鼠24、52、120、及240mg/kg體重)腹腔注射處理21天。以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差 表示腫瘤體積曲線(各組n = 4~6)。圖中顯示相較于對(duì)照組(經(jīng)PBS處理的小鼠)的腫瘤生長(zhǎng) 統(tǒng)計(jì)分析。#噸〈〇.〇〇1。(8)以?3(0、60、90、120、及18(^8/1111)于體外處理1^(:1細(xì)胞(1\10 3) 24h,并以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5_二苯基四唑溴化物(MTT)試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞存活率。 將未處理細(xì)胞之存活率標(biāo)準(zhǔn)化為100%。數(shù)據(jù)以土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(n = 4)。(C)以mAb MBrl檢 測(cè)及流式細(xì)胞儀分析鑒定表現(xiàn)于LLCl細(xì)胞的Globo H。在此直方圖中,y軸表示細(xì)胞數(shù)目且X 軸表示熒光強(qiáng)度(對(duì)數(shù)尺度)。以DyLight-649共輒連接的MBrl進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞染色(紅線)。非 專一性結(jié)合對(duì)照組的染色僅以二級(jí)mAb進(jìn)行(藍(lán)線)。細(xì)胞含于PBS(含有5 %BSA)代表空白組 (黑線)<3(D)F3誘發(fā)之抗血清于體外觸發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)LLCl細(xì)胞溶解。將細(xì)胞培養(yǎng)于10%抗血 清,并分成下列四組:(1)經(jīng)PBS處理小鼠;(2)經(jīng)F3處理小鼠;(3)經(jīng)受LLCl小鼠;以及⑷經(jīng) F3處理/經(jīng)受LLCl小鼠。在37°C下培養(yǎng)Ih之后,細(xì)胞以FITC共輒連接的膜聯(lián)蛋白(annexin V)染色并以碘化丙啶(propidium iodide;PI)復(fù)染,以藉流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期凋亡及晚期 凋亡細(xì)胞。早期凋亡細(xì)胞(% )呈現(xiàn)膜聯(lián)蛋白V-FITC+及ΡΓ,且晚期凋亡細(xì)胞(% )呈現(xiàn)膜聯(lián)蛋 白V-FITC及PI雙重陽(yáng)性。
[0036]圖6為經(jīng)F3處理的小鼠血清(腹腔注射120mg/kg體重)的聚醣微數(shù)組分析。由四個(gè) 實(shí)驗(yàn)條件取得測(cè)試抗血清(于第一次注射后第14天):經(jīng)PBS處理的小鼠、經(jīng)F3處理的小鼠、 經(jīng)受LLCl小鼠、及經(jīng)F3處理/經(jīng)受LLCl小鼠。測(cè)定血清IgM抗體對(duì)于60個(gè)合成寡醣數(shù)組的聚 醣結(jié)合輪廓。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(各組n = 4~6)。圖中指出具顯著差異的IgM結(jié) 合之Globo H系列聚醣及其聚醣數(shù)目。圖7列出數(shù)組上60個(gè)結(jié)構(gòu)不同的寡醣。
[0037]圖7列出連接于組裝式聚醣芯片之NHS功能化玻璃面的60個(gè)聚醣結(jié)構(gòu)及其聚醣數(shù) 目。
[0038]圖8為經(jīng)FMS處理組及對(duì)照組小鼠腹腔細(xì)胞族群的FACS輪廓。數(shù)字(% )代表各圈選 的陽(yáng)性細(xì)胞。經(jīng)PBS處理組(對(duì)照組)與經(jīng)FMS處理組小鼠間之B2 B細(xì)胞(A)及巨噬細(xì)胞(B)子 族群無(wú)顯著差異。各組n = 3~5。
[0039]圖9(9A)設(shè)計(jì)二個(gè)免疫接種方案以評(píng)估預(yù)防性及治療性處理。(9B)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn) 以評(píng)估FMS誘發(fā)之血清IgM的聚醣專一性。將競(jìng)爭(zhēng)劑醣類及抗血清(以1:100比例稀釋測(cè)試) 同時(shí)加入Globo H印刷芯片上的子孔。以無(wú)競(jìng)爭(zhēng)劑的抗血清進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以取得結(jié)合百分比。 圖中顯示二獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一代表數(shù)據(jù)。η = 3重復(fù)。
[0040] 圖IO(IOA)全甲基化FMS水解物醛醣醇類之單電荷加鈉分子離子的MALDI-MS制圖 及組成指派。(IOB)FMS水解物之全甲基化醛醣醇類的目標(biāo)性nan〇LC-MS/MS聚醣定序及巖藻 糖化表位鍵聯(lián)鑒定。圖中顯示FMS-H聚醣的基峰層析圖及聚醣組合物lFuc-2He X-it〇l、 lFuc-IXy-lHex-itol、及3Fuc-itol的個(gè)別萃取離子層析圖(彩色背景)C3NL(標(biāo)準(zhǔn)化水平)代 表層析圖的軸強(qiáng)度。表1顯示觀察到的m/z及聚醣組合物分析。
[0041] 表1.全甲基化FMS水解物醛醣醇類之nan〇LC-MS光譜觀察到的多電荷加鈉分子離 子的組成指派
[0045] a所有觀察到的分子離子具有小于2ppm的質(zhì)量誤差。
[0046] b加鈉分子離子的電荷狀態(tài)。
[0047] 。P =五碳糖;F =巖藻糖;A=己醣醛酸;H=六碳糖;-〇1 =中性丟失末端殘基。 [0048] d藉由將波峰半高寬平均觀察到的質(zhì)譜相對(duì)強(qiáng)度。
[0049]圖11為FMS水解物之全甲基化醛醣醇類的目標(biāo)區(qū)域奈米LC-MS/MS聚醣定序及巖藻 糖化表位鍵聯(lián)鑒定。藉由(11A) lFuc-2Hex_itol、( IIB及11C) lFuc-lXyl-lHex-itol、及 (I ID) 3Fuc-i to 1的數(shù)據(jù)依賴性MS2及隨后的MS3 (彩色背景)光譜,以鑒定全甲基化FMS水解物 醛醣醇類的巖藻糖化醣表位(glycotope)鍵聯(lián)。紅色三角形代表巖藻糖殘基。白色圓形代表 八碳糖殘基。星號(hào)代表木糖殘基。
【具體實(shí)施方式】
[0050] "Reishi(靈芝)"是指蕈類靈芝(Ganoderma Iucidum)之一形式的名稱,及其近親 松杉靈芝(Ganoderma tsugae)。"純化的靈芝"是指靈芝萃取物,其制備如美國(guó)正式申請(qǐng)案 第11/553,402號(hào)及/或第10/213,257號(hào)(現(xiàn)為美國(guó)專利第7,135,183號(hào))所揭示,在此并入本 案以作為參考資料,其中純化的靈芝包含多醣或含有末端巖藻糖殘基的醣勝肽。
[0051] 以靈芝的堿萃取物進(jìn)行粒徑排阻層析法。將具有O.D.625光吸收值約1.8的主要區(qū) 分命名為區(qū)分3。區(qū)分3包括含巖藻糖的醣蛋白部分,其包含末端巖藻糖殘基。"末端巖藻糖 殘基"一詞是指位于接近醣鏈游離端之區(qū)域的醣鏈之巖藻糖殘基。區(qū)分3的含巖藻糖醣蛋白 部分亦包括以al,2-巖藻糖苷鍵聯(lián)及α3,4_巖藻糖苷鍵聯(lián)結(jié)合的巖藻糖殘基。
[0052] FMS為源自F3的富含巖藻糖之多醣區(qū)分,其具有獨(dú)特免疫原性,且以F3或FMS免疫 接種的小鼠可發(fā)揮有效的抗體介導(dǎo)反應(yīng)以對(duì)抗表現(xiàn)Globo H的鼠科LLCl細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)與 先前的主張一致,即由靈芝多醣強(qiáng)化的宿主免疫功能提供Globo H陽(yáng)性肺癌病患免疫治療 上極大的功效(48)。依據(jù)聚醣結(jié)構(gòu)分析,最可能的巖藻基聚醣部分為?11〇<11-2631-1?、?11〇€[1-3/4Man_R、FucaI-4XyI-R及FucaI-2Fuc_R。
[0053] 其中一些可活化抗體反應(yīng)以對(duì)抗腫瘤專一性聚醣表位,這為開(kāi)發(fā)復(fù)合醣類發(fā)展出 一方向,作為以免疫調(diào)節(jié)為主的治療。雖然本研究局限在靈芝多醣,且大部分針對(duì)肺癌,不 過(guò)高通量聚醣微數(shù)組分析及醣類抗原詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析應(yīng)可應(yīng)用于其他藥用多醣,其誘發(fā)不同 的抗體介導(dǎo)生物功能。
[0054] 在下列說(shuō)明中,參考同為本發(fā)明之一部份的圖式,其通過(guò)圖解可實(shí)施之特定具體 實(shí)施例的方式呈現(xiàn)。這些具體實(shí)施例系經(jīng)詳述以使熟習(xí)本領(lǐng)域者能實(shí)施本發(fā)明,并應(yīng)理解 到,可采用其他具體實(shí)施例,且可進(jìn)行結(jié)構(gòu)、邏輯、及電學(xué)上的改變而不背離本發(fā)明之范疇。 因此,下列示例性具體實(shí)施例之說(shuō)明不可視為具有局限性,且本發(fā)明之范疇系如所附申請(qǐng) 專利范圍之定義。
[0055] 除非另有定義,本文所使用的技術(shù)性及科學(xué)性術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明領(lǐng)域之技術(shù)人員所 能常規(guī)理解的意義。盡管類似或等同于本文所述之任何方法及材料可用于本發(fā)明之實(shí)施或 測(cè)試,現(xiàn)將說(shuō)明較佳之方法及材料。本文所特別提及的所有公開(kāi)文獻(xiàn)及專利皆并入本案以 作為參考數(shù)據(jù),其目的在于包括說(shuō)明及揭示公開(kāi)文獻(xiàn)所報(bào)告的化學(xué)品、細(xì)胞株、載體、動(dòng)物、 儀器、統(tǒng)計(jì)分析、及方法學(xué),其用途可能與本發(fā)明相關(guān)。本說(shuō)明書(shū)引用的所有參考文獻(xiàn)皆視 為代表本領(lǐng)域之技術(shù)水準(zhǔn)。本文不可解釋為同意本發(fā)明無(wú)權(quán)先于先前發(fā)明揭露。
[0056] 在說(shuō)明本發(fā)明之材料及方法前,應(yīng)理解到,本發(fā)明未局限于所述的特定方法學(xué)、步 驟、材料、及試劑,因其可能改變。亦應(yīng)理解到,本文使用之術(shù)語(yǔ),目的僅在于說(shuō)明特定具體 實(shí)施例,而非旨在局限本發(fā)明之范疇,并將僅局限于所附之申請(qǐng)專利范圍。
[0057] 當(dāng)提供一范圍之?dāng)?shù)值時(shí),應(yīng)理解到,除非本文另有明確說(shuō)明,各中間值至下限單位 的十分之一、該范圍之上限與下限之間、及該設(shè)定范圍的任何其他設(shè)定值或中間值皆涵蓋 于本發(fā)明之內(nèi)。這些較小范圍的上限及下限可獨(dú)立地包括于較小范圍內(nèi),亦可涵蓋于本發(fā) 明之內(nèi),其皆受設(shè)定范圍的任何特定排除限制。當(dāng)設(shè)定范圍包括限制值之一或兩者時(shí),排除 于這些涵蓋的限制值的任一或兩者之外的范圍亦包括于本發(fā)明之中。
[0058] 除非另有指明,本發(fā)明之實(shí)施將采用常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組型DNA、及免 疫學(xué)技術(shù),其皆為本領(lǐng)域之技術(shù)范圍。此類技術(shù)皆于文獻(xiàn)中完整解釋。參見(jiàn)如Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed·,ed·by Sambrook,Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989);DNA Cloning,Volumes I and II(D.N.Glover ed.,1985);Culture Of Animal CelIs(R·I·Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press ,1986);B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning( 1984);專書(shū)類,Methods In Enzymology (Academic Press , Inc., N.Y.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)!Methods In EnzymologyjVols.154and 155(ffu et al.eds.);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)!Antibodies:A Laboratory Manual,by Harlow and Lanes(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988);以及Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I_IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds·,1986)〇
[0059] 除非另有明確指明,本文及后附申請(qǐng)專利范圍中使用的單數(shù)形式"一"、"一者"、及 "該"皆包括復(fù)數(shù)參考體。因此,舉例而言,"運(yùn)輸增強(qiáng)劑"包括復(fù)數(shù)個(gè)運(yùn)輸增強(qiáng)劑及單一運(yùn)輸 增強(qiáng)劑。參照"螫合劑",其包括二或多個(gè)螫合劑及單一螫合劑等。在本說(shuō)明書(shū)及隨附的申請(qǐng) 專利范圍中,將會(huì)參考一些術(shù)語(yǔ),其應(yīng)定義為具有下列涵意:
[0060] 本文使用的"治療性"及"治療"等詞是指投予藥劑或配方至患有不良病況、疾病、 或病癥之臨床癥狀的個(gè)體,以進(jìn)行降低癥狀嚴(yán)重度及/或頻率、消除癥狀及/或其潛在病因、 及/或促進(jìn)損傷的改善或補(bǔ)救。"預(yù)防性"及"預(yù)防"等詞是指投予藥劑或組合物至臨床上無(wú) 癥狀的個(gè)體,其易患有特定不良病況、疾病、或病癥,因此其系有關(guān)預(yù)防癥狀及/或其潛在病 因的發(fā)生。除非另有指明,不論明示或暗示,若使用本文中"治療"(或"治療性")一詞而未提 及可能的預(yù)防,其旨在亦涵蓋預(yù)防。
[0061 ] "可視需要的"或"可視需要存在",如用于"可視需要的取代物"或"可視需要存在 的添加劑"是指后續(xù)描述的成分(如取代物或添加劑)可存在或可不存在,因此該描述包括 成分存在的實(shí)例及成分不存在的實(shí)例。
[0062] "醫(yī)藥上可接受"一詞是指非生物學(xué)上或其他方面非所要之材料,例如,該材料可 并入本發(fā)明之配方而不造成任何非所要的生物效應(yīng)或以有害方式與劑型配方之其他組分 之任一者交互作用。然而,當(dāng)"醫(yī)藥上可接受"一詞用于涉及醫(yī)藥上賦形劑時(shí),意指賦形劑已 符合毒理學(xué)及制造測(cè)試所需的標(biāo)準(zhǔn)及/或其包括于美國(guó)食品藥物管理局提出的非活性成分 指南(Inactive Ingredient Guide)。如以下之進(jìn)一步詳述,"藥理學(xué)上活性"(或簡(jiǎn)單而言 "活性"),如用于"藥理學(xué)上活性"衍生物或類似物,意指衍生物或類似物具有如同母藥的相 同類型藥理學(xué)活性。
[0063]本文使用的"抗原"一詞系定義為任何能誘發(fā)免疫反應(yīng)的物質(zhì)。
[0064] 本文使用的"免疫原"一詞是指抗原或物質(zhì)能誘發(fā)產(chǎn)生抗原,如DNA疫苗。
[0065] 本文使用的"免疫原性"一詞是指免疫原、抗原、或疫苗刺激免疫反應(yīng)的能力。
[0066] 本文使用的"免疫療法"一詞是指基于調(diào)控免疫系統(tǒng)之概念的治療方案模式,以達(dá) 到預(yù)防及/或治療目的。
[0067] 本文使用的"細(xì)胞介素"一詞是指多種小型、分泌性蛋白質(zhì)之任一者,其藉由影響 免疫細(xì)胞分化過(guò)程以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度及時(shí)間,該過(guò)程通常涉及基因表現(xiàn)改變,使得前 驅(qū)細(xì)胞變成不同的特化細(xì)胞類型。細(xì)胞介素基于其推測(cè)之功能、分泌之細(xì)胞及作用目標(biāo)已 廣泛命名為淋巴激素 (Iymphokines )、介白素及趨化介素。舉例而言,一些常見(jiàn)的介白素包 括但不局限于,11-12、11^-18、幾-2、正^丫、了陬、幾-4、比-1〇、比-13、比-21及了6卩-0。
[0068] 本文使用的"趨化介素" 一詞是指于感染位置釋放的各種小型趨化性細(xì)胞介素之 任一者,為提供動(dòng)員及活化淋巴細(xì)胞的工具。趨化介素吸引白血球至感染位置。趨化介素具 有保留的半胱胺酸殘基,使其能分成四個(gè)族群。這些族群的代表性趨化介素為C-C趨化介素 (1^1^^3、1〇 3-1、1〇?-1€[、及11?-10)、^-(:趨化介素(11^-8)、(:趨化介素(淋巴趨化因子 (Lymphotactin))及CXXXC趨化介素(分形素(Fractalkine))。
[0069] 本文使用的"表位"一詞系定義為抗原分子的一部分,其接觸抗體之抗原結(jié)合位置 或T細(xì)胞受體。
[0070] 本文使用的"疫苗"一詞是指含有抗原的制劑,其系由完整致病生物體(死亡或減 毒)或此類生物體之成分如蛋白質(zhì)、勝肽、或多醣組成,其用于產(chǎn)生免疫力以對(duì)抗生物體造 成的疾病。疫苗制劑可為天然的、合成的或衍生自重組型DNA技術(shù)。
[0071] 本文使用的"免疫佐劑"一詞是指用于與免疫原結(jié)合的物質(zhì),其強(qiáng)化或改良免疫原 的免疫反應(yīng)。以α-GalCer類似物作為免疫佐劑以改良或增加疫苗效果,其系刺激病患的免 疫系統(tǒng),使投予該疫苗的病患對(duì)于疫苗的反應(yīng)更激烈。在一示例性實(shí)施中,以類似物C34作 為佐劑。本文使用的"鋁佐劑"一詞是指具有免疫佐劑活性的鋁鹽。此試劑可于溶液中吸附 及沈淀抗原蛋白;所得的沈淀物可改進(jìn)疫苗免疫原性,其系藉由促進(jìn)抗原自接種位置形成 的疫苗積存處緩慢釋放。
[0072] 本文使用的"抗腫瘤免疫療法活性劑"一詞是指本發(fā)明之疫苗產(chǎn)生的抗體可抑制、 減少及/或消除腫瘤。
[0073] 本文使用的"抗原專一性"一詞是指細(xì)胞族群的特性,因此供應(yīng)特定抗原或抗原片 段區(qū)分可造成專一性細(xì)胞增生。