血紅素在抗流感病毒中的應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了血紅素及其衍生物在制備用于預防和/或治療流感病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的藥物中的用途。本發(fā)明通過大量離體、在體實驗證明，血紅素能夠顯著抑制流感病毒的復制；而且，血紅素能夠提高流感病毒感染后的生存率，緩解流感病毒感染導致的體重降低，減輕流感病毒感染導致的肺組織結構破壞；此外，血紅素還能降低流感病毒感染后導致的機體免疫反應紊亂，包括降低病毒感染后升高的炎性因子水平，并能逆轉流感病毒感染導致的外周血淋巴細胞減少。
【專利說明】
血紅素在抗流感病毒中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及抗病毒藥物領域，具體地，涉及血紅素及其衍生物在制備用于預防和/ 或治療流感病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 流行性感冒簡稱流感，是由流感病毒引起的呼吸道疾病，每年在世界范圍內季節(jié) 性流行。
[0003] 流感病毒傳染性強、發(fā)病率高，除了引起普通感冒癥狀，還能引起重癥肺炎和細菌 感染等并發(fā)癥，嚴重威脅公眾健康。流感病毒有3個血清型，其中甲型流感病毒經常發(fā)生基 因變異與重排，引起多次世界大流行。甲型流感病毒的包膜上均鑲嵌3種由病毒基因編碼的 糖蛋白突觸，分別為血凝素(Hemagglutinin，HA)、神經氨酸酶(Neuraminidase，NA)和M2離 子通道蛋白（M2protein ion channel)。
[0004] 目前，食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的抗流感藥物有達菲(Tami f 1 u，磷酸奧司他 韋），樂感清(Relenza，扎那米韋）和帕拉米韋(Rapivab)，以上藥物均為NA抑制劑。之前常用 的藥物金剛烷胺和金剛乙胺，是M2離子通道蛋白抑制劑，被批準用于治療和預防甲型流感， 但流感病毒已對其產生了耐藥性。
[0005] 此外，上述藥物均為通過抑制流感病毒早期復制發(fā)揮療效，在病毒感染48小時以 內最為有效。然而流感病毒往往引起細胞因子風暴，這種機體過度的免疫應答反應則造成 流感病毒感染者出現嚴重癥狀甚至死亡。
[0006] 因此，仍然需要開發(fā)新的抗流感藥物，同時，期望開發(fā)出不僅能在流感病毒感染早 期發(fā)揮療效而且還能在晚期減輕流感病毒感染導致的機體損傷的抗流感藥物。

【發(fā)明內容】

[0007] 基于上述目的，本發(fā)明提供血紅素及其衍生物在制備用于預防和/或治療流感病 毒引起的疾病及其并發(fā)癥的藥物中的用途，其中所述衍生物在體內可以轉化為血紅素，優(yōu) 選地，所述衍生物的基礎結構為：四個吡咯類亞基組成一個環(huán)，環(huán)中心為一個亞鐵離子或鐵 離子。
[0008] 優(yōu)選地，所述衍生物為在所述基礎結構上添加一種或多種化學基團而來;優(yōu)選地， 所述衍生物為對所述基礎結構進行化學上可接受的改造而來，優(yōu)選地，所述化學上可接受 的改造為對所述基礎結構進行一個或多個組成元素的替換、或元素間化學鍵的改造;優(yōu)選 地，所述衍生物為在所述基礎結構上添加一種或多種化學基團并同時對所述基礎結構進行 化學上可接受的改造而來;優(yōu)選地，所述化學上可接受的改造為對所述基礎結構進行一個 或多個組成元素的替換、或元素間化學鍵的改造。
[0009] 優(yōu)選地，所述藥物用于抑制流感病毒復制和/或減輕流感病毒感染導致的機體損 傷。
[0010] 優(yōu)選地，所述藥物用于緩解流感病毒感染導致的體重降低。
[0011] 優(yōu)選地，所述藥物用于提高流感病毒感染后的生存率。
[0012] 優(yōu)選地，所述藥物用于減輕流感病毒感染導致的肺組織結構破壞。
[0013] 優(yōu)選地，所述藥物用于降低流感病毒感染導致的機體免疫反應紊亂，優(yōu)選地，所述 藥物用于降低流感病毒感染后升高的炎性因子水平和/或逆轉流感病毒感染導致的外周血 淋巴細胞減少。
[0014] 優(yōu)選地，所述流感病毒是甲型流感病毒。
[0015] 優(yōu)選地，所述藥物包含藥學上可接受的輔料，優(yōu)選地，所述藥物包含載體或賦形 劑。
[0016] 本發(fā)明還提供一種用于預防和/或治療流感病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的藥物組 合物，其包含以上實施方案任一項中的藥物以及其他抗病毒藥物，優(yōu)選地，其包含達菲。
[0017] 本發(fā)明通過體外細胞實驗和大量基于小鼠的體內實驗發(fā)現，血紅素能夠顯著抑制 流感病毒對肺泡上皮細胞系A549細胞的感染;血紅素能夠緩解流感病毒感染導致的體重降 低，提高流感病毒感染后的生存率，減輕流感病毒感染導致的肺組織結構破壞，減少滲出等 炎性病變，降低肺泡灌洗液(BALF)和肺組織中炎性因子的水平，并能逆轉流感病毒感染導 致的外周血淋巴細胞的減少。因此，血紅素能夠用于制備用于預防和/或治療流感病毒引起 的疾病及其并發(fā)癥的藥物。
[0018]此外，根據本發(fā)明，本領域的技術人員能夠認識到，任何在體內可以轉化為血紅素 的血紅素衍生物均可用于本發(fā)明的用途。本發(fā)明公開并要求保護任何在體內可以轉化為血 紅素的血紅素衍生物在制備用于預防和/或治療流感病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的藥物中 的用途。
【附圖說明】
[0019] 圖1為血紅素抑制流感病毒對體外細胞的感染的結果示意圖。
[0020] 圖2為血紅素對流感病毒感染小鼠的治療實驗的結果示意圖（*p〈0.05, * *p〈 0.01，* * *p〈0.001)，A圖為體重變化圖，B圖為生存率變化圖。
[0021] 圖3為血紅素對流感病毒感染小鼠的拯救實驗的結果示意圖* *p〈0.001)，A 圖為體重變化圖，B圖為生存率變化圖。
[0022] 圖4為達菲單獨給藥或聯合血紅素給藥時流感病毒感染小鼠的生存率變化圖。 [0023]圖5為血紅素給藥與否對小鼠肺組織病理變化影響的對比圖。
[0024] 圖6為血紅素給藥與否對小鼠肺泡灌洗液中炎性因子MCP-1表達量影響的對比圖。
[0025] 圖7為血紅素給藥與否對小鼠肺組織勻漿中炎性因子TNF-a表達量影響的對比圖。 [0026]圖8為血紅素給藥與否對小鼠外周血淋巴細胞數目影響的對比圖。
【具體實施方式】
[0027] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0028] 若非特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技 術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0029]以下實施例中采用的流感病毒毒株為A/PR/8/34(甲型流感病毒H1N1亞型，簡稱 PR8)毒株。
[0030]細胞傳代培養(yǎng)基：培養(yǎng)基DMEM，含1 %青鏈霉素（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司產 品），10 %胎牛血清(Hy Cl one公司產品）。
[0031] 細胞凍存液:90%胎牛血清與10%二甲亞砜(DMS0)。
[0032]病毒培養(yǎng)方法:常規(guī)雞胚接種法，初始接種量100微升。
[0033] 病毒孵育液:培養(yǎng)基Opti-MEM(Gibco公司），含1 %青鏈霉素，0.5微克/毫升的TPCK 胰酶(Sigma公司產品）。
[0034] 病毒維持液:DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司），含1%青鏈霉素，0.5微克/毫升的TPCK 胰酶，0.5 %胎牛血清。
[0035]實施例1中采用的人肺泡上皮細胞系A549細胞購自ATCC，由本實驗室傳代保存。 [0036]傳代方法：以T75細胞培養(yǎng)瓶為例，A549細胞生長形成單層后，棄培養(yǎng)基，用DPBS溶 液(Gibco公司產品）洗一次，使用0.05%濃度的胰酶(HyClone公司產品）37°C消化3分鐘，棄 去胰酶，加入10毫升傳代培養(yǎng)基中和，吸管吹打成單細胞懸液后以1:3比例分瓶傳代。
[0037] 凍存方法:凍存液為含10%DMS0的胎牛血清。以T75細胞培養(yǎng)瓶為例，A549細胞生 長形成單層后，棄培養(yǎng)基，用DPBS溶液洗一次，使用0.05 %濃度的胰酶37°C消化3分鐘，棄去 胰酶，加入10毫升傳代培養(yǎng)基中和，吸管吹打成單細胞懸液，細胞計數后，1000轉/分鐘離心 5分鐘，棄上清，適量細胞凍存液重懸使細胞濃度為3 X 106/毫升，1毫升/支分裝入凍存管， 標記細胞信息后裝入凍存盒，_80°C過夜，次日轉入液氮保存。
[0038] 實施例2至6中采用的實驗小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，為5周齡、體重 16± 2克的無特定病原體級（SPF級）雌性BALB/c小鼠，動物實驗均在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實 驗動物研究所的動物生物安全二級(ABSL-2)實驗室開展。
[0039] 實施例中選用一種市售血紅素產品--Hemin(Frontier Scientific公司產品） 進行實驗。將該血紅素產品用〇. 2M NaOH溶液溶解后，用0.2N HC1溶液調整PH至中性，以此 為母液，使用PBS稀釋至相應濃度工作液，0.22mi濾膜過濾除菌，分裝后-80°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0040] 實施例1:血紅素的體外抗流感病毒實驗 [0041 ]實驗方法
[0042] 1)病毒感染:96孔板每孔接種1 X 104個A549細胞，在37°C下于5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 過夜至70 %匯合率，棄細胞培養(yǎng)液，用病毒孵育液洗細胞層一次，接種用孵育液稀釋好的病 毒液50yl，使感染復數(M0I) = 1，設置無病毒感染對照孔，各4平行孔，在37°C下于5 %0)2培 養(yǎng)箱中孵育90分鐘，棄去病毒液，換維持液50yl繼續(xù)培養(yǎng)24小時。其后加入50yl含血紅素的 維持液，使血紅素終濃度分別為0、0.0625、0.125、0.25、0.5和1虛，在37°(3下于5%〇) 2培養(yǎng) 箱中繼續(xù)培養(yǎng)72小時。
[0043] 2)免疫熒光檢測：
[0044] 本檢測中所需溶液配制方法如下：
[0045] 磷酸鹽緩沖液(PBS):以1升溶液為例，800毫升去離子水中加入氯化鈉8克，氯化鉀 〇. 2克，十二水磷酸氫二鈉3.58克，磷酸二氫鉀0.24克，充分溶解后調整pH值為7.4，補水至1 升，充分混勾；
[0046] 打孔液:含0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（THt〇n?X-100，AmreSC〇公司產品）的roS 溶液；
[0047] PBST:含0 ? 1 % 吐溫-20( Tween?20，Amresco 公司產品）的 PBS 溶液；
[0048] 一抗工作液：5%BSA/PBST配制，抗流感病毒核蛋白（NP蛋白）的單克隆抗體 (Millipore)；
[0049] 二抗工作液:5 %BSA/PBST配制，含山羊抗小鼠IgG/Alexa Fhior? 488(中杉金橋， 1:400稀釋），熒光染料Hoechst 33342 (碧云天生物技術)終濃度0. lμg/ml。
[0050] 上述96孔板棄掉細胞上清，加入200yl 4%多聚甲醛(博士德生物）固定細胞單層 20分鐘。棄固定液，用200yl PBS洗細胞單層2次，5分鐘/次。棄ros，加入200yl打孔液，在室 溫下放置10分鐘。棄液，用200yl PBS洗細胞單層3次，5分鐘/次。每孔加入50yl含5 %牛血清 白蛋白（BSA，羅氏Roche735108)的PBST(5%BSA/PBST)，室溫下搖床孵育90分鐘進行封閉。 封閉結束后，棄上清，每孔加入30yl-抗工作液，室溫下搖床孵育120分鐘。細胞單層用250y 1 TOST洗4次，15分鐘/次。每孔加入50yl二抗工作液，室溫避光搖床孵育30分鐘，避光下用 250yl PBST洗15分鐘，250yl PBS洗10分鐘。加入100yl PBS，用倒置熒光顯微鏡（7S100， Nikon)觀察。
[0051 ] 3)分析并計算：使用高內涵篩選系統(tǒng)（Operetta?，PerkinElmer公司）分析上述 96孔板，系統(tǒng)自帶軟件分析計算熒光陽性細胞數。重復實驗三次。
[0052]圖1是根據計算結果繪制的血紅素抑制流感病毒對體外細胞的感染的結果示意 圖。
[0053]如圖1所示，血紅素能夠抑制流感病毒對體外細胞的感染;隨著血紅素給藥濃度提 高(0.0625、0.125、0.25、0.5和1虛/1)，被流感病毒感染的熒光陽性細胞數逐漸減少，具有 劑量依賴性;相比不添加血紅素，在劑量lyM的血紅素作用下，被流感病毒感染的細胞數減 少約60 %。
[0054] 實施例2:血紅素對流感病毒感染小鼠的治療實驗
[0055] 實施例中"治療"的含義:感染病毒后第1天至第3天給藥。
[0056] 從小鼠被流感病毒感染后的第1天開始，連續(xù)3天給予血紅素，并連續(xù)測量血紅素 對小鼠體重和生存率的影響，以評價血紅素對病毒感染早期的小鼠的治療效果。
[0057]實驗方法
[0058] 1)分組:將實驗小鼠隨機分籠，設PR8組（即對照組，用PR8感染小鼠，用PBS代替血 紅素）、PR8+血紅素9組（即血紅素的給藥濃度為9mg/kg/d)、PR8+血紅素3組（即血紅素的給 藥濃度為3mg/kg/d)、PR8+血紅素1組（即血紅素的給藥濃度為lmg/kg/d)、PR8+血紅素0.3組 (即血紅素的給藥濃度為0.3mg/kg/d)和PR8+血紅素0.1組（即血紅素的給藥濃度為0. lmg/ kg/d)，每組14只小鼠。
[0059] 2)感染與給藥:將小鼠用1%戊巴比妥鈉(生理鹽水配制，0.22微米濾膜過濾除菌） 腹腔注射麻醉后，滴鼻感染，感染劑量為300PFU/只小鼠。在感染后第1天開始對小鼠尾靜脈 注射150yl相應劑量的血紅素，連續(xù)給藥3天，一天兩次，對照組給予尾靜脈注射PBS。實驗周 期12天，記錄體重（電子天平，賽多利斯)和生存率(存活小鼠數量/初始小鼠總數X 100%) 變化。
[0060]圖2為血紅素對流感病毒感染小鼠的治療實驗的結果示意圖，A圖為體重變化圖，B 圖為生存率變化圖。表1為治療方案中小鼠的體重變化結果，表2為治療方案中小鼠的生存 率結果。實驗結果證明血紅素對流感病毒感染的小鼠具有治療作用。
[0061]如圖2-A和表1所示，血紅素能夠緩解流感病毒感染小鼠體重的下降程度;從實驗 的第4天開始，雖然已停止給予血紅素，但接受過血紅素的感染小鼠的體重下降程度仍然持 續(xù)低于PR8組小鼠；到實驗的第6天時，PR8組小鼠的體重下降31.14%，而接受0. lmg/kg/d給 藥劑量的小鼠的體重僅下降18.51 % (p = 0.0066)。
[0062]表1:治療實驗中小鼠的體重變化百分比（平均值土標準差）。
[0064]如圖2-B和表2所示，血紅素能夠提高流感病毒感染小鼠的生存率;從實驗的第4天 開始，雖然已停止給予血紅素，但接受過血紅素的感染小鼠的生存率仍然持續(xù)高于PR8組小 鼠；在實驗的第12天時，PR8組小鼠已全部死亡(生存率為0% )，而接受0. lmg/kg/d給藥劑量 的小鼠的生存率卻達到57.14%。
[0065]表2:治療實驗中小鼠的生存率（％ )。

[0068] 實施例3:血紅素對流感病毒感染小鼠的拯救實驗
[0069] 實施例中"拯救"的含義:感染病毒后第4天至第6天給藥。
[0070] 從小鼠被流感病毒感染后的第4天開始，連續(xù)3天給予血紅素，測量血紅素對小鼠 的體重和生存率的影響，以評價血紅素對延誤治療的感染小鼠的拯救效果。
[0071 ]實驗方法
[0072] 1)分組:將實驗小鼠隨機分籠，設PR8組（同實施例2)、PR8+血紅素3組（即血紅素的 給藥濃度為3mg/kg/d)、PR8+血紅素1組（即血紅素的給藥濃度為lmg/kg/d)、PR8+血紅素0.3 組（即血紅素的給藥濃度為0.3mg/kg/d)、PR8+血紅素0.1組（即血紅素的給藥濃度為0. lmg/ kg/d)和PR8+血紅素0.03組（即血紅素的給藥濃度為0.03mg/kg/d)，每組14只小鼠。
[0073] 2)感染與給藥:將小鼠用1 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，滴鼻感染，感染劑量為 300PFU/只小鼠。在感染后第4天開始對小鼠尾靜脈注射150iU相應劑量的血紅素，連續(xù)給藥 3天，一天兩次，對照組給予尾靜脈注射PBS。實驗周期12天，記錄體重和生存率變化。
[0074] 圖3為血紅素對流感病毒感染小鼠的拯救實驗的結果示意圖，A圖為體重變化圖，B 圖為生存率變化圖。表3為拯救方案中小鼠的體重變化結果，表4為拯救方案中小鼠的生存 率結果。實驗結果證明血紅素對流感病毒感染后延誤治療的小鼠具有拯救作用。
[0075] 如圖3-A和表3所示，盡管從病毒感染后的第4天才開始給藥，但血紅素仍然能夠起 到緩解小鼠體重下降的作用；到實驗的第6天時，PR8組小鼠的體重下降31.14%，而接受 0 ? lmg/kg/d給藥劑量的小鼠的體重僅下降19 ? 59% (p = 0 ? 0002)。
[0076]表3:拯救實驗中小鼠的體重變化百分比（平均值土標準差）。
[0077]
[0078]如圖3-B和表4所示，盡管從病毒感染后的第4天才開始給藥，但血紅素仍然能夠起 到提高小鼠生存率的作用；在實驗的第12天時，PR8組小鼠已全部死亡(生存率為0%)，而接 受0. lmg/kg/d給藥劑量的小鼠的生存率卻達到36%。
[0079]表4:拯救實驗中小鼠的生存率（％ )。
[0082]實施例4:血紅素與達菲聯合用藥對流感病毒感染小鼠的治療效果 [0083]實驗方法
[0084] 1)分組:將實驗小鼠隨機分籠，設PR8組（同實施例2)、PR8+達菲5組（即達菲單獨給 藥，給藥濃度為5mg/kg/d)和PR8+達菲5+血紅素0.1組（即達菲和血紅素聯合給藥，給藥濃度 分別為5mg/kg/d和0? lmg/kg/d)，每組14只小鼠。
[0085] 2)感染與給藥:將小鼠用1 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，滴鼻感染，感染劑量為 300PFU/只小鼠。從感染后第1天開始對小鼠進行治療，通過尾靜脈注射（150iU)的方式給予 相應劑量的血紅素，通過灌胃（l〇〇yl)的方式給予相應劑量的達菲水溶液，連續(xù)給藥3天，一 天兩次，PR8組用PBS代替血紅素，用純水代替達菲水溶液。記錄生存率變化。
[0086] 圖4為達菲單獨給藥或聯合血紅素給藥時流感病毒感染小鼠的生存率變化圖。
[0087] 如圖4所示，將達菲與血紅素聯合給藥，相比單獨給予達菲，可以提高小鼠流感病 毒攻擊后的生存率，說明同時給予血紅素可以提高達菲對抗流感病毒感染的效果。
[0088] 實施例5:血紅素對小鼠肺損傷的影響
[0089]通過觀察在流感病毒感染并給予血紅素拯救性給藥后小鼠的肺組織病理切片，評 價血紅素的使用對流感病毒感染導致的肺部病理損傷的影響。
[0090] 實驗方法
[0091] 1)分組：將實驗小鼠隨機分籠，設PR8組（同實施例2,即圖5中標注的血紅素（一） 組）、PR8+0 ? lmg/kg/d血紅素組（即圖5中標注的血紅素(+)組）。
[0092] 2)感染與給藥:將小鼠用1 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，滴鼻感染，感染劑量為 300PFU/只小鼠。小鼠在感染后第4天開始尾靜脈注射150yl相應劑量的血紅素，連續(xù)給藥3 天，一天兩次，對照組用PBS代替血紅素。
[0093] 3)取材:感染后第7天斷頸處死小鼠，心臟灌流去除血液，摘取肺臟，置4%多聚甲 醛中固定。常規(guī)方法制作石蠟切片，并進行蘇木精-伊紅染色(HE染色）。
[0094] 4)使用正置顯微鏡(Nikon 80i)觀察并用軟件(Nikon ACT-lVersion2.63)拍照：
[0095]圖5為血紅素給藥與否對小鼠肺組織病理變化影響的對比圖。
[0096] 從圖5中可見，血紅素一方面可以降低流感病毒感染對肺組織尤其是肺泡的損傷 和結構破壞（圖5右上圖箭頭所指為肺大泡，觀察到未接受血紅素的PR8組小鼠的肺泡結構 被破壞），另一方面可以減少肺泡腔中的炎性滲出液（圖5右下圖箭頭所指為觀察到未接受 血紅素的PR8組小鼠肺泡腔中出現炎性滲出液）。這說明血紅素的使用可以一定程度上降低 流感病毒感染導致的肺部病理損傷。
[0097] 實施例6:血紅素對炎性細胞因子表達水平的影響 [0098]實施例中涉及到的CBA法信息如下：
[0099] 實施流式細胞微球分析技術(Cytometric Bead Array，CBA)采用BD公司的CBA小 鼠炎性細胞因子試劑盒(CBA Mouse Inflammatory Cytokines Kit)，具體操作步驟嚴格按 照試劑盒說明書規(guī)程，檢測使用流式分析儀(型號為Canton，BD公司產品）。
[0100] 實施例中涉及到的BCA檢測蛋白濃度方法如下：
[0101] 使用Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo Scientific產品）檢測樣本蛋白濃 度，樣本用1微升，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書操作，使用酶標儀(SpectraMax?M5， 美國Molecular Devices公司產品）在562nm波長下檢測。
[0102]在流感病毒感染并給予血紅素拯救性給藥后，分別檢測小鼠肺泡灌洗液(BALF)和 肺組織勻漿中各炎性細胞因子的表達量，以評價血紅素對炎性細胞因子表達水平的影響。
[0103] 分組:將實驗小鼠隨機分籠，設空白對照組(不進行流感病毒感染，用PBS代替血紅 素）、血紅素組(不進行流感病毒感染，但給予血紅素）、流感病毒組（同實施例2中的PR8組）、 流感病毒+血紅素組(PR8+0 ? lmg/kg/d血紅素組）。
[0104] 感染與給藥：將小鼠用1 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，滴鼻感染，感染劑量為 300PFU/只小鼠。小鼠在感染后第4天開始尾靜脈注射150yl相應劑量的血紅素，連續(xù)給藥3 天，一天兩次。
[0105] 感染后第7天，對每組5只小鼠進行如下取材操作：
[0106] BALF:將lml PBS灌入氣管，反復沖洗3次，吸出灌洗液；
[0107] 肺組織：用PBS心臟灌流去血，取肺組織在-80°C下凍存，其后用勻漿器制肺組織勻 漿。
[0108] 將獲得的BALF在lOOOrpm離心5分鐘后取50yl上清，使用CBA法檢測BALF中腫瘤壞 死因子-a(TNF-a)、單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1)、白介素-12(IL-12P70)、白介素-6(IL-6)、 白介素-l〇(IL-10)和干擾素 -y (IFN-y )的表達量(皮克/毫升）。本實驗結果表明，流感病 毒感染可引起B(yǎng)ALF中一系列炎性細胞因子表達水平的提高，即引發(fā)細胞因子風暴，而給予 血紅素可降低炎性細胞因子的表達水平，產生對抗細胞因子風暴的作用，以MCP-1為例，從 圖6可看出，給予血紅素可顯著降低流感病毒感染小鼠的BALF中MCP-1的表達水平。
[0109]將獲得的肺組織勻漿在5000rpm下離心10分鐘后取勻漿上清，1微升用于BCA法檢 測總蛋白量，取50y 1使用CBA法檢測肺組織中TNF-a、MCP-1、IL-12、IL-6、IL-10和IFN- y的 表達量，并通過總蛋白量計算獲得每mg蛋白中細胞因子的含量(皮克/毫克蛋白）。實驗結果 表明，流感病毒感染可引起肺組織中一系列炎性細胞因子表達水平的提高，即引發(fā)細胞因 子風暴，而給予血紅素可降低炎性細胞因子的表達水平，產生對抗細胞因子風暴的作用，以 TNF-a為例，從圖7可看出，給予血紅素可顯著降低流感病毒感染小鼠的肺組織中TNF-a的表 達水平。
[0110] 綜上可得，血紅素對流感病毒感染引發(fā)的肺臟細胞因子風暴具有一定程度的抑制 作用。
[0111] 實施例7:血紅素對免疫細胞的影響
[0112] 在流感病毒感染并給予血紅素拯救性給藥后，用流式細胞儀檢測小鼠外周血中的 T細胞比例，以評價血紅素對免疫細胞的影響。
[0113] 動物分組和感染與給藥同實施例6。感染后第7天，每組處理5只小鼠。
[0114] 經眼眶取血50yl，加入含乙二胺四乙酸（￡01六，0.511，11^1讓(^61^)的離心管（￡? 管）中，及時充分混勻制得抗凝血。取20yl檢測⑶3+陽性T細胞總數、⑶4+T細胞數、⑶4+⑶25 +Treg細胞數和⑶8+T細胞數的變化。
[0115]圖8為血紅素給藥與否對小鼠外周血淋巴細胞數目影響的對比圖。
[0116]如圖8所示，流感病毒感染后，外周血淋巴細胞的數量受到嚴重抑制，而血紅素能 夠逆轉這一趨勢。這說明血紅素對機體免疫環(huán)境具有一定的保護作用。
[0117]以上實施例通過實驗證明血紅素能夠在早期抑制流感病毒復制和/或在晚期減輕 流感病毒感染導致的機體損傷，能夠緩解流感病毒感染導致的體重降低，提高流感病毒感 染后的生存率，減輕流感病毒感染導致的肺組織結構破壞，減少滲出等炎性病變，降低BALF 和肺組織中炎性因子的水平，并能逆轉流感病毒感染導致的外周血淋巴細胞的減少。
[0118]雖然，上文中已經用一般性說明及【具體實施方式】對本發(fā)明作了詳細的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 血紅素及其衍生物在制備用于預防和/或治療流感病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的藥 物中的用途，其中所述衍生物在體內可以轉化為血紅素，優(yōu)選地，所述衍生物的基礎結構 為：四個吡咯類亞基組成一個環(huán)，環(huán)中心為一個亞鐵離子或鐵離子。2. 權利要求1的用途，其特征在于，所述衍生物為在所述基礎結構上添加一種或多種化 學基團而來；優(yōu)選地，所述衍生物為對所述基礎結構進行化學上可接受的改造而來，優(yōu)選 地，所述化學上可接受的改造為對所述基礎結構進行一個或多個組成元素的替換、或元素 間化學鍵的改造;優(yōu)選地，所述衍生物為在所述基礎結構上添加一種或多種化學基團并同 時對所述基礎結構進行化學上可接受的改造而來;優(yōu)選地，所述化學上可接受的改造為對 所述基礎結構進行一個或多個組成元素的替換、或元素間化學鍵的改造。3. 權利要求1或2的用途，其特征在于，所述藥物用于抑制流感病毒復制和/或減輕流感 病毒感染導致的機體損傷。4. 權利要求1或2的用途，其特征在于，所述藥物用于緩解流感病毒感染導致的體重降 低。5. 權利要求1或2的用途，其特征在于，所述藥物用于提高流感病毒感染后的生存率。6. 權利要求1或2的用途，其特征在于，所述藥物用于減輕流感病毒感染導致的肺組織 結構破壞。7. 權利要求1或2的用途，其特征在于，所述藥物用于降低流感病毒感染導致的機體免 疫反應紊亂，優(yōu)選地，所述藥物用于降低流感病毒感染后升高的炎性因子水平和/或逆轉流 感病毒感染導致的外周血淋巴細胞減少。8. 權利要求1或2的用途，其特征在于所述流感病毒是甲型流感病毒。9. 權利要求1或2的用途，其特征在于，所述藥物包含藥學上可接受的輔料，優(yōu)選地，所 述藥物包含載體或賦形劑。10. -種用于預防和/或治療流感病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的藥物組合物，其包含權 利要求1-2或9中任一項所述的藥物和其他抗病毒藥物，優(yōu)選地，其包含達菲。
【文檔編號】A61K31/215GK105854004SQ201610292983
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】王健偉, 鐘輝, 王聰慧
【申請人】中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所