用于軟骨細(xì)胞或軟骨型細(xì)胞再生的基因治療的制作方法
【專利說明】用于軟骨細(xì)胞或軟骨型細(xì)胞再生的基因治療
[00011本申請要求2013年9月9日提交的美國臨時專利申請系列No.61/875,509的優(yōu)先 權(quán)，將其全部按引用并入本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明總地涉及至少醫(yī)學(xué)、外科手術(shù)、解剖學(xué)、生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和/或分子生物 學(xué)的領(lǐng)域。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 軟骨再生
[0005] 關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)軟骨損傷常常發(fā)生;美國每年超過6百萬人為了各種膝關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)和 踝關(guān)節(jié)問題而就診。關(guān)節(jié)軟骨的漸進(jìn)性磨損和撕裂可以導(dǎo)致漸進(jìn)性軟骨組織丟失，進(jìn)一步 暴露骨端，使其沒有保護(hù)。這最終惡化成最常見的關(guān)節(jié)炎-骨關(guān)節(jié)炎(或退行性關(guān)節(jié)病）。
[0006] 已經(jīng)報道了在美國，骨關(guān)節(jié)炎影響了33.6% (12.4百萬）65歲和更大年齡的成人。 美國骨科醫(yī)生研究會(AA0S)報道了骨關(guān)節(jié)炎是2004年的主要診斷，占據(jù)了67%的短期停留 和非致命的住院治療。鑒于日增的人群，尤其是在具有較長壽命預(yù)期的老年人中，損傷和骨 關(guān)節(jié)炎的發(fā)生將毫無疑問地增加，不僅是在美國，而是全世界的。
[0007] 在人體中存在三種類型的軟骨:透明軟骨(例如，在動關(guān)節(jié)內(nèi)）、纖維軟骨(例如，膝 半月板和TMJ盤)和彈性軟骨(例如，耳朵）。具體地，覆蓋骨表面的關(guān)節(jié)軟骨是軟且?；该?軟骨，其呈現(xiàn)出較好的潤滑、磨損和低摩擦特性;其還降低關(guān)節(jié)中的應(yīng)力。
[0008] 關(guān)節(jié)軟骨由少量軟骨細(xì)胞組成，而致密的胞外基質(zhì)（ECM)防止軟骨細(xì)胞迀移。此 外，關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管、神經(jīng)和淋巴網(wǎng)絡(luò)，以及各種局部祖細(xì)胞。還被描述為具有高水平的 蛋白酶抑制劑，其可能抑制有效的組織修復(fù)。
[0009]出于這些原因，目前挑戰(zhàn)恢復(fù)受損或患病關(guān)節(jié)軟骨中的全部組織功能。盡管傳統(tǒng) 方法，如自體移植和同種異體移植，已經(jīng)在臨床上用于治療關(guān)節(jié)軟骨損傷，但仍然存在與這 些治療相關(guān)的許多缺陷。自體移植，其需要將來自病人的一小部分低負(fù)重軟骨植入缺陷部 位中，具有如供體部位不健全和有限的軟骨組織可供性這樣的缺陷。同種異體移植，從組織 庫獲得軟骨片，可能潛在地引起免疫應(yīng)答。
[0010]對于具有嚴(yán)重關(guān)節(jié)損傷和骨關(guān)節(jié)炎的病人，需要全關(guān)節(jié)置換手術(shù)。然而，在關(guān)節(jié)置 換后常常發(fā)生許多并發(fā)癥，如發(fā)炎、感染和植入物松動，并且可能導(dǎo)致植入失敗，迫使將來 進(jìn)行修正手術(shù)。實(shí)際上，由于失敗的髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)置換，2003年美國的328,000例髖關(guān)節(jié) 置換有近36，000例修正（11 % )，418，000膝關(guān)節(jié)置換有33，000例修正(8 % )。
[0011]因此，希望研發(fā)一種有效且簡單的方法來成功修復(fù)和再生關(guān)節(jié)軟骨組織。作為快 速擴(kuò)張的領(lǐng)域，組織工程化可以通過產(chǎn)生生物模擬組織替代物來提供用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)和 再生的替換解決方法。通常，關(guān)節(jié)軟骨是一旦損傷不可自然再生的組織。最近，已經(jīng)嘗試通 過在實(shí)驗(yàn)室中再生一部分受損組織來重建受損的生物組織。這種定義為"組織工程化"的方 法已經(jīng)引起了極大的關(guān)注。
[0012]組織工程化涉及產(chǎn)生能夠特異性地與生物組織相互作用來產(chǎn)生功能性組織等價 物的生物相容性材料。組織工程化具有從病人收集所需組織、從組織樣本收集細(xì)胞、使細(xì)胞 增殖以及將這些細(xì)胞重新引回體內(nèi)的基本概念。
[0013] 在特定的情況下，將基因用作用于生物組織再生的治療組合物。在某些情況下，如 心臟生物組織的再生，基因 Gata4、Mef2C和Tbx5已經(jīng)顯示出在一些病人中產(chǎn)生心肌細(xì)胞。已 經(jīng)研究這些基因來吸引成纖維細(xì)胞并誘導(dǎo)它們分化成心肌細(xì)胞。然而，沒有通用的科學(xué)證 據(jù)來支持在軟骨再生中使用基因治療。實(shí)際上，心臟和關(guān)節(jié)環(huán)境完全不同。心肌細(xì)胞存在于 心臟組織中，其是有血管的并且準(zhǔn)備通向營養(yǎng)流和氧。另一方面，認(rèn)為軟骨無血管、無神經(jīng) 并且更少接近氧。出于這些原因，認(rèn)為兩個環(huán)境是截然不同的并且因此將需要不同的生物 方法來再生組織。
[0014] 本發(fā)明公開內(nèi)容提供了為了軟骨修復(fù)或再生領(lǐng)域中長期需要的解決方法。
[0015] 發(fā)明概述
[0016] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及軟骨細(xì)胞和軟骨型細(xì)胞的再生。在某些實(shí)施方案中，將一 個或多個基因用于軟骨細(xì)胞和軟骨型細(xì)胞的再生。在特定實(shí)施方案中，將一個或多個基因 治療方案用于軟骨細(xì)胞和軟骨型細(xì)胞的再生。在特定方面中，實(shí)施方案涉及軟骨修復(fù)，如關(guān) 節(jié)軟骨修復(fù)。更特別地，本公開內(nèi)容的實(shí)施方案涉及使用基因治療，用于軟骨細(xì)胞或其他軟 骨型細(xì)胞的吸引、產(chǎn)生和/或再生，和/或軟骨組織的產(chǎn)生和/或修復(fù)。在本公開內(nèi)容的具體 實(shí)施方案中，提供了能夠在體內(nèi)吸引和/或產(chǎn)生所需細(xì)胞的基因資料。在特定情況下，將基 因治療用于吸引成纖維細(xì)胞，所述成纖維細(xì)胞被直接或間接刺激分化成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì) 胞樣細(xì)胞或軟骨型細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，在將一種或多種基因治療組合物遞送至關(guān)節(jié) 時，關(guān)節(jié)中的成纖維細(xì)胞或關(guān)節(jié)中的其他類型的細(xì)胞存在于關(guān)節(jié)中，并且在遞送后，成纖維 細(xì)胞或一種或多種其他類型的細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞或軟骨樣細(xì)胞或軟骨型細(xì)胞。在一些情 況下，關(guān)節(jié)中的一種或多種基因治療組合物的遞送(如在關(guān)節(jié)中存在垂死軟骨細(xì)胞的情況 下)作為用于分化關(guān)節(jié)中的一種或多種類型的細(xì)胞再生軟骨細(xì)胞和/或軟骨型細(xì)胞或?qū)е?至少部分軟骨細(xì)胞具有的相同功能性的其他細(xì)胞的催化劑。在特定方面中，在關(guān)節(jié)中存在 垂死軟骨細(xì)胞的情況下，一種或多種基因治療組合物的遞送作為用于關(guān)節(jié)中結(jié)締組織再生 (包括軟骨組織的再生）的催化劑。在一些情況下，將來自垂死軟骨細(xì)胞的一個或多個分子 用于關(guān)節(jié)中的一種或多種類型的細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，并且這樣的分化可以利用或不利用 來自一個或多個基因治療組合物的基因產(chǎn)物。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及所有形式的軟骨以及 可以在一個位置形成并且如同它們是軟骨那樣起作用的任何其他細(xì)胞;在具體方面中，通 過本發(fā)明的方法產(chǎn)生疤痕組織。在其中產(chǎn)生疤痕組織的特定情況下，所述疤痕組織作為關(guān) 節(jié)中的襯墊。
[0017] 在一些情況下，通過一種或多種類型的已經(jīng)在體內(nèi)存在于關(guān)節(jié)中的細(xì)胞來吸收基 因治療組合物，盡管在其他情況下，通過遞送至關(guān)節(jié)和/或已經(jīng)存在于關(guān)節(jié)中的細(xì)胞來吸收 基因治療組合物。遞送至關(guān)節(jié)的細(xì)胞可以在遞送至關(guān)節(jié)前或遞送至關(guān)節(jié)后分化，并且可以 將基因治療組合物在細(xì)胞遞送至關(guān)節(jié)前或遞送至關(guān)節(jié)后暴露于遞送至關(guān)節(jié)的細(xì)胞。根據(jù)本 公開內(nèi)容，細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞可以以任何合適的方式發(fā)生，包括，例 如，在基因治療植入個體前細(xì)胞在體外分化或基因治療植入個體前體外分化并且還在植入 后在體內(nèi)分化。分化成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞氧細(xì)胞的細(xì)胞可以是任何特定的種類，但在具 體實(shí)施方案中，分化成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。在一些實(shí)施方案 中，將成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞、源自成纖維細(xì)胞的干細(xì)胞和/或間質(zhì)干細(xì)胞用于本發(fā) 明的任一種方法中。
[0018] 成纖維細(xì)胞可以在暴露于一種或多種基因治療組合物之前、之中和/或之后分化 成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。在特定方面中，將成纖維細(xì)胞在體內(nèi)遞送前在體內(nèi)或體外 暴露于機(jī)械應(yīng)力并且還暴露于一種或多種基因治療組合物。在其中基因治療組合物遞送至 關(guān)節(jié)的情況下，關(guān)節(jié)上的壓力可以作為機(jī)械應(yīng)力，以至少部分引起細(xì)胞(包括干細(xì)胞和/或 成纖維細(xì)胞)的分化。
[0019] 在本公開內(nèi)容的方面中，為了軟骨再生和/或修復(fù)的目的，產(chǎn)生軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì) 胞樣細(xì)胞或軟骨型。任何基因或基因的組合可以用于本公開內(nèi)容的目的。例如，C0L11A2,或 其他，可以用于軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，軟骨型細(xì)胞產(chǎn)生和/或軟骨再生和/或修復(fù)。在某些實(shí)施方案 中，將TGF-β和FGF-2用于軟骨再生中。在具體方面中，將C0L11A2、TGF-β和/或FGF-2用于從 周圍的成纖維細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生軟骨。在一些情況下，將本文中提及的其他基因用于本發(fā)明 的組合物和方法中。
[0020] 實(shí)施方案涉及某些基因，如膠原形成基因的治療遞送（如通過注射、靜脈內(nèi)治療 (IV)、口服攝入、血管放置，如血管造影術(shù)，乃至局部方法），包括使用或未用營養(yǎng)基質(zhì)和/或 血管。更具體地，但不是排他地，實(shí)施方案涉及使用軟骨形成基因和/或?qū)⑽車衫w維 細(xì)胞開始軟骨修復(fù)的基因混合物的遞送來用于軟骨生物修復(fù)的方法和/或組合物。在特定 實(shí)施方案中，這種治療作為用于軟骨恢復(fù)的體內(nèi)工作站。在特定方面中，存在體外啟動的軟 骨產(chǎn)生，如通過使用自體軟骨細(xì)胞和/或同種異體軟骨細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞，如真皮成纖 維細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，這種混合物可以遞送(如通過注射)至一個或多個關(guān)節(jié)中或一 個或多個關(guān)節(jié)的附近，并且這將吸引其他非捕獲的成纖維細(xì)胞(例如)至軟骨再生過程中。 在某些實(shí)施方案中，可以引入基質(zhì)或支架，然后在體外或體內(nèi)接種基因治療組合物、成纖維 細(xì)胞和/或軟骨細(xì)胞，以給軟骨再生過程提供結(jié)構(gòu)。
[0021] 在公開內(nèi)容的方面中，幫助軟骨產(chǎn)生的基因的引入吸引正經(jīng)受退化的軟骨區(qū)域中 的成纖維細(xì)胞或其他合適的細(xì)胞來分化成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞，用于補(bǔ)充和/或停 止軟骨退化的目的。因?yàn)檐浌峭ǔ＞哂械脱骱徒咏鼱I養(yǎng)素，認(rèn)為是體內(nèi)難以再生的組織。 為此，在一些方面中，可以將除了基因以外的其他元素加入治療基因組合物中。例如，適用 于關(guān)節(jié)活動的調(diào)節(jié)元素可以用于本發(fā)明中。在某些方面中，組合物包含營養(yǎng)素，并且在特定 方面中，組合物A具有包含氧和/或營養(yǎng)素的可吸收存儲器。在具體方面中，蛋白質(zhì)/氨基酸、 磷酸鹽、鈣、鈉、脂質(zhì)、鐵、糖/淀粉，和/或維生素可以用于本發(fā)明的一個或多個方法中。
[0022] 在特定實(shí)施方案中，基因治療組合物包含表達(dá)載體。可以使用任何合適的表達(dá)載 體，但在一些情況下，表達(dá)載體適用于關(guān)節(jié)中活動，包括無血管、無神經(jīng)和/或低氧環(huán)境。在 具體情況下，表達(dá)載體包含在無血管、無神經(jīng)和/或低氧環(huán)境中有活性的啟動子。
[0023]之前已經(jīng)相當(dāng)寬泛地列出了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，以便可以更好地理解以下 的本發(fā)明的詳述。下文中將描述本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)，其形成本發(fā)明權(quán)利要求的主題。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解所公開的概念和特定實(shí)施方案可以容易地用作改變或設(shè)計(jì)用于 實(shí)施本發(fā)明相同目的的其他結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到這樣的等價構(gòu)造沒 有脫離所附權(quán)利要求列出的本發(fā)明的精神和范圍。當(dāng)結(jié)合附圖考慮時，從以下描述將更好 地理解認(rèn)為是本發(fā)明特征性的新特征，關(guān)于其組織或操作方法，與更多目的和優(yōu)點(diǎn)一起。然 而，特別理解提供每張附圖只是用于說明和描述的目的，并不是打算作為本發(fā)明的限制。本 申請涉及各種參考文獻(xiàn)和文件，將其全部按引用并入本文中。
[0024]發(fā)明詳述
[0025]如說明書中使用的，"一個(a)"或"一個(an)"可以表示一個或多個。如權(quán)利要求中 使用的，結(jié)合詞語"包含"使用時，詞語"一個(a)"或"一個(an)"可以表示一個或超過一個。 如本文中使用的，"另一個"表示至少第二個或更多個。在特定實(shí)施方案中，例如，本發(fā)明的 方面可以"基本上由本發(fā)明的一個或多個序列組成"或"由本發(fā)明的一個或多個序列組成"。 本發(fā)明的一些實(shí)施方案可以由本發(fā)明的一個或多個元素、方法步驟和/或方法組成，或基本 上由本發(fā)明的一個或多個元素、方法步驟和/或方法組成。考慮本文中所述的任何方法或組 合物可以相對于本文中所述的任何其他方法或組合物來實(shí)施。
[0026] I.定義
[0027] 如本文中使用的術(shù)語"軟骨型細(xì)胞"是指可以存在并以軟骨細(xì)胞相同的能力起作 用的任何細(xì)胞。
[0028] 如本文中使用的術(shù)語"軟骨樣細(xì)胞"是指不是初級軟骨細(xì)胞但源自干細(xì)胞(如間質(zhì) 干細(xì)胞)的細(xì)胞或來自其他世系（如成纖維細(xì)胞)的細(xì)胞。軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞(軟 骨的細(xì)胞）的表現(xiàn)型。這表示它們不僅具有軟骨細(xì)胞的形態(tài)（例如，多邊形和/或偏菱形細(xì) 胞），而且在某些情況下，至少它們能夠聚集和產(chǎn)生軟骨基質(zhì)成分，如，例如，硫酸化蛋白聚 糖和II型膠原。因此，軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的示例性標(biāo)記包括例如軟骨蛋白聚糖(aggrecan)(其 是硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素蛋白聚糖）、II型膠原、Sox-9蛋白、軟骨連接蛋白和基底膜聚糖 (per lecan)(其是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）中的一種或多種。
[0029]如本文中使用的術(shù)語"缺氧"是指氧不足。在具體方面中，是指低于約20%的氧張 力。
[0030]如本文中使用的術(shù)語"關(guān)節(jié)"是指其中骨骼的兩塊骨連接的身體區(qū)域。
[0031]如本文中使用的術(shù)語"再生"限定為恢復(fù)受損關(guān)節(jié)軟骨正常功能的過程，并且在至 少某些情況下，還導(dǎo)致與天然軟骨不可區(qū)分的新組織的形成。
[0032] 如本文中使用的術(shù)語"接種"是指將細(xì)胞植入支架中。細(xì)胞將粘附于支架，并且隨 后在支架中生長和分化。
[0033] 如本文中使用的，術(shù)語"支架"是在其上將形成細(xì)胞基質(zhì)的機(jī)械裝置。
[0034] 如本文中使用的，術(shù)語"基質(zhì)"將隨后提供強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)的幾何形狀。
[0035] II. 一般性實(shí)施方案
[0036] 本發(fā)明涉及用于治療需要的個體的系統(tǒng)、方法和組合物，包括需要軟骨修復(fù)的個 體的治療。本發(fā)明涉及用于任何種類的軟骨的生物修復(fù)的方法和組合物，例如，包括椎骨間 軟骨和關(guān)節(jié)軟骨。在特定方面中，本發(fā)明涉及軟骨修復(fù)的領(lǐng)域，如關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)。
[0037] 在某些方面中，例如，本發(fā)明在體內(nèi)（或在體外或在體外和體內(nèi)）如從成纖維細(xì)胞 產(chǎn)生天然組織。更特別地，但不是排他地，例如，本發(fā)明涉及一種用于人成纖維細(xì)胞生長并 分化成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的方法。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是自體的或同種異體的 或其混合物。
[0038]在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明使用特定細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。在特定實(shí)施方 案中，人真皮成纖維細(xì)胞(HDF)，例如，在使用一個或多個基因的基因治療的特定條件下分 化成軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞。細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞可以以任何合適的方式來進(jìn) 行，包括植入后在體內(nèi)分化或使用天然存在的細(xì)胞(包括成纖維細(xì)胞)在體內(nèi)分化。
[0039] 在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于體內(nèi)關(guān)節(jié)再生的方法，所述關(guān)節(jié)如椎 間盤、肘關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、顳下頌關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、跖骨、掌骨等。
[0040] 本發(fā)明公開內(nèi)容的示例性目的是提供一種修復(fù)關(guān)節(jié)(如退化的椎間盤)的方法，例 如，恢復(fù)椎間盤解剖組織構(gòu)造并提高其功能。在本發(fā)明的特定方面中，存在修復(fù)個體關(guān)節(jié) (如椎間盤）中受損軟骨的方法，包括使接受根據(jù)本發(fā)明的基因治療的成纖維細(xì)胞遞送至個 體的接受關(guān)節(jié)(如椎間盤)或在體內(nèi)提供使用基因治療的成纖維細(xì)胞或其他細(xì)胞(包括垂死 的軟骨細(xì)胞）。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，將基因治療組合物或成纖維細(xì)胞和基因治療組 合物遞送至關(guān)節(jié);在用于椎間盤的具體實(shí)施方案中，在不存在除去部分或全部退化椎間盤 的情況下，遞送基因治療組合物或成纖維細(xì)胞和基因治療組合物。
[0041] 在本發(fā)明的某些方面中，除了本發(fā)明的方法，給個體提供另一種治療。例如，在基 因治療組合物或基因治療組合物和成纖維細(xì)胞遞送之前、之中和/或之后，個體可以接受一 種或多種藥物。示例性的另外的治療按照需要包括抗生素