具有抗炎活性的永瓣藤提取物、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及中藥技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及從天然植物永瓣藤中提取總=祗類(lèi)化合物的 制備方法和其在抗炎藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 永瓣藤(Monimope1:alum Qiinese Rehd.)系衛(wèi)矛科（Celastraceae)永瓣藤屬單 型屬植物，是中國(guó)特有植物，種群十分稀少，被列為國(guó)家首批二級(jí)保護(hù)植物。1925年，中國(guó) 植物學(xué)家秦仁昌首次在安徽省祁口縣棟里村潘坑采到果實(shí)標(biāo)本，于1926年發(fā)表，當(dāng)時(shí)擬名 為祁藤。美國(guó)植物分類(lèi)學(xué)家A. Rehder根據(jù)秦仁昌采集的3096號(hào)標(biāo)本，視其果實(shí)外有大而宿 存的花瓣，并永不調(diào)落，在植物界中頗為罕見(jiàn)，故稱(chēng)永瓣藤。1959年才于江西省景德鎮(zhèn)采到 花期標(biāo)本。1997年，江西省的專(zhuān)業(yè)采集人譚策銘在湖北省通山縣太平山發(fā)現(xiàn)新分布。對(duì)永 瓣藤研究和應(yīng)用十分稀少。已報(bào)道從永瓣藤中分離獲得4個(gè)五環(huán)=祗類(lèi)化合物，分別為算盤(pán) 子酬(glochidone) [1'2]、木栓酬(friedelin) [2]、表木栓醇（邱i打iedelinol) [2]和表木 栓醇二十八燒酸醋（邱1；^1'1日(1日1；[]1〇1〇(31日(303日]1日1日）口]。江西民間用永瓣藤治療風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎但目前，尚未見(jiàn)有永瓣藤抗炎藥理活性、抗炎活性成分的確定和總=祗提取物制 備方法的研究報(bào)道。
[0003] 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis ,RA)是一種慢性的、有癥狀的、可導(dǎo)致不 同的對(duì)病人嚴(yán)重的、全身影響的疾病。常用的治療藥物W非醬體類(lèi)抗炎藥、激素類(lèi)藥物、生 物制劑等為主，但由于價(jià)格昂貴、長(zhǎng)期服用毒副作用大，限制了其應(yīng)用。中藥治療風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎歷史悠久，具有療效好、毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，因此，有廣泛的應(yīng)用前景。我國(guó)地域迂闊， 中藥材資源豐富，藤類(lèi)中藥在中醫(yī)絡(luò)病尤其是在風(fēng)濕搏證的防治中占有重要地位，《本草綱 目》和《本草綱目拾遺》中收載藤莖類(lèi)中藥200余種。因藤類(lèi)植物活力頑強(qiáng)，攀樹(shù)緣壁，盤(pán)根錯(cuò) 節(jié)，W取類(lèi)比象原理，取其入藥，善走經(jīng)絡(luò)，桂風(fēng)濕，解筋李。正如《本草匯言》云："凡藤蔓之 屬，可通經(jīng)入絡(luò)"。即：凡藤蔓之屬，善于攀越纏繞，質(zhì)地堅(jiān)初，不但具有桂風(fēng)除濕、行氣活血 功效，更是通絡(luò)引經(jīng)之使藥佳品?！侗静菥V目》云："凡藤蔓之屬，象人之筋，所W多治筋病。" (《本草綱目?卷十八》)筋與肌肉骨節(jié)相連屬，其病常互相影響。故藤蔓之藥不獨(dú)治筋病，對(duì) 肌肉骨節(jié)搏病亦有較好療效。搏證的病因病機(jī)為氣血不足，外邪乘虛侵襲肌表，流注經(jīng)絡(luò)、 關(guān)節(jié)，致使氣血不行，血脈渺滯，關(guān)節(jié)腫脹，故治療搏病一定要從通經(jīng)活絡(luò)入手。根據(jù)藤類(lèi)藥 物性味，用W治療搏病所見(jiàn)的肌肉筋骨關(guān)節(jié)疼痛，具有通經(jīng)活絡(luò)、舒筋止痛的效果。如雞血 藤、雷公藤、絡(luò)石藤、忍冬藤、海風(fēng)藤等，多具有活血化疲，桂風(fēng)通絡(luò)的作用，臨床上多用于治 療風(fēng)濕搏痛、關(guān)節(jié)不利、筋脈拘李。衛(wèi)矛屬植物被我國(guó)中醫(yī)、少數(shù)民族醫(yī)用及民間藥用的有 61種，大多用于治療跌打損傷、風(fēng)濕搏痛、活血止血、殺蟲(chóng)解毒。永瓣藤作為民間偏方，應(yīng)用 極少，其活性成分和藥效機(jī)理均不明確，加上作為珍稀植物較少為人了解，所W其開(kāi)發(fā)利用 還是空白。雖然林業(yè)農(nóng)業(yè)學(xué)者已經(jīng)找到其繁殖率低的原因，并擁有技術(shù)提高其繁殖率，但沒(méi) 有經(jīng)濟(jì)效益，農(nóng)民不愿意種植，無(wú)法推廣，使得永瓣藤的資源仍為稀少。只有開(kāi)發(fā)其深入價(jià) 值，才能吸引更多的關(guān)注，擴(kuò)大種植面積和進(jìn)行可持續(xù)發(fā)展的資源保護(hù)。
[0004]與本發(fā)明有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有。
[000引[1]陳玲，謝平，戚薇等。永瓣藤化學(xué)成分的研究。江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994, 6 (1)：30-32〇
[0006] [2]謝平，朱盛華，馮育林等。永瓣藤化學(xué)成分的研究（I)。江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2001, 13(4)：159-160〇
[0007] [3]謝平，朱盛華，馮育林等。永瓣藤化學(xué)成分的研究（II)。江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2002，14(1):39-40。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明旨在提供一種永瓣藤提取物的制備方法，總=祗有效部位中抗炎活性成分 的組成，W及在制備抗炎藥物中的用途。
[0009] 本發(fā)明公開(kāi)了一種具有抗炎活性永瓣藤提取物，其特征在于：由扁葫藤素 (Pristimerin)、雷公藤酪A(Wilforc)I A)、美登木酸（Polpunonic acid)、雷公藤紅素（又 名南蛇藤素，Celastrol)、衛(wèi)矛酬（Tingenone)、木栓酬（Rriedelin)等S祗成分組成的有 效部位。結(jié)構(gòu)式如下所示。 本發(fā)明是通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0011] 上述永瓣藤提取物的制備方法，其特征在于：W植物永瓣藤（Monimopetalum 化inese Rehd.)莖葉為原料，甲醇、乙醇或含水醇類(lèi)提取，過(guò)濾、濃縮至小體積，加少量水 懸浮后用大孔樹(shù)脂柱層析，收集80~100%醇洗脫部位即得總=祗部位。
[0012] 本發(fā)明所述永瓣藤提取物（總=祗部位）進(jìn)行體外抗炎實(shí)驗(yàn)篩選，利用脂蛋白 (LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨隧細(xì)胞RAW264.7建立體外抗炎模型，檢測(cè)炎癥因子前列腺素E2(PGE2)和 一氧化氮(NO)的生成，炎癥因子濃度越低，活性越高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明所述的天然抗炎 藥物對(duì)炎癥因子前列腺素E2和一氧化氮有明顯的抑制作用。
[0013] 本發(fā)明所述永瓣藤提取物(總=祗部位)進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物抗炎實(shí)驗(yàn)，各劑量組對(duì)二甲 苯致小鼠耳腫脹均有不同程度的抑制作用，對(duì)蛋清致大鼠足腫脹均有不同程度的抑制作 用，能夠明顯降低足腫脹度，顯示對(duì)急性炎癥引起的腫脹、滲出有一定的抑制作用;對(duì)棉球 植入法致大鼠肉芽增生均有不同程度的抑制作用，顯示對(duì)慢性炎癥的肉芽增生有一定的抑 制作用。
[0014] 本發(fā)明所述永瓣藤提取物（總=祗部位）用作藥物時(shí)，可W直接使用，或者W藥物 制劑形式使用。
[0015] 本發(fā)明所述永瓣藤提取物(總=祗部位)與醫(yī)學(xué)上可接受載體或賦形劑制備成片 劑、膠囊劑、注射劑、外用溶液劑、洗劑、搔劑、軟膏劑、糊劑、貼劑、緩釋或控釋制劑。
[0016] 本發(fā)明的有益效果如下。
[0017] 1，藥物制備工藝簡(jiǎn)單、操作合理。
[0018] 2,通過(guò)體內(nèi)體外抗炎藥理實(shí)驗(yàn)，明確了永瓣藤抗炎活性的有效部位，集中在極性 較小的80~100%醇洗脫部位，提高了藥效，降低了雜質(zhì)的組成和毒副作用，為永瓣藤在治療 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床用藥方面，提供了理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[0019] 3,通過(guò)超高壓液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(WLC- Q TOF MS)分析，首次 明確了抗炎活性的有效部位組成為立祗，包括衛(wèi)矛酬(分子式C2姐36〇3，分子量420.58，CAS No. 50802-21-6)、木栓酬（分子式C3地5〇0,分子量426.72，CAS No. 559-74-0)、雷公藤紅素 (分子式〔2姐38〇4，分子量450.61，〔48齡.34157-83-〇)、美登木酸（分子式〔3〇此8〇3，分子量 456.70，CAS No. 33600-93-0)、扁葫藤素（分子式C3訊4〇〇4,分子量464.64，CAS No. 1258-84-0)、雷公藤酪A(分子式C2曲38〇5，分子量466.62，CAS No. 167882-66-8)。除了木栓酬已有 文獻(xiàn)報(bào)道，其余活性成分均為首次從永瓣藤中發(fā)現(xiàn)。此外，還首次發(fā)現(xiàn)永瓣藤中20~60%乙 醇部位含有兒茶素類(lèi)抗氧化活性成分，60~80%乙醇部位含有殺蟲(chóng)抗菌活性的0-二氨沉香 巧喃倍半祗(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?CN201510321499 )，但均無(wú)明顯的抗炎活性。
[0020] 4,目前，永瓣藤的經(jīng)濟(jì)、觀(guān)賞價(jià)值研究尚屬空白，開(kāi)展藥用成分研究，在利用的基 礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)有效保護(hù)，可W起到遷地保護(hù)及可持續(xù)發(fā)展作用。祁n縣林業(yè)局對(duì)永瓣藤的育苗 栽培已有豐富經(jīng)驗(yàn)，一旦得到利用，可W規(guī)?；N植，其植物資源大大豐富，也可W增加農(nóng) 民的經(jīng)濟(jì)收益。永瓣藤的化學(xué)成分研究對(duì)衛(wèi)矛科種群起源進(jìn)化、相互關(guān)系，W及闡明華東植 物區(qū)系的起源和外部的聯(lián)系等方面均有重要科學(xué)意義。
【附圖說(shuō)明】
[0021] W下圖可作為附件材料上報(bào)。
[0022] 圖1、本發(fā)明實(shí)施例1所得的永瓣藤提取物活性成分的結(jié)構(gòu)式。
[0023] 圖2、本發(fā)明實(shí)施例1所得的永瓣藤提取物UPLC-Q TOF MS正離子色譜圖。
[0024] 圖3、本發(fā)明實(shí)施例1所得的扁葫藤素高分辨質(zhì)譜(HR-ESI MS)譜圖。
[002引圖4、本發(fā)明實(shí)施例1所得的雷公藤酪A高分辨質(zhì)譜(HR-ESI MS)譜圖。
[0026] 圖5、本發(fā)明實(shí)施例1所得的美登木酸高分辨質(zhì)譜(HR-ESI MS)譜圖。
[0027] 圖6、本發(fā)明實(shí)施例1所得的雷公藤紅素高分辨質(zhì)譜(HR-ESI MS)譜圖。
[002引圖7、本發(fā)明實(shí)施例1所得的衛(wèi)矛酬高分辨質(zhì)譜(HR-ESI MS)譜圖。
[0029] 圖8、本發(fā)明實(shí)施例1所得的木栓酬高分辨質(zhì)譜(HR-ESI MS)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅僅限于所 列舉的實(shí)施方式。
[0031] 實(shí)施例1.永瓣藤提取物(總=祗部位)的制備。
[0032] 實(shí)驗(yàn)方法:永瓣藤莖葉5 kg，用8倍量80%乙醇80°C加熱回流提取3次，過(guò)濾、濃縮至 小體積，加少量水懸浮后經(jīng)DlOl大孔樹(shù)脂柱層析，水洗脫雜質(zhì)（Fr. 1 )，20%乙醇洗脫部位 (化.2)、40%乙醇洗脫部位(Fr. 3)和60%乙醇洗脫部位(Fr. 4)分開(kāi)收集不用，80%乙醇和100% 乙醇洗脫部位合并(化.5和化.6)收集濃縮干燥后可得總S祗部位。
[0033] 總S祗部位的成分分析。
[0034] 分析方法:美國(guó)Agilent公司1260 U化C-6530QT0F型液質(zhì)聯(lián)用儀;色譜柱:安捷倫 Zorbax SB-Cis GOObar，1.8 皿，4.6X IOOmm;流動(dòng)相 A相:0.1%甲酸-水，B相：乙臘，洗脫梯 度0 min 40% B，60 min 100% B，70 min 100%B;流速0.3 血/min;進(jìn)樣量扣!^;柱溫35 °C ; DAD檢測(cè)波長(zhǎng)240皿，270皿;質(zhì)譜檢測(cè)器ESI離子源，正離子模式（100-1700m/z)，霧化器壓力 (Nebulizer pressure)50psi，干燥氣流速（Dicing Gas Flow)10mL/min，干燥氣溫度 (Diying Gas Temp)350°C，毛細(xì)管電壓(Xapillary Vol