Tnfr1/map4k4/arp3三聚體復(fù)合物在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供調(diào)節(jié)TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物含量在抑制膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用以及提供調(diào)節(jié)TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物含量在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用。有利于尋找新的治療靶點(diǎn)，進(jìn)行有目的的腫瘤干預(yù)治療和藥物開發(fā)，改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。
【專利說明】TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及腦膠質(zhì)瘤瘤侵襲性生長(zhǎng)的研究領(lǐng)域，具體涉及調(diào)節(jié)TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物含量在抑制膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用，以及調(diào)節(jié)TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物含量在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]膠質(zhì)瘤(Gl1ma)是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占全部顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率的46%。隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展，膠質(zhì)瘤的診療技術(shù)有了很大的提高和改進(jìn)，但病人治療后短期內(nèi)復(fù)發(fā)率很高，總體預(yù)后仍不理想，究其原因與膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的生物學(xué)特性有關(guān)，即膠質(zhì)瘤細(xì)胞能侵入周圍正常的腦組織，造成外科手術(shù)難以將腫瘤完全切除，而后續(xù)的放療及化療難以徹底消滅已侵入到周圍正常腦組織中的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)。長(zhǎng)期以來對(duì)于膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的研究主要著重于膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)癌基因的作用機(jī)制，而忽略了炎癥微環(huán)境的作用。1863年，現(xiàn)代病理學(xué)奠基人Rudolf Virchow就提出假說:炎癥微環(huán)境是導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種慢性疾病的原因之一。最近越來越多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究已經(jīng)證實(shí)了這一假說，而這也是當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)。組織損傷，無論是物理，化學(xué)或感染所致，均會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)，是機(jī)體對(duì)傷害刺激的防御反應(yīng)的一部分，但機(jī)體免疫功能未能控制的炎癥反應(yīng)將會(huì)擾亂細(xì)胞的微環(huán)境，從而導(dǎo)致癌癥相關(guān)基因和細(xì)胞信號(hào)蛋白的翻譯后修飾的改變；同時(shí)巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞可導(dǎo)致包括腫瘤壞死因子a(tumornecrosis factor-α，TNF-α )、白介素-6 ( inter I eukin- 6，IL-6)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-0，TGF_0)等在內(nèi)的非特異性炎性細(xì)胞因子上調(diào)，從而支持腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在惡性膠質(zhì)瘤中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)往往提示腫瘤患者預(yù)后的不良，說明炎癥微環(huán)境在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供:
TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0007]進(jìn)一步的，所述TNFRl因子在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0008]進(jìn)一步的，所述MAP4K4因子在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0009]進(jìn)一步的，所述ARP3因子在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0010]進(jìn)一步的，TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
[0011]進(jìn)一步的，所述TNFRl因子在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
[0012]進(jìn)一步的，所述MAP4K4因子在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
[0013]進(jìn)一步的，所述ARP3因子在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
[0014]有利于尋找新的治療靶點(diǎn)，進(jìn)行有目的的腫瘤干預(yù)治療和藥物開發(fā)，改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。
[0015]研究方法:
I，研究不同膠質(zhì)瘤瘤體中心組織及周邊組織中ARP3及MAP4K4蛋白表達(dá)情況，分析兩者的相關(guān)性及其與臨床病理因素的關(guān)聯(lián)性;利用ARP3與MAP4K4的表達(dá)載體及小干擾質(zhì)粒，確定兩者之間的相互作用以及作用的結(jié)構(gòu)域;檢測(cè)ARP3與MAP4K4相互作用對(duì)ARP3磷酸化的調(diào)節(jié)，明確兩者相互作用機(jī)制；明確ARP3與MAP4K4相互作用對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生存、迀移及侵襲能力的調(diào)節(jié)作用；將干預(yù)ARP3及MAP4K4表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株注射至裸鼠腦皮質(zhì)內(nèi)，構(gòu)建裸鼠腦內(nèi)膠質(zhì)瘤形成模型，探索干預(yù)ARP3與MAP4K4相互作用對(duì)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型中腫瘤發(fā)生及侵襲的影響；利用TNFRl、ARP3及MAP4K4的表達(dá)載體及小干擾質(zhì)粒，確定三者之間的相互作用以及作用的結(jié)構(gòu)域。
[0016]2，研究不同膠質(zhì)瘤瘤體中心組織及周邊組織中ARP3及MAP4K4蛋白表達(dá)情況，分析兩者的相關(guān)性及其與臨床病理因素的關(guān)聯(lián)性;利用ARP3與MAP4K4的表達(dá)載體及小干擾質(zhì)粒，確定兩者之間的相互作用以及作用的結(jié)構(gòu)域;檢測(cè)ARP3與MAP4K4相互作用對(duì)ARP3磷酸化的調(diào)節(jié)，明確兩者相互作用機(jī)制；明確ARP3與MAP4K4相互作用對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生存、迀移及侵襲能力的調(diào)節(jié)作用;將干預(yù)ARP3及MAP4K4表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株注射至裸鼠腦皮質(zhì)內(nèi)，構(gòu)建裸鼠腦內(nèi)膠質(zhì)瘤形成模型，探索干預(yù)ARP3與MAP4K4相互作用對(duì)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型中腫瘤發(fā)生及侵襲的影響；利用TNFRl、ARP3及MAP4K4的表達(dá)載體及小干擾質(zhì)粒，確定三者之間的相互作用以及作用的結(jié)構(gòu)域
3，檢測(cè)TNFRl、ARP3與MAP4K4相互作用對(duì)MAP4K4、ARP3磷酸化的調(diào)節(jié)，明確TNFRl、ARP3與MAP4K4三者相互作用機(jī)制；明確TNFR1、ARP3與MAP4K4相互作用對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生存、迀移及侵襲能力的調(diào)節(jié)作用；研究不同膠質(zhì)瘤瘤體中心組織及周邊組織中TNFRl、ARP3及MAP4K4蛋白表達(dá)情況，分析三者表達(dá)的相關(guān)性及其與臨床病理因素的關(guān)聯(lián)性;將干預(yù)TNFRl、ARP3及MAP4K4表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株注射至裸鼠腦皮質(zhì)內(nèi)，構(gòu)建裸鼠腦內(nèi)膠質(zhì)瘤形成模型，探索干預(yù)TNFRl、ARP3與MAP4K4相互作用對(duì)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型中腫瘤發(fā)生及侵襲的影響。
[0017]研究結(jié)果表明，TNFR1、ARP3及MAP4K4的相互作用可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)，其機(jī)制為TNF-α活化TNFRl后，招募并激活MAP4K4，磷酸化ARP3，激活A(yù)RP2/3復(fù)合物，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合及偽足形成。因此，調(diào)節(jié)TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物含量在抑制膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用以及調(diào)節(jié)TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物含量在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用有了理論依據(jù)。
[0018]本發(fā)明以炎癥微環(huán)境中炎癥因子對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的作用為研究對(duì)象，以TNFRl與ARP3相互作用作為切入點(diǎn)，研究TNFRUARP3及MAP4K4相互作用對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。為膠質(zhì)瘤的分子治療提供新的藥物開發(fā)靶點(diǎn)。
[0019]
【附圖說明】
[0020]圖1是膠質(zhì)瘤組織中TNFRl、ARP3的表達(dá)情況(A.免疫組化檢測(cè)不同級(jí)別膠質(zhì)瘤病理組織中TNFRl和ARP3的表達(dá)；B.WesternBlot檢測(cè)不同級(jí)別膠質(zhì)瘤病理組織中TNFRl和ARP3的表達(dá)。)
圖2是130例膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中TNFRl及ARP3的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性。(注:*P〈0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。)
圖3是膠質(zhì)瘤組織中TNFRl與ARP3表達(dá)的相關(guān)性(統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示膠質(zhì)瘤中TNFRl與ARP3的表達(dá)呈正相關(guān)。)
圖4是細(xì)胞劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNFRl促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞迀移及侵襲。(A.膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TNFRl過表達(dá)及空載質(zhì)粒，36小時(shí)后行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞迀移能力;B.膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TNFRl過表達(dá)及空載質(zhì)粒，36小時(shí)后行Transwel I實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。)
圖5是膠質(zhì)瘤組織中TNFRUMAP4K4及ARP3存在相互作用(A.免疫共沉淀檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中TNFRl與ARP3的相互作用；B.免疫共沉淀檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中TNFRl與MAP4K4的相互作用;C.免疫共沉淀檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中MAP4K4與ARP3的相互作用。)
圖6是膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TNF-α對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞迀移、侵襲能力及ARP3磷酸化的影響，ARP3磷酸化與膠質(zhì)瘤細(xì)胞迀移、侵襲能力的關(guān)系。(A.在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中予以O(shè)ng/ml，lng/ml，10ng/ml，50ng/ml及 100ng/ml的TNF-a刺激24小時(shí)，收集細(xì)胞蛋白，WesternBlot檢測(cè)p_ARP3的表達(dá)情況；B.在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中予以TNF-α 50ng/ml刺激24小時(shí)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞迀移能力；C.在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中予以TNF-α 50ng/ml刺激24小時(shí)，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力;D.在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中予以TNF-α刺激，收集細(xì)胞蛋白，western blot檢測(cè)卩-八!^33』-0&(11161'；[11、￥；[1116111:；[11及1^-0&(11161'；[11的表達(dá)。)
圖7是研究方法步驟I的技術(shù)路線圖。
[0021 ]圖8是研究方法步驟2的技術(shù)路線圖。
[0022]圖9是研究方法步驟3的技術(shù)路線圖。
[0023]圖10是研究方法步驟4的技術(shù)路線圖。
[0024]
【具體實(shí)施方式】
[0025]研究?jī)?nèi)容:
I，分析TNFRl與MAP4K4的相互作用及其機(jī)制，明確膠質(zhì)瘤炎癥微環(huán)境中，TNFRl招募并激活MAP4K4，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)。
[0026](I)驗(yàn)證膠質(zhì)瘤及正常腦組織中TNFRl與MAP4K4的表達(dá)，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性，及與臨床病理因素包括患者病理級(jí)別、復(fù)發(fā)及預(yù)后的相關(guān)性。
[0027](2)分別在膠質(zhì)瘤組織、工具細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中驗(yàn)證并分析TNFRl與MAP4K4的相互作用，并根據(jù)各自結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)分別構(gòu)建截短突變質(zhì)粒，明確其相互作用結(jié)構(gòu)域。
[0028](3)在TNF-a刺激下，干預(yù)TNFRl表達(dá)或TNFRl與MAP4K4相互作用，分別在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株及工具細(xì)胞中明確TNFRl與MAP4K4相互作用對(duì)MAP4K4磷酸化修飾的調(diào)節(jié)作用。
[0029](4)在TNF-α刺激下，干預(yù)TNFRl表達(dá)或TNFRl與MAP4K4相互作用，分析TNFRl與MAP4K4相互作用對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞迀移及侵襲能力的影響。
[0030](5)分別構(gòu)建TNFRl過表達(dá)、小干擾及不與MAP4K4相互作用的突變細(xì)胞株，利用裸鼠構(gòu)建膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型，明確TNFRl與MAP4K4的相互作用對(duì)動(dòng)物模型中膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的影響。
[0031]2，分析MAP4K4與ARP3的相互作用及其機(jī)制，明確在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中，MAP4K4通過磷酸化ARP3，激活A(yù)RP2/3復(fù)合物，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合及偽足形成，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性。
[0032](I)驗(yàn)證膠質(zhì)瘤及正常腦組織中MAP4K4與ARP3的表達(dá)，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性，及與臨床病理因素包括患者病理級(jí)別、復(fù)發(fā)及預(yù)后的相關(guān)性。
[0033](2)分別在膠質(zhì)瘤組織、工具細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中驗(yàn)證并分析MAP4K4與ARP3相互作用，并根據(jù)各自結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)分別構(gòu)建截短突變質(zhì)粒，明確其相互作用結(jié)構(gòu)域。
[0034](3)干預(yù)MAP4K4表達(dá)或MAP4K4與ARP3相互作用，分別在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株及工具細(xì)胞中明確MAP4K4與ARP3相互作用對(duì)ARP3磷酸化修飾的調(diào)節(jié)作用。
[0035](4)干預(yù)MAP4K4表達(dá)或MAP4K4與ARP3相互作用，分析MAP4K4與ARP3相互作用對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生長(zhǎng)及迀移、侵襲能力的調(diào)節(jié)作用。
[0036](5)分別構(gòu)建MAP4K4過表達(dá)、小干擾及不與ARP3相互作用的突變細(xì)胞株，利用裸鼠構(gòu)建膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型，明確MAP4K4與ARP3的相互作用對(duì)動(dòng)物模型中膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的影響。
[0037]3，分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體的相互作用及其機(jī)制，明確膠質(zhì)瘤炎癥微環(huán)境中，TNFRl通過招募并激活MAP4K4，從而磷酸化ARP3，激活A(yù)RP2/3復(fù)合物，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合及偽足形成，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性。
[0038](I)分別在膠質(zhì)瘤組織、細(xì)胞及工具細(xì)胞中分析及驗(yàn)證TNFR1、MAP4K4、ARP3三者的相互作用，并利用上述研究?jī)?nèi)容的結(jié)果，分別干預(yù)TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3復(fù)合物形成，明確TNFRl與ARP3的相互作用與MAP4K4的相關(guān)性。
[0039](2)分別在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及工具細(xì)胞中干預(yù)TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3復(fù)合物形成，明確TNFRl影響MAP4K4對(duì)APR3的磷酸化作用。
[0040](3)分別在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及工具細(xì)胞中干預(yù)TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3復(fù)合物形成，明確TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、細(xì)胞偽足形成及細(xì)胞迀移、侵襲能力的影響。
[0041]4，利用膠質(zhì)瘤臨床病理標(biāo)本及構(gòu)建裸鼠膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型，在整體水平全面探討分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對(duì)膠質(zhì)瘤在體內(nèi)侵襲性生長(zhǎng)的影響。
[0042](I)綜合分析膠質(zhì)瘤及正常腦組織中TNFRl、MAP4K4與ARP3表達(dá)的相關(guān)性及與臨床相關(guān)因素包括患者病理級(jí)別、復(fù)發(fā)及預(yù)后的相關(guān)性。
[0043](2)分別構(gòu)建TNFRUMAP4K4與ARP3過表達(dá)、小干擾的穩(wěn)定細(xì)胞株，以I X 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質(zhì)內(nèi)，構(gòu)建裸鼠膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型。
[0044](3)4周后收集腦組織，檢測(cè)腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關(guān)系，HE染色檢測(cè)腫瘤侵襲情況。
[0045](4)獲取裸鼠腫瘤組織Western Blot及免疫組化檢測(cè)TNFRl、MAP4K4與ARP3 的表達(dá)情況。
[0046](5)組織消化，原代細(xì)胞培養(yǎng)，重復(fù)研究?jī)?nèi)容2.1.3，分析并驗(yàn)證TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對(duì)裸鼠原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、細(xì)胞偽足形成及細(xì)胞迀移、侵襲能力的影響。
[0047]研究方案:
步驟I，分析TNFRl與MAP4K4的相互作用及其機(jī)制，明確膠質(zhì)瘤炎癥微環(huán)境中，TNFRl招募并激活MAP4K4，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)。
[0048]本部分實(shí)驗(yàn)步驟如圖7:
(I)驗(yàn)證膠質(zhì)瘤及正常腦組織中TNFRl與MAP4K4的表達(dá)，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性，及與臨床病理因素包括患者病理級(jí)別、復(fù)發(fā)及預(yù)后的相關(guān)性。
[0049]I)收集130例膠質(zhì)瘤病例的病理組織石蠟標(biāo)本，病例選擇標(biāo)準(zhǔn)為:①有影像學(xué)明確診斷(包括CT及核磁共振);②有術(shù)后病理明確診斷;③術(shù)前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級(jí)參照《2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)》。收集40組膠質(zhì)瘤術(shù)后新鮮癌組織及癌旁組織，結(jié)合臨床作出明確的組織分型和病理分級(jí)診斷。另取10例因急性腦外傷行內(nèi)減壓術(shù)所得正常腦組織標(biāo)本為對(duì)照。
[0050]2)通過Western Blot和免疫組化等方法，研究不同病理分級(jí)的膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤瘤體中心組織及周邊組織中TNFRl與MAP4K4的蛋白表達(dá)情況，將蛋白表達(dá)情況與膠質(zhì)瘤的臨床因素進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)，分析TNFRl與MAP4K4表達(dá)的相關(guān)性及其表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者病理級(jí)別、復(fù)發(fā)及預(yù)后的相關(guān)性。
[0051 ] (2)分別在膠質(zhì)瘤組織、工具細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中驗(yàn)證并分析TNFRl與MAP4K4的相互作用，并根據(jù)各自結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)分別構(gòu)建截短突變質(zhì)粒，明確其相互作用結(jié)構(gòu)域。
[0052]I)在體外，GST-pull down驗(yàn)證TNFRl與MAP4K4存在相互作用。
[0053 ] ①構(gòu)建Hi s標(biāo)記的TNFRI及GST標(biāo)記的MAP4K4的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)體外表達(dá)，分離純化 His-TNFR1&GST-MAP4K4。
[0054]②將耦合有GST-MAP4K4的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His-TNFRl 共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測(cè)His-TNFRl的表達(dá)，明確TNFRl在體外可以與MAP4K4相結(jié)合形成復(fù)合物。
[0055]2 )HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證TNFRl與MAP4K4存在相互作用。
[0056]①構(gòu)建Myc標(biāo)記的MAP4K4及HA標(biāo)記的TNFRl的真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白，分別用HA及Myc抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)Myc_MAP4K4及HA-TNFRl的表達(dá)，明確TNFRl與MAP4K4的外源性相互作用。
[0057 ] ②根據(jù)TNFRI與MAP4K4的分子結(jié)構(gòu)的特征，構(gòu)建TNFRI及MAP4K4的截短載體，將上述截短載體共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞，免疫共沉淀聯(lián)合Western Blot分析TNFRl與MAP4K4截短載體的相互作用，明確TNFRl與MAP4K4相互作用的結(jié)構(gòu)域。
[0058]3)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中驗(yàn)證TNFRl與MAP4K4存在相互作用。
[0059]①收集H4、U87-MG及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過Western Blot在蛋白水平檢測(cè)TNFRl與MAP4K4的表達(dá)。收集H4、U87-MG及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)TNFRl與MAP4K4的表達(dá)。選擇低表達(dá)的細(xì)胞株用于過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，選擇高表達(dá)的細(xì)胞株用于小干擾實(shí)驗(yàn)。
[0060]②選取TNFRl與MAP4K4表達(dá)差異顯著的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，收集細(xì)胞蛋白，分別用TNFRl及MAP4K4的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對(duì)照，Western Blot檢測(cè)MAP4K4及TNFRl的表達(dá)，明確在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中TNFRl與MAP4K4的內(nèi)源性相互作用。
[0061 ]③固定膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，分別用TNFRl與MAP4K4的特異性抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TNFRl與MAP4K4的定位情況，分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中TNFRl與MAP4K4的相互作用。
[0062](3)在TNF-α刺激下，干預(yù)TNFRl表達(dá)或TNFRl與MAP4K4相互作用，分別在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株及工具細(xì)胞中明確TNFRl與MAP4K4相互作用對(duì)MAP4K4磷酸化修飾的調(diào)節(jié)作用。
[0063]I)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中檢測(cè)TNFRl與MAP4K4的相互作用對(duì)MAP4K4磷酸化修飾的調(diào)節(jié)及其機(jī)制。
[0064]選取高表達(dá)TNFRl的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，予以干擾TNFRl表達(dá);低表達(dá)TNFRl的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，予以過表達(dá)TNFRl，同時(shí)予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對(duì)照組不予TNF-a刺激，收集細(xì)胞蛋白，用TNFRl抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)TNFRl與MAP4K4相互作用的改變，及MAP4K4及P- MAP4K4的表達(dá)。
[0065]2)HEK293T細(xì)胞中檢測(cè)TNFRl與MAP4K4的相互作用對(duì)MAP4K4磷酸化修飾的調(diào)節(jié)及其機(jī)制。
[0066]①將|^4示記的1^?41(4及濃度不同的骱標(biāo)記的了即1?1表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染冊(cè)1(2931'細(xì)胞，同時(shí)予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對(duì)照組不予TNF-a刺激，收集細(xì)胞蛋白，用HA抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)TNFRl與MAP4K4相互作用的改變，及MAP4K4及p- MAP4K4的表達(dá)。
[0067]②將Myc標(biāo)記的MAP4K4分別與HA標(biāo)記的TNFRl及其截短突變表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，予以TNF-a 50 ng/mL刺激48 h，對(duì)照組不予TNF-a刺激，收集細(xì)胞蛋白，用HA抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)MAP4K4及p- MAP4K4的表達(dá)。
[0068](4)在TNF-a刺激下，干預(yù)TNFRl表達(dá)或TNFRl與MAP4K4相互作用，分析TNFRl與MAP4K4相互作用對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞迀移及侵襲能力的影響。
[0069]I)在TNF-a刺激下，檢測(cè)TNFRl及MAP4K4各自對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞迀移和侵襲性的調(diào)節(jié)作用。
[0070]利用先前構(gòu)建的TNFR及MAP4K4的過表達(dá)或小干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，將細(xì)胞接種至Lamin包被的培養(yǎng)板上，予或不予TNF-a刺激，利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)構(gòu)建膠質(zhì)瘤細(xì)胞迀移模型；接種至包被有Matrigel的8um孔徑的Transwel I小室上構(gòu)建侵襲模型，檢測(cè)不同細(xì)胞的迀移及侵襲的能力。
[0071 ] 2)在TNF-α刺激下，檢測(cè)干預(yù)TNFRl與MAP4K4的相互作用對(duì)MAP4K4及TNFRl各自調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞迀移和侵襲能力的影響。
[0072]在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中共轉(zhuǎn)TNFRl的過表達(dá)載體(或小干擾質(zhì)粒)及MAP4K4的過表達(dá)載體或小干擾質(zhì)粒，通過細(xì)胞劃痕及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同細(xì)胞的迀移及侵襲的能力。
[0073](5)分別構(gòu)建TNFRl過表達(dá)、小干擾及不與MAP4K4相互作用的突變細(xì)胞株，利用裸鼠構(gòu)建膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型，明確TNFRl與MAP4K4的相互作用對(duì)動(dòng)物模型中膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的影響。
[0074]分別構(gòu)建TNFRl過表達(dá)、小干擾及不與MAP4K4相互作用的穩(wěn)定細(xì)胞株，以I X 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質(zhì)內(nèi)，構(gòu)建裸鼠膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型;4周后收集腦組織，檢測(cè)腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關(guān)系，HE染色檢測(cè)腫瘤侵襲情況;獲取裸鼠腫瘤組織Western Blot及免疫組化檢測(cè)TNFRl及MAP4K4的表達(dá)情況;組織消化，原代細(xì)胞培養(yǎng)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟(3 )及(4 )，驗(yàn)證并分析TNFRl與MAP4K4的相互作用對(duì)裸鼠原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞迀移、侵襲能力的影響。
[0075]步驟2，分析MAP4K4與ARP3的相互作用及其機(jī)制，明確在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中，MAP4K4通過磷酸化ARP3，激活A(yù)RP2/3復(fù)合物，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合及偽足形成，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性。
[0076]本部分實(shí)驗(yàn)步驟如圖8:
Cl)驗(yàn)證膠質(zhì)瘤及正常腦組織中MAP4K4與ARP3的表達(dá)，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性，及與臨床病理因素包括患者病理級(jí)別、復(fù)發(fā)及預(yù)后的相關(guān)性。
[0077]I)收集130例膠質(zhì)瘤病例的病理組織石蠟標(biāo)本，病例選擇標(biāo)準(zhǔn)為:①有影像學(xué)明確診斷(包括CT及核磁共振);②有術(shù)后病理明確診斷;③術(shù)前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級(jí)參照《2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)》。收集40組膠質(zhì)瘤術(shù)后新鮮癌組織及癌旁組織，結(jié)合臨床作出明確的組織分型和病理分級(jí)診斷。另取10例因急性腦外傷行內(nèi)減壓術(shù)所得正常腦組織標(biāo)本為對(duì)照。
[0078]2)通過Western Blot和免疫組化等方法，研究不同病理分級(jí)的膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤瘤體中心組織及周邊組織中MAP4K4與ARP3的蛋白表達(dá)情況，將蛋白表達(dá)情況與膠質(zhì)瘤的臨床因素進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)，分析MAP4K4與ARP3表達(dá)的相關(guān)性及其表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者病理級(jí)另U、復(fù)發(fā)及預(yù)后的相關(guān)性。
[0079](2)分別在膠質(zhì)瘤組織、工具細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中驗(yàn)證并分析MAP4K4與ARP3相互作用，并根據(jù)各自結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)分別構(gòu)建截短突變質(zhì)粒，明確其相互作用結(jié)構(gòu)域。
[0080]I)在體外，GST-pull down驗(yàn)證MAP4K4與ARP3存在相互作用。
[0081 ] ①構(gòu)建His標(biāo)記的ARP3及GST標(biāo)記的MAP4K4的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)體外表達(dá)，分離純化HiS- ARP3及GST-MAP4K4。
[0082]②將耦合有GST-MAP4K4的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His- ARP3 共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測(cè)His- ARP3的表達(dá)，明確ARP3在體外可以與MAP4K4相結(jié)合形成復(fù)合物。
[0083]2)HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證MAP4K4與ARP3存在相互作用。
[0084]①構(gòu)建Myc標(biāo)記的MAP4K4及Flag標(biāo)記的ARP3的真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白，用Flag及Myc抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)Myc_MAP4K4及Flag-ARP3的表達(dá)，明確MAP4K4與ARP3的外源性相互作用。
[0085]②根據(jù)MAP4K4與ARP3的分子結(jié)構(gòu)的特征，構(gòu)建MAP4K4及ARP3的截短載體，將上述截短載體共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞，免疫共沉淀聯(lián)合Western Blot分析MAP4K4與ARP3截短載體的相互作用，明確MAP4K4與ARP3相互作用的結(jié)構(gòu)域。
[0086]3)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中驗(yàn)證MAP4K4與ARP3存在相互作用。
[0087]①收集H4、U87-MG及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過Western Blot在蛋白水平檢測(cè)MAP4K4與ARP3的表達(dá)。收集H4、U87-MG及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)MAP4K4與ARP3的表達(dá)。選擇低表達(dá)的細(xì)胞株用于過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，選擇高表達(dá)的細(xì)胞株用于小干擾實(shí)驗(yàn)。
[0088]②選取MAP4K4與ARP3表達(dá)差異顯著的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，收集細(xì)胞蛋白，分別用MAP4K4與ARP3的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對(duì)照，Western Blot檢測(cè)MAP4K4與ARP3的表達(dá)，明確在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中MAP4K4與ARP3的內(nèi)源性相互作用。
[0089]③固定膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，分別用MAP4K4與ARP3的特異性抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MAP4K4與ARP3的定位情況，分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中MAP4K4與ARP3的相互作用。
[0090](3)干預(yù)MAP4K4表達(dá)或MAP4K4與ARP3相互作用，分別在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株及工具細(xì)胞中明確MAP4K4與ARP3相互作用對(duì)ARP3磷酸化修飾的調(diào)節(jié)作用。
[0091]I)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中檢測(cè)MAP4K4與ARP3的相互作用對(duì)ARP3磷酸化修飾的調(diào)節(jié)及其機(jī)制。
[0092]選取高表達(dá)MAP4K4的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，予以干擾TNFRI表達(dá);低表達(dá)MAP4K4的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，予以過表達(dá)MAP4K4，收集細(xì)胞蛋白，用MAP4K4抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)MAP4K4與ARP3相互作用的改變，及ARP3和p- ARP3的表達(dá)。
[0093]2)HEK293T細(xì)胞中檢測(cè)MAP4K4與ARP3的相互作用對(duì)ARP3磷酸化修飾的調(diào)節(jié)及其機(jī)制。
[0094]①將Flag標(biāo)記的ARP3及濃度不同的Myc標(biāo)記的MAP4K4表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白，用Myc抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)MAP4K4與ARP3相互作用的改變，及ARP3和P- ARP3的表達(dá)。
[0095]②將Flag標(biāo)記的ARP3分別與Myc標(biāo)記的MAP4K4及其截短突變表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白，用Myc抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)ARP3及p-ARP3的表達(dá)。
[0096](4)干預(yù)MAP4K4表達(dá)或MAP4K4與ARP3相互作用，分析MAP4K4與ARP3相互作用對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生長(zhǎng)及迀移、侵襲能力的調(diào)節(jié)作用。
[0097]I)檢測(cè)MAP4K4及ARP3各自對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生長(zhǎng)及迀移、侵襲能力的調(diào)節(jié)作用。
[0098]利用先前構(gòu)建的MAP4K4及ARP3的過表達(dá)或小干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，用免疫熒光檢測(cè)肌動(dòng)蛋白的聚合及其速度的改變;免疫熒光及光鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞偽足生長(zhǎng)的改變;細(xì)胞劃痕Transwel I侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同細(xì)胞的迀移及侵襲的能力。
[0099]2)檢測(cè)干預(yù)MAP4K4及ARP3的表達(dá)對(duì)ARP3及MAP4K4各自調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生長(zhǎng)及迀移、侵襲能力的影響。
[0100]在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中共轉(zhuǎn)MAP4K4的過表達(dá)載體(或小干擾質(zhì)粒)及ARP3的過表達(dá)載體及小干擾質(zhì)粒，用免疫熒光檢測(cè)肌動(dòng)蛋白的聚合及其速度的改變;免疫熒光及光鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞偽足生長(zhǎng)的改變;細(xì)胞劃痕Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同細(xì)胞的迀移及侵襲的能力。
[0101](5)分別構(gòu)建MAP4K4過表達(dá)、小干擾及不與ARP3相互作用的突變細(xì)胞株，利用裸鼠構(gòu)建膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型，明確MAP4K4與ARP3的相互作用對(duì)動(dòng)物模型中膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的影響。
[0102]分別構(gòu)建MAP4K4過表達(dá)、小干擾及不與ARP3相互作用的穩(wěn)定細(xì)胞株，以I X 108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質(zhì)內(nèi)，構(gòu)建裸鼠膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型;4周后收集腦組織，檢測(cè)腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關(guān)系，HE染色檢測(cè)腫瘤侵襲情況;獲取裸鼠腫瘤組織Western Blot及免疫組化檢測(cè)MAP4K4及ARP3的表達(dá)情況;組織消化，原代細(xì)胞培養(yǎng)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟(3)及(4)，驗(yàn)證并分析MAP4K4與ARP3的相互作用對(duì)裸鼠原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞迀移、侵襲能力的影響。
[0103]步驟3，分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體的相互作用及其機(jī)制，明確膠質(zhì)瘤炎癥微環(huán)境中，TNFRl通過招募并激活MAP4K4，從而磷酸化ARP3，激活A(yù)RP2/3復(fù)合物，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合及偽足形成，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性。
[0104]本部分實(shí)驗(yàn)步驟如圖9:
(I)工具細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中驗(yàn)證TNFRl、MAP4K4及ARP3三者兩兩相互作用，并明確TNFRl與ARP3相互作用的結(jié)構(gòu)域。
[0105]I)在體外，GST-pull down驗(yàn)證TNFRl與ARP3存在相互作用。
[0106]①構(gòu)建His標(biāo)記的ARP3及GST標(biāo)記的TNFRl的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)體外表達(dá)，分離純化His- ARP3及GST-TNFR1。
[0107]②將耦合有GST-TNFRl的Glutath1ne Sepharose 4B與純化的His- ARP3 共孵育，洗滌后予SDS裂解液裂解蛋白，Western Blot檢測(cè)His- ARP3的表達(dá)，明確ARP3在體外可以與TNFRl相結(jié)合形成復(fù)合物。
[0108]2 )HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證TNFRl與ARP3存在相互作用。
[0109]①構(gòu)建HA標(biāo)記的TNFRl及Flag標(biāo)記的ARP3的真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白，用Flag及HA抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)HA-TNFR1及Flag_ARP3的表達(dá)，明確TNFRl與ARP3的外源性相互作用。
[0110]②根據(jù)TNFRl與ARP3的分子結(jié)構(gòu)的特征，構(gòu)建TNFRl及ARP3的截短載體，將上述截短載體共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞，免疫共沉淀聯(lián)合Western Blot分析TNFRl與ARP3截短載體的相互作用，明確TNFRl與ARP3相互作用的結(jié)構(gòu)域。
[0111]3)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中驗(yàn)證TNFRl與ARP3存在相互作用。
[0112]①選取TNFRl與ARP3表達(dá)差異顯著的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，收集細(xì)胞蛋白，分別用TNFRl與ARP3的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，并以同型IgG作為對(duì)照，Western Blot檢測(cè)TNFRl與ARP3的表達(dá)，明確在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中TNFRl與ARP3的內(nèi)源性相互作用。
[0113]③固定膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，分別用TNFRl與ARP3的特異性抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TNFRl與ARP3的定位情況，分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中TNFRl與ARP3的相互作用。
[0114](2)分別在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及工具細(xì)胞中干預(yù)TNFR1/MAP4K4、MAP4K4/ARP3復(fù)合物形成，明確TNFRl影響MAP4K4對(duì)APR3的磷酸化作用。
[0115]I)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中檢測(cè)TNFR1、ARP3及MAP4K4的相互作用對(duì)MAP4K4及ARP3磷酸化修飾的調(diào)節(jié)及其機(jī)制。
[0116]①選取高表達(dá)TNFRl的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，干擾TNFRl表達(dá);低表達(dá)TNFRl的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，過表達(dá)TNFRl，予或不予TNF-α刺激，收集細(xì)胞蛋白，用TNFRl抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)ARP3及p_ARP3的表達(dá)。
[0117]②選取高表達(dá)TNFRl的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，干擾TNFRl表達(dá);低表達(dá)TNFRl的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，過表達(dá)TNFRl，予或不予TNF-a刺激，收集細(xì)胞蛋白，檢測(cè)MAP4K4及p- MAP4K4表達(dá)的變化。
[0118]③若步驟②中MAP4K4的表達(dá)有變化，在②的基礎(chǔ)上，干預(yù)MAP4K4的表達(dá)，用TNFRl抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)ARP3及p_ARP3的表達(dá)是否改變。
[0119]2)HEK293T細(xì)胞中檢測(cè)TNFRl、ARP3及MAP4K4的相互作用對(duì)MAP4K4及ARP3磷酸化修飾的調(diào)節(jié)及其機(jī)制。
[0120]①將Flag標(biāo)記的ARP3及濃度不同的HA標(biāo)記的TNFRl表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，予或不予TNF-α刺激，收集細(xì)胞蛋白，用HA抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)ARP3及P-ARP3的表達(dá)。
[0121]②將Flag標(biāo)記的ARP3分別與HA標(biāo)記的TNFRl及其截短突變表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，予或不予TNF-α刺激，收集細(xì)胞蛋白，用HA抗體進(jìn)行免疫共沉淀，WesternBlot檢測(cè)ARP3及p-ARP3的表達(dá)。
[0122]③將Flag標(biāo)記的ARP3及濃度不同的HA標(biāo)記的TNFRl表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，予或不予TNF-α刺激，收集細(xì)胞蛋白，檢測(cè)MAP4K4及P- MAP4K4表達(dá)的變化。
[0123]④若步驟③中MAP4K4的表達(dá)有變化，在③的基礎(chǔ)上，干預(yù)MAP4K4的表達(dá)，用HA抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Western Blot檢測(cè)ARP3及p_ARP3的表達(dá)是否改變。
[0124](3)分別在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及工具細(xì)胞中干預(yù)TNFR1/MAP4K4、TNFR1/ARP3及MAP4K4/ARP3復(fù)合物形成，明確TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、細(xì)胞偽足形成及細(xì)胞迀移、侵襲能力的影響。
[0125]I)在研究方案步驟I及步驟2中，已檢測(cè)TNFRl、MAP4K4及ARP3各自對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生長(zhǎng)及迀移、侵襲能力的調(diào)節(jié)作用。
[0126]2)在TNF-a刺激下，檢測(cè)干預(yù)TNFR1/ARP3復(fù)合物的形成對(duì)TNFRl促進(jìn)ARP3磷酸化，調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生長(zhǎng)及迀移、侵襲能力的影響，明確TNFRl通過促進(jìn)ARP3磷酸化，來促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)。
[0127]在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中共轉(zhuǎn)TNFRl的過表達(dá)載體(或小干擾質(zhì)粒)及ARP3的過表達(dá)載體及小干擾質(zhì)粒，予或不予TNF-a刺激，用Western Blot檢測(cè)ARP3及p_ARP3的表達(dá);免疫熒光檢測(cè)肌動(dòng)蛋白的聚合及其速度的改變；光鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞偽足生長(zhǎng)的改變；細(xì)胞劃痕及Transwel I侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同細(xì)胞的迀移及侵襲的能力。
[0128]3)在TNF-α刺激下，檢測(cè)干預(yù)MAP4K4/ARP3復(fù)合物的形成對(duì)MAP4K4調(diào)節(jié)ARP3磷酸化及膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生長(zhǎng)及迀移、侵襲能力的影響，明確MAP4K4通過磷酸化ARP3，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)。
[0129]在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中共轉(zhuǎn)ARP3的過表達(dá)載體(或小干擾質(zhì)粒)及MAP4K4的過表達(dá)載體及小干擾質(zhì)粒，予或不予TNF-α刺激，用Western Blot檢測(cè)ARP3及p_ARP3的表達(dá);免疫熒光檢測(cè)肌動(dòng)蛋白的聚合及其速度的改變；光鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞偽足生長(zhǎng)的改變；細(xì)胞劃痕及Transwel I侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同細(xì)胞的迀移及侵襲的能力。
[0130]4)在TNF-α刺激下，檢測(cè)干預(yù)TNFRl /MAP4K4復(fù)合物的形成對(duì)MAP4K4磷酸化ARP3，從而調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生長(zhǎng)及迀移、侵襲能力的影響，明確TNFRl通過招募MAP4K4，從而磷酸化ARP3，促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)。
[0131 ]在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中共轉(zhuǎn)TNFRl的過表達(dá)載體(或小干擾質(zhì)粒)及MAP4K4的過表達(dá)載體或小干擾載體，予或不予TNF-α刺激，用Western Blot檢測(cè)ARP3及p_ARP3的表達(dá);免疫熒光檢測(cè)肌動(dòng)蛋白的聚合及其速度的改變；光鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞偽足生長(zhǎng)的改變；細(xì)胞劃痕及Transwel I侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同細(xì)胞的迀移及侵襲的能力。
[0132]綜合分析上述結(jié)果，明確TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、偽足生長(zhǎng)及迀移、侵襲能力的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。
[0133]步驟4，利用膠質(zhì)瘤臨床病理標(biāo)本及構(gòu)建裸鼠膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型，在整體水平全面探討分析TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對(duì)膠質(zhì)瘤在體內(nèi)侵襲性生長(zhǎng)的影響。
[0134]本部分實(shí)驗(yàn)步驟如圖10:
Cl)綜合分析膠質(zhì)瘤及正常腦組織中TNFRUMAP4K4與ARP3表達(dá)的相關(guān)性及與臨床相關(guān)因素包括患者病理級(jí)別、復(fù)發(fā)及預(yù)后的相關(guān)性。
[0135]I)收集130例膠質(zhì)瘤病例的病理組織石蠟標(biāo)本，病例選擇標(biāo)準(zhǔn)為:①有影像學(xué)明確診斷(包括CT及核磁共振);②有術(shù)后病理明確診斷;③術(shù)前無放療、化療及激素治療;④組織分型和病理分級(jí)參照《2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)》。收集40組膠質(zhì)瘤手術(shù)新鮮組織及瘤旁組織，結(jié)合臨床作出明確的組織分型和病理分級(jí)診斷。另取10例因急性腦外傷行內(nèi)減壓術(shù)所得正常腦組織標(biāo)本為對(duì)照。
[0136]2)通過Western Blot和免疫組化等方法，研究不同病理分級(jí)的膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤瘤體中心組織及周邊組織中TNFRl、MAP4K4與ARP3的蛋白表達(dá)情況，將蛋白表達(dá)情況與膠質(zhì)瘤的臨床因素進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)，分析TNFRl、MAP4K4與ARP3表達(dá)的相關(guān)性及其表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者病理級(jí)別、復(fù)發(fā)及預(yù)后的相關(guān)性。
[0137](2)分別構(gòu)建了即1?1、1^41(4與41^3過表達(dá)、小干擾的穩(wěn)定細(xì)胞株，以1\108密度在腦立體定位儀下注射至裸鼠皮質(zhì)內(nèi)，構(gòu)建裸鼠膠質(zhì)瘤腦內(nèi)模型。
[0138](3) 4周后收集腦組織，檢測(cè)腫瘤形成的大小、重量等情況，并比較其與裸鼠生存率的關(guān)系，HE染色檢測(cè)腫瘤侵襲情況。
[0139](4)獲取裸鼠腫瘤組織Western Blot及免疫組化檢測(cè)TNFRl、MAP4K4與ARP3的表達(dá)情況。
[0140](5)組織消化，原代細(xì)胞培養(yǎng)，重復(fù)研究?jī)?nèi)容步驟3，分析并驗(yàn)證TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體對(duì)裸鼠原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合、細(xì)胞偽足形成及細(xì)胞迀移、侵襲能力的影響。
[0141]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
TNF-α是腫瘤炎癥微環(huán)境中重要的炎癥因子，主要通過其受體腫瘤壞死因子受體I(tumor necrosis factor receptor I，TNFR1)傳導(dǎo)信號(hào)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TNFRl由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三個(gè)部分構(gòu)成，其胞外區(qū)與配體TNF-α結(jié)合后，TNFRl通過招募死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白TRADD(TNF receptor-associated death domain)與其胞內(nèi)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，募集一系列相關(guān)蛋白，如:腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF_areceptor-associated factor 2，TRAF2)、FADD(Fas_associated death domain)及受體相互作用蛋白Ureceptor interacting protein I，RIP1)等形成復(fù)合體，來實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞及細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)控。研究顯示，TNFRl的活化在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。TNFRl活化后，募集TRAF2及RIPl形成復(fù)合物，通過活化NF-kB途徑抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展;TNFRl活化后也可通過激活下游ERK途徑，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TNFRl的蛋白表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病例的病理分級(jí)呈正相關(guān)，且免疫組化結(jié)果顯示其在復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤患者中有異常高表達(dá)，并對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的迀移及侵襲有促進(jìn)作用(見圖1，2，4)，提示TNFRl的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的侵襲性生長(zhǎng)有關(guān)。通過蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)TNFRl與調(diào)節(jié)細(xì)胞迀移和侵襲的肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白3(actin-related protein 3，ARP3)有相互作用，并在膠質(zhì)瘤組織中通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)得到進(jìn)一步驗(yàn)證(見圖5)。
[0142]ARP3是一個(gè)重要的肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，和其他6種肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白共同組成ARP2/3復(fù)合物。ARP2/3復(fù)合物作為Rho GTP酶-WASP下游的一個(gè)重要效應(yīng)器可以直接調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的聚合及偽足的形成，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及腫瘤侵襲性生長(zhǎng)過程中起到不可或缺的作用。在侵襲性生長(zhǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，ARP3的蛋白水平顯著增加，其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤組織的惡性程度成正比，并且侵襲能力越強(qiáng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，ARP3的表達(dá)越高，促進(jìn)偽足生長(zhǎng)的能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ARP3的蛋白水平與膠質(zhì)瘤病例的病理分級(jí)呈正相關(guān)，且免疫組化結(jié)果顯示其在復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤患者中有異常高表達(dá)，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)ARP3與TNFRl在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)呈正相關(guān)(見圖1，2，3) ARP3的異常高表達(dá)是TNFRl促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的重要因素之一。
[0143]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在TNF-α的刺激下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的迀移、侵襲能力增強(qiáng)，ARP3的磷酸化表達(dá)增加，且ARP3的磷酸化水平與細(xì)胞侵襲相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)呈正相關(guān)(見圖6XARP3的磷酸化是膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的重要因素之一。
[0144]在膠質(zhì)瘤中，MAP4K4與富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(proline_rich tyrosinekinase 2，Pyk2)結(jié)合，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TNFRl及ARP3均與MAP4K4有相互作用(見圖5)，由此可以推測(cè)，活化的TNFRl可以招募MAP4K4，并與ARP3形成復(fù)合體，但在膠質(zhì)瘤中TNFRl招募的MAP4K4是否可以磷酸化ARP3，從而激活A(yù)RP2/3復(fù)合物，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。
[0145]綜上所述，炎癥微環(huán)境中，活化的TNFRl可以招募TRAF2形成復(fù)合體結(jié)構(gòu)，而TRAF2可與MAP4K4結(jié)合，調(diào)節(jié)MAP4K4的活性。MAP4K4的活化可磷酸化ARP3，激活A(yù)RP2/3復(fù)合物。ARP2/3復(fù)合物的激活可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合，促進(jìn)偽足形成，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。在膠質(zhì)瘤中，ARP2/3復(fù)合物的活性與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的偽足形成及侵襲性成正相關(guān)。結(jié)合課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNFRl可以與ARP3相互作用，并且二者在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)具有相關(guān)性，同時(shí)與腫瘤病理等級(jí)、復(fù)發(fā)及膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力呈正相關(guān);在TNF-α的刺激下，ARP3的磷酸化表達(dá)增加，且與細(xì)胞侵襲相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)呈正相關(guān);而且TNFRl及ARP3均與MAP4K4有相互作用，這提示在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中，TNFRl與ARP3的相互作用具有重要的生物學(xué)意義。
[0146]結(jié)論:
I，明確膠質(zhì)瘤炎癥微環(huán)境中，TNFRl通過招募MAP4K4從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)。
[0147]2，明確在膠質(zhì)瘤發(fā)展中，MAP4K4通過磷酸化ARP3，從而促使膠質(zhì)瘤細(xì)胞偽足形成及侵襲性增強(qiáng)。
[0148]3，膠質(zhì)瘤炎癥微環(huán)境中，TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體胞偽足形成及侵襲性的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其特征為，所述TNFRl因子在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求1所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其特征為，所述MAP4K4因子在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求1所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其特征為，所述ARP3因子在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的應(yīng)用。5.TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用。6.如權(quán)利要求5所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用，其特征為，所述TNFRl因子在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用。7.如權(quán)利要求5所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用，其特征為，所述MAP4K4因子在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用。8.如權(quán)利要求5所述TNFR1/MAP4K4/ARP3三聚體復(fù)合物在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用，其特征為，所述ARP3因子在制備治療膠質(zhì)瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105854020SQ201610398368
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】藺玉昌, 張敬寧, 張燕
【申請(qǐng)人】無錫市第二人民醫(yī)院