗氏細(xì)胞受體、巨噬細(xì)胞甘露糖受體、及類 鐸受體(20)。值得注意的是，這些結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)3的活化免疫反應(yīng)可能是藉由與醣類辨識受體 的交互作用。在動物實(shí)驗(yàn)中，據(jù)報(bào)告F3可作為疫苗佐劑，并經(jīng)由增強(qiáng)宿主介導(dǎo)免疫而發(fā)揮抗 腫瘤活性(21)，這引發(fā)一個(gè)問題，即抗體介導(dǎo)免疫是否且如何于小鼠的F3抗腫瘤活性上扮 演一角色。
[0095]在目前的研究中，以富含巖藻糖的F3多醣(FMS)作為免疫原，結(jié)果顯示，誘發(fā)的抗 血清能生物識別相關(guān)的聚醣，具體而言是腫瘤相關(guān)的聚醣表位，這支持一假設(shè)，即靈芝多醣 末端巖藻醣化于抗腫瘤反應(yīng)上扮演關(guān)鍵角色。
[0096]靈芝F3的抗腫瘤活性
[0097]我們首先以動物腫瘤模式進(jìn)行研究，系使用C57BL/6J小鼠并移植鼠科路易氏肺癌 (Lewis lung carcinoma; LLCl)細(xì)胞，以研究F3抗腫瘤活性。簡言之，以皮下注射(s · c ·)方 式將LLCl細(xì)胞植入小鼠，接著每隔一天腹腔注射（i.p.)投予一次F3(每只小鼠24、52、120、 及240mg/kg體重，系溶于PBS);并重復(fù)此流程28天。
[0098]如腫瘤生長曲線（圖5A)所示，F(xiàn)3以劑量依賴性方式明顯抑制LLCl細(xì)胞生長，且最 有效的抑制反應(yīng)出現(xiàn)于120與240mg/kg間之劑量，其為人類每日可行的劑量。然而，MTT試驗(yàn) 結(jié)果顯示，相較于未處理細(xì)胞，F(xiàn)3(〈200μg/ml)對于LLCl細(xì)胞的存活率不具明顯功效（圖 5B)。這些結(jié)果顯示，F(xiàn)3可抑制LLCl細(xì)胞生長并經(jīng)由間接抗腫瘤機(jī)制延長經(jīng)受腫瘤小鼠的存 活率。在動物研究中，先前已報(bào)告萃取自靈芝之多醣的抗腫瘤效果(22,23)。
[0099] 更有趣的是，證據(jù)顯示，經(jīng)靈芝多醣處理之小鼠的血清明顯抑制體外鼠科肉瘤-180(murine sarcoma-180)及人類肺癌(PG)生長，但是單獨(dú)經(jīng)純的靈芝萃取物處理無法誘 發(fā)類似功效(24,25)。因此，發(fā)明人進(jìn)行合成聚醣微數(shù)組分析，以調(diào)查是否F3誘發(fā)之抗血清 能生物識別重要聚醣表位。每隔一周以60個(gè)結(jié)構(gòu)不同的合成寡醣篩選血清樣本，這些寡醣 包括數(shù)種腫瘤相關(guān)的聚醣。鑒于F3誘發(fā)之抗血清的聚醣結(jié)合樣式，顯示一明顯趨勢，即于二 周的F3處理之后，相較于對照組(未經(jīng)F3處理），IgM抗體結(jié)合至Globo H及Globo H系列聚醣 的親和力增加，這些聚醣包括末端四醣(Bb4)及三醣(Bb3)(圖6,且醣類結(jié)構(gòu)顯示于圖7)。 [0 100]與IgM反應(yīng)相反的是，血清IgG不具明顯聚醣結(jié)合功效。截至目前，IgM抗Globo H單 株抗體(mAb)MBrl為含有Globo H醣之共輒物檢測的有價(jià)值探針之一(26，27)，并亦認(rèn)為，其 發(fā)揮補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（complement-dependent cytotoxicity;CDC)以對抗Globo H陽 性腫瘤(8,28)。因此，我們以mAb MBrl免疫染色法檢查LLCl細(xì)胞表面上Globo H抗原表現(xiàn)量 (圖5C)。將F3誘發(fā)之抗血清加入LLCl細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可于體外觸發(fā)細(xì)胞死亡（圖5D)，從而推測F3 具有誘發(fā)抗體介導(dǎo)抗腫瘤活性的潛力。
[0101] 自靈芝分離之富含巖藻糖之多醣區(qū)分(FMS)誘發(fā)抗體辨識Globo H系列結(jié)構(gòu)
[0102] 本發(fā)明之一具體實(shí)施例為癌癥的治療方法，其系藉由投予一有效量之含有FMS及 佐劑的免疫組合物至有需求之個(gè)體。目標(biāo)癌癥類型包括但不局限于，乳癌(包括第1至4期）、 肺癌(如小細(xì)胞肺癌）、肝癌(如肝細(xì)胞癌）、口腔癌、胃癌(包括T1-T4)、結(jié)腸癌、鼻咽癌、皮膚 癌、腎癌、腦腫瘤(如星狀細(xì)胞瘤、多形性神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及腦脊髓膜瘤）、前列腺癌、卵巢 癌、子宮頸癌、膀胱癌、及子宮內(nèi)膜癌、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、及胃腸道間質(zhì)瘤。
[0103]可視需要地，佐劑與FMS包括于免疫原性組合物。在一些具體實(shí)施例中，佐劑為醣 脂質(zhì)。較佳之佐劑包括但不局限于，α-GalCer之合成類似物，如7DW8-5及C34。
[0106] 先前的報(bào)告指出，多醣的巖藻醣化負(fù)責(zé)F3的免疫調(diào)節(jié)活性（15)。由于F3習(xí)知為異 質(zhì)性及高分子量多醣O(jiān)lOOkDa)，因此發(fā)明人以一系列層析步驟自F3純化富含巖藻糖之多 醣區(qū)分，并稱作FMS。
[0107] 利用SEC/MALLS (粒徑排阻層析結(jié)合多角度雷射光散射，size-exclusion chromatography combined with multi-angle laser light scattering)系統(tǒng)，評估FMS 的平均分子量為35kDa。
[0108] 組合物分析顯示，F(xiàn)MS主要由巖藻糖、木糖、半乳糖及甘露糖組成，其比例為2:1.5: 2.5:3.5，并伴隨少量的葡萄糖及胺基糖類(如葡萄糖胺及半乳糖胺）。甲基化分析顯示，F(xiàn)MS 以1，4-甘露聚糖主鏈為主體，并于C3位置具有側(cè)鏈，且C2位置具有1，6-α-半乳聚糖支鏈，并 以末端巖藻糖高度修飾(表3) (29-31)。
[0109] 欲檢查FMS誘發(fā)之抗血清的聚醣結(jié)合性質(zhì)，使用取自功能性醣質(zhì)體協(xié)會H中心 (Consortium for Functional Glycomics(CFG)Core Η)的611 個(gè)聚醋組成的更全面聚醋微 數(shù)組，以評估血清IgM抗體的作用。發(fā)明人分別檢查取自經(jīng)FMS及F3處理之小鼠的第二周血 清樣本。同時(shí)亦分析對照組小鼠（經(jīng)PBS處理）的血清，以測定非專一性結(jié)合的背景值。圖1顯 示以相對焚光單位(relative fluorescence units;RFUs)表示611個(gè)聚醣的結(jié)合輪廓?？?以顯見，F(xiàn)MS組的抗聚醣IgM抗體專一性及選擇性比F3組的更高，這幾個(gè)聚醣包括聚醣編號 (#)60、62、390、391、394、468、469、537、及538。表2列出由？3組結(jié)合的前30個(gè)聚醣的詳細(xì)列 表。
[0110] 表2.由F3誘發(fā)之血清IgM結(jié)合的前30個(gè)聚醣并以結(jié)合強(qiáng)度遞減順序排名之列表
[0111]
[0112] a各個(gè)具有化學(xué)連接符的聚醣結(jié)構(gòu)皆印刷于CFG數(shù)組Version 5.0。連接符結(jié)構(gòu)如 所示：spO = (CH2) 2NH2; sp9 = (CH2) 5NH2; sp21 = N( CH3) 0CH2CH2NH2。
[0113] 雖然影響抗體結(jié)合力的確切抗原尚不清楚，但是變得更清楚的是，這些排名前面 的由FMS誘發(fā)之抗血清結(jié)合的聚醣，其非還原端皆具有共同結(jié)構(gòu)，即Fuca l-2GalM_ 3GalNAc-R。更有趣的是，發(fā)現(xiàn)有一群聚醣(##390、391、及394)具有最高的抗體結(jié)合強(qiáng)度，顯 示Fucal-2GalPl_3GalNAc-R還原端的額外雙醣(Fucal-2Gal)延伸可改進(jìn)抗血清結(jié)合親和 力。
[0114]接著，我們探討是否任何高度識別性聚醣與內(nèi)源性人類腫瘤相關(guān)抗原有關(guān)。當(dāng)進(jìn) 一步分類這些聚醣結(jié)構(gòu)的特性及其生物來源時(shí)，顯示大部分代表僅能于人類醣鞘酯 (glycosphingolipids ;GSLs)發(fā)現(xiàn)的血型ABH決定位（圖2) (32-34)。該三個(gè)聚醣#390、391、 及394具有特征決定位，其屬于GSL新乳糖系列(neolacto-series)(第3型鏈)的末端聚醣結(jié) 構(gòu)。已有報(bào)