專利名稱：單鏈化的人凋亡素2配體三聚體蛋白質(zhì)的制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)和生物技術(shù)藥物領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用氨基酸連接臂將人凋亡素2配體(Apo2L)三個(gè)單體串聯(lián)起來,形成單鏈化(single chain)的人凋亡素2配體三聚體(scApo2L)蛋白質(zhì)，以及編碼scApo2L的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞，用基因工程制備該蛋白質(zhì)的方法，以及該蛋白質(zhì)在如腫瘤等疾病治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1995年，國外報(bào)道從人表達(dá)標(biāo)簽序列文庫(expressed sequence tag,EST)中篩選到一種編碼抗腫瘤蛋白質(zhì)的基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)稱為腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL),又稱凋亡素 2配體(apoptotin-21igand,Apo2L),其通過啟動(dòng)細(xì)胞固有的凋亡程序,可有效地誘導(dǎo)腫瘤和 轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞無影響[Immunity，1995 ;3 (6) =673-682 ；J Biol Chem, 1996 ；271 (22) :12687-12690.]?，F(xiàn)國際上將Apo2L統(tǒng)一命名為腫瘤壞死因子(配體)超家族成員 10[tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10],在各大生物數(shù)據(jù)庫中的ID 為HGNC :11925 ；Entrez Gene :8743 ；Ensembl ENSG00000121858 ；UniProtKB :P50591。人Apo2L基因的編碼序列有846個(gè)核苷酸(SEQ ID NO. I)，編碼的Apo2L蛋白質(zhì)由281個(gè)氨基酸組成(SEQ ID NO. 2)。業(yè)已證明Apo2L是典型的II型跨膜蛋白，其N-端第95或114位開始的胞外區(qū)可形成游離的可溶性凋亡素2配體蛋白，同樣具有特異啟動(dòng)腫瘤凋亡作用。與腫瘤壞死因子(配體)超家族其他成員一樣，Apo2L必須形成三聚體才能發(fā)揮生物學(xué)作用。三個(gè)同源Apo2L分子利用其單體分子內(nèi)唯一的第230位半胱氨酸與Zn2+螯合，形成三聚體，這是其發(fā)揮生物學(xué)作用的關(guān)鍵。將該半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸或甘氨酸后，其結(jié)構(gòu)改變，形成無功能的二聚體，無誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；去除螯合的Zn2+，三聚體轉(zhuǎn)換為二聚體，Apo2L的促凋亡活性也基本喪失。結(jié)晶結(jié)構(gòu)表明Apo2L分子中的Tyrl83、Tyr243、Phe278對Cys230與Zn2+結(jié)合也起到重要作用?，F(xiàn)已明確沒有形成三聚體的Apo2L具有顯著的肝毒性，并與其它毒副作用有關(guān)。因此Apo2L的活性形式是必需形成同源三聚體才能與其受體結(jié)合，而天然Apo2L三聚體是以非共價(jià)方式——依賴三個(gè)單體分子各自的第230位半胱氨酸與Zn2+螯合形成同源三聚體，這導(dǎo)致在重組蛋白質(zhì)的正確折疊、穩(wěn)定性等方面成為限制性因素。2008年,Krippner-Heidenreich等報(bào)道了利用柔性氨基酸將三個(gè)TNF a單體融合串聯(lián)重組表達(dá)，即單鏈化的TNF a三聚體，顯示了較原型TNF a在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物學(xué)活性、系統(tǒng)毒性、半衰期延長等方面的明顯優(yōu)勢[J Immunol, 2008 ； 180 (12) :8176-83]。這一策略在抗體單鏈化中也早已成功應(yīng)用。因此用合適的氨基酸連接臂將Apo2L三個(gè)單體分子串聯(lián)表達(dá)，由此所產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)可以保持Apo2L特異啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞固有的凋亡程序而發(fā)揮抗腫瘤作用，而且具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、半衰期延長等特性。因此，本發(fā)明所得到的蛋白質(zhì)可以為抗腫瘤等疾病的治療提供新的藥物或制劑。此外，本領(lǐng)域還迫切需要開發(fā)成本低廉和/或步驟簡便的單鏈化Apo2L三聚體的生產(chǎn)工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種新的具有Apo2L生物活性的藥物，它是單鏈化的Apo2L三聚體蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一目的是提供編碼所述蛋白質(zhì)的DNA、含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的是提供一種成本低廉和\或步驟簡便的生產(chǎn)所述單鏈化Apo2L三聚體蛋白質(zhì)的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種蛋白質(zhì)，它包括(a)有三個(gè)相同的人凋亡素2配體(Apo2L)元件，該元件具有人凋亡素2配體或其 活性片段的氨基酸序列；(b)三個(gè)人Apo2L之間由2段0-20個(gè)氨基酸的連接臂序列連接，形成單鏈化的Apo2L 三聚體(scApo2L)；更佳的，所述的Apo2L元件具有SEQ ID NO. 2中第95-281位或114-281位的氨基酸序列；而且，所述的連接序列為含4-14個(gè)氨基酸的接頭肽；更佳的，所述的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO. 4中所示的氨基酸序列；更佳的，所述的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO. 6中所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的DNA分子，它編碼本發(fā)明上述的蛋白質(zhì)；較佳地，所述的DNA分子編碼包括SEQ ID NO. 4或6中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；更佳的，所述的DNA分子包括SEQ ID NO. 3或5中所示的核苷酸序列。在本發(fā)明第三方面，提供了含有上述DNA分子的載體和含有上述載體的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明第四方面，提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的方法，它包括步驟在適合表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述的蛋白質(zhì)；和分離純化所述的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明蛋白質(zhì)的用途，它被用于制備治療腫瘤的藥物。


圖I顯示了不同長度的Apo2L以不同氨基酸連接臂拼接的8種單鏈化Apo2L三聚體蛋白質(zhì)。其中表示Apo2L氨基酸序列；……表示柔性氨基酸連接臂氨基酸序列；表示金屬蛋白酶切位點(diǎn)氨基酸連接臂氨基酸序列。圖2顯示了一種特征性的由柔性氨基酸連接臂連接的單鏈化Apo2L三聚體蛋白質(zhì)重組表達(dá)及純化過程的電泳分析(SDS-PAGE)。其中，A S200進(jìn)一步純化的scApo2L蛋白質(zhì)；B :CM纖維素進(jìn)一步純化的scApo2蛋白質(zhì)；C :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(kD) ；D :金屬親和純化的ScApo2L ；E :金屬親和純化ScApo2L蛋白質(zhì)洗出液；F :表達(dá)上清經(jīng)40%硫酸銨鹽析后的沉淀；G :誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)后的細(xì)菌破碎上清；H :未誘導(dǎo)表達(dá)的全菌。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，將三個(gè)Apo2L編碼序列用氨基酸連接臂編碼序列連接在一起，產(chǎn)生由合適的氨基酸連接臂連接的單鏈化Apo2L的三聚體蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)具有Apo2L特異啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡程序殺傷腫瘤，而且較原型Apo2L結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，半衰期明顯延長。因此，本發(fā)明所得到的單鏈化Apo2L蛋白質(zhì)可以為抗腫瘤等治療提供新的化合物。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。定義如本文所用，術(shù)語蛋白質(zhì)中“凋亡素2配體元件”或“Apo2L元件”可互換使用，指在所述蛋白質(zhì)中的一部分氨基酸序列，該序列與天然的或變異的凋亡素2配體或其可溶性 活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有與天然凋亡素2配體基本上相同的生物活性。優(yōu)選的Apo2L元件是人凋亡素2配體，更佳的是人凋亡素2配體可溶性活性片段，如SEQ ID NO. 2中第95-281位或114-281位的氨基酸序列。凋亡素2配體的序列可以源自人，也可以源自非人的動(dòng)物，優(yōu)選的是來源于人的凋亡素2配體序列。如本文所用，術(shù)語“連接肽”或“氨基酸連接臂”可互換使用，指位于凋亡素2配體元件之間的氨基酸序列，起連接作用的短肽或氨基酸。連接肽的長度通常為0-20個(gè)氨基酸，較佳地為3-16個(gè)氨基酸,最佳地為6-10個(gè)氨基酸。技術(shù)人員可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法[如參見 PNAS1998 ；95 :5929-5934 ；Protein Eng, 2000 ；13(5) :309-312 ；Protein Eng,2003 ；15(11) :871-879等文獻(xiàn)]設(shè)計(jì)連接肽。通常，連接肽不影響或不嚴(yán)重影響凋亡素2配體元件的三個(gè)單體分子的氨基酸序列形成正確的折疊和空間構(gòu)象。優(yōu)選的連接肽例子包括(但并不限于)①為了有利于蛋白折疊成相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，用GGGGSGGGGS等序列作為連接臂是合適的，如SEQ ID NO. 4中第170-179位和350-359位；②為了有利于蛋白酶把單鏈化Apo2L三聚體蛋白質(zhì)切割成3個(gè)獨(dú)立的單體蛋白質(zhì)分子，可用活性X因子的酶切位點(diǎn)IEGR、腫瘤特異高表達(dá)的金屬蛋白酶的酶切位點(diǎn)PLGLffA 作連接臂，相似的，chymotrypsin I, papain, plasmin, thrombin, trypsin 等酶的酶切位點(diǎn)也可設(shè)計(jì)作為氨基酸連接臂；③為了有利于純化，可把6His作為純化標(biāo)簽或作為連接臂，以用金屬親和層析純化蛋白質(zhì)，相似的，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)，谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)等也可設(shè)計(jì)作為純化的標(biāo)簽或作為連接臂；④上述三種方案的結(jié)合也可設(shè)計(jì)成新的氨基酸連接臂，如NVVVHQAHHHHHHEFTYK連接臂就是融合了蛋白酶切位點(diǎn)(NIa蛋白酶)和金屬親和層析位點(diǎn)6His。編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA序列，可以全部人工合成，也可用PCR擴(kuò)增或合成的方法獲得，甚至從市場購買(如Origene的Cat. No. RC207596)，然后將其拼接在一起，形成編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA序列。在獲得了編碼本發(fā)明新蛋白質(zhì)的DNA序列之后，將其連入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過分離純化得到本發(fā)明的新的蛋白質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語“載體”包括質(zhì)粒、粘粒、表達(dá)載體、克隆載體、病毒載體等。代表性的狀態(tài)包括(但并不限于)能在真核細(xì)胞如CH0、C0S系列等真核細(xì)胞中表達(dá)的載體，能在釀酒酵母或畢氏酵母中表達(dá)的載體，能在家蠶等昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的載體以及原核表達(dá)載體。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明新蛋白質(zhì)的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么編碼信號肽(分泌前導(dǎo)序列)的DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分 泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞后，可在適合表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，從而表達(dá)出蛋白質(zhì)?？衫闷湮锢淼?、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括(但并不限于)常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、親和層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包括有效量的本發(fā)明的新型單鏈化Apo2L三聚體蛋白質(zhì)，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在制備這些組合物時(shí)，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時(shí)，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括濕潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。組合物可制成單元或多元?jiǎng)┬?。各劑型包含為了產(chǎn)生所期望的治療效應(yīng)而計(jì)算出預(yù)定量的活性物質(zhì)，以及合適的藥劑學(xué)賦形劑。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、口服或局部給藥。使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明蛋白質(zhì)施用于人，其中該安全有效量通常至少約I微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳的該劑量是約10微克/千克體重到約I毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可與其他治療藥物聯(lián)用，其中包括(但并不限于)各種細(xì)胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各種腫瘤化療藥物，如5_Fu、氨甲蝶呤等影響核酸生物合成的藥物，氮芥、環(huán)磷酰胺等烷化劑類，阿霉素、放線菌素D等干擾轉(zhuǎn)錄過程阻止RNA合成的藥物，長春新堿、喜樹堿類影響蛋白質(zhì)合成的藥物，紫杉醇等微管抑制的藥物，及某些激素等各類藥物。綜上所述，本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下(I)單鏈化Apo2L三聚體蛋白質(zhì)具有Apo2L特異性啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能,是一種治療腫瘤的新型藥物。(2)給藥方便由于單鏈化Apo2L三聚體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定、半衰期的延長,可以較原型Apo2L減少給藥瀕率。(3)具有靶向性利用特定氨基酸連接臂與腫瘤細(xì)胞的特異結(jié)合，可以將單鏈化 Apo2L三聚體蛋白質(zhì)運(yùn)抵腫瘤局部發(fā)揮作用。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照所用材料制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I建立cDNA文庫，篩選得到Apo2L基因I.制備人外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA按常規(guī)用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血淋巴細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBC0公司)，加10%新生小牛血清(杭州四季青生物公司)及青霉素和鏈霉素培養(yǎng)至貼壁，得單個(gè)核細(xì)胞，然后用IOii g/L的大腸桿菌R595的內(nèi)毒素刺激2h，以激活單個(gè)核細(xì)胞，收集IO7細(xì)胞，用總RNA抽提試劑盒(Qiagen公司)抽提總RNA，得人外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA。2 建立cDNA文庫，篩選Apo2L基因上述所得的總RNA,用01igo-dT柱(Qiagen公司)純化得總mRNA,用cDNA合成試劑盒(Clontch公司)按說明書進(jìn)行cDNA第一鏈和第二鏈的合成，加上EcoR I接頭后連接到AgtlO載體中，并用\噬菌體包裝試劑盒(Clontech公司)包裝成\噬菌體文庫，建成XgtlOcDNA文庫，文庫的滴度為6 XlO6。此\ gtIOcDNA文庫以IX IO5菌落/LB平板上鋪板，在20 X 20cm的硝酸纖維素濾膜上制作重復(fù)的印模。用Apo2L理論序列設(shè)計(jì)隨機(jī)引物，制備基因探針，雜交篩選文庫。含有菌落的重復(fù)印膜在含10%硫酸葡聚糖、100 u g/ml tRNA和6X 105cpm/ml探針的平板篩選緩沖液(50mmol/L Tris-HCl pH 7. 5, lmol/L NaCl，0. I %焦磷酸鈉，0. 2%聚乙烯吡咯烷酮和 0. 2% Ficoll)中 65°C雜交過夜。65°C平板篩選，2X SSC(0. 3mol/L NaCl，30mmol/L檸檬酸鈉，PH7. 0)、0. 1% SDS緩沖液洗兩次。然后在_40°C與膠片緊密接觸，篩選40小時(shí)。雙份陽性的樣品從主平板上挑出對應(yīng)菌落，轉(zhuǎn)到添加了明膠的緩沖液(lOOmmol/LNaCl, 10mmol/L MgSO4, 50mmol/L Tris-HCl, pH 7.5)的 LB 平板上，得到 12 個(gè)陽性噬菌斑。12個(gè)純化的\ DNA用Not I消化，I %瓊脂糖凝膠電泳，Southern印跡確認(rèn)與探針雜交。挑選與上述探針雜交時(shí)，放射性強(qiáng)度最大的克隆(約1.7kp)進(jìn)行DNA純化。這些克隆的插入部分被亞克隆到PSP0RT1 (GIBC0公司)的Not I位點(diǎn)。測定質(zhì)粒中插入部分的DNA序列。從序列分析的結(jié)果中得到，其中一個(gè)質(zhì)粒中的插入序列為1769bp，根據(jù)Kozak定義的翻譯起始位點(diǎn)要求，第88-90位核苷酸(ATG，編碼蛋氨酸)為翻譯起始位點(diǎn)，所以其包含87bp的5’非翻譯區(qū)，846bp開放閱讀框和3’非翻譯區(qū)(含多聚腺苷酸化信號或稱polyA尾)，其中的編碼序列如SEQID NO. I。由此得到所編碼的281個(gè)氨基酸序列如SEQ ID NO. 2。實(shí)施例2RT-PCR得到Apo2L的編碼序列I.制備人外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA(I)按常規(guī)方法從人外周血中分離淋巴細(xì)胞，進(jìn)而用貼壁法獲得單個(gè)核細(xì)胞；(2)用細(xì)菌內(nèi)毒素激活單個(gè)核細(xì)胞以刺激細(xì)胞表達(dá)更多的基因和提高RNA的豐度，用RNA抽提試劑盒(Qiagen公司)抽提總RNA。
2.逆轉(zhuǎn)錄(RT)獲得Apo2L的cDNA第一鏈以上述總RNA為模板，以Pl為引物，逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成Apo2L cDNA第一鏈。引物Pl :5’ -TCC AGG TCA GTT AGC CAA C-3’ (SEQ ID NO. 8)3.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得Apo2L編碼序列以上述cDNA第一鏈為模板，P1、P2為引物，Tag DNA聚合酶催化合成和擴(kuò)增Apo2L編碼序列。經(jīng)序列分析，所得DNA序列與各大數(shù)據(jù)庫所顯示的Apo2L編碼序列一致，即得到了 Apo2L編碼核苷酸序列。引物P2 :5，-CTG ACT TAC AGC AGT CAG-3’ (SEQ ID NO. 9)實(shí)施例3構(gòu)建表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)載體及工程菌通過改建載體pBV220，構(gòu)建高效表達(dá)Apo2L的重組質(zhì)粒，所構(gòu)建的表達(dá)Apo2L的原核表達(dá)載體，命名為pBV-Apo2L。本發(fā)明相應(yīng)的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)以同樣的方法實(shí)施。具體實(shí)施步驟如下I.設(shè)計(jì)并合成寡聚核苷酸雙鏈合成寡聚核苷酸雙鏈，序列如下(未給出互補(bǔ)鏈的序列)P3 :5，-AAA GAT CTC TCA CCT ACC AAA CAA TGC CCC CCT GCA AAA AAT AAATTCATA TAA AAA ACA TAC AGA TAA CCA TCT GCG GTG ATA AA T TAT CTC TGG CGG TGTTGA CATAAA TAC CAC TGG CGG TGA TAC TGA GCA CA T CAG CAG GAC GCA CTGACCACC ATG MG GTG ACG CTC TTA AM ATT AAG CCC TGA AGA AGG GCA GCA TTCAAAGCA GAA GGC TTT GGG GTG TGT GATACG AAA CGA AGC ATT GG T TAA AAATTA AHnAGG AAT TCA CA-3’ (SEQ ID NO. 10)其中，斜體部分為XPJr串聯(lián)啟動(dòng)子序列，陰影部分為Cl抑制蛋白結(jié)合位點(diǎn)，黑體部分為優(yōu)化的SD序列，5’端引入BglII酶切位點(diǎn)AGATCT，3’端引入EcoR I酶切位點(diǎn)GAATTC。2.構(gòu)建表達(dá)載體pBV_Apo2L以實(shí)施例1、2中得到的、或市售的Apo2L編碼序列為模板，P4、P5為引物PCR擴(kuò)增得5’端帶EcoR I、翻譯起始密碼子ATG、并且優(yōu)化了與核糖體結(jié)合序列之間的距離為7個(gè)核苷酸，3’帶Pst I酶切位點(diǎn)的Apo2L第114-281位得編碼序列，然后以EcoR I和Pst I酶切(工具酶皆購自美國NEB公司)。
P4(pll4Ef) :5，_gc gaa ttc aca atg gtg aga gaa aga ggt c_3，(SEQ ID NO. 11)P5 (p281rP) :5，-acg ctg cag tta gcc aac taa aaa ggc_3’ (SEQ ID NO. 12)接著以Bgl II和EcoR I酶切P3，以Bgl II和Pst I雙酶切pBV220質(zhì)粒。上述各酶切片段瓊脂糖凝膠回收相應(yīng)大小的片段，用T4DNA連接酶連接各片段，所得到的重組質(zhì)粒即凋亡素2配體的表達(dá)載體，命名為pBV-Apo2L。pBV_Apo2L相比pBV220具有以下特征Apo2L編碼序列受上游入噬菌體PlPk串聯(lián)啟動(dòng)子控制，優(yōu)化的核糖體結(jié)合序列(SD序列)，插入EcoR I酶切位點(diǎn)及翻譯起始密碼子ATG,同時(shí)優(yōu)化了與SD序列之間的距離為7個(gè)核苷酸。該質(zhì)粒與PBV220同樣，在啟動(dòng)子序列中含有clts857結(jié)合序列；帶有氨芐青霉素抗性基因；轉(zhuǎn)錄終止序列rrnB ;質(zhì)粒上含有編碼溫度敏感蛋白因子clts857基因，在42°C時(shí)該編碼產(chǎn)物失活，從而失去對啟動(dòng)子的抑制，啟動(dòng)子控制的下游外源基因被表達(dá)。上游調(diào)控序列、優(yōu)化的SD序列、Apo2L編碼序列及 翻譯終止序列等特征核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。3.引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)構(gòu)建單鏈化的人凋亡素2配體三聚體蛋白質(zhì)表達(dá)載體用上述同樣的方法，以表I所列序列為引物(所列引物只部分列舉了擴(kuò)增圖I中所列8種蛋白質(zhì))，以上述實(shí)施例或市售(如Origene的Cat. No. RC207596)所得的人凋亡素2配體編碼序列為模板，分別PCR擴(kuò)增各單體人凋亡素2配體編碼DNA片段，相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切各PCR產(chǎn)物，T4DNA連接酶連接入已用限制性內(nèi)切酶EcoR I與Pst I酶切的上述改建的PBV220載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選含重組質(zhì)粒的克隆，DNA序列測定證實(shí)，即可得到表達(dá)各蛋白質(zhì)的表達(dá)工程菌。以構(gòu)建圖I中B形式(柔性氨基酸連接臂連接)的scApo2L表達(dá)載體為例，首先分別以 SEQ ID NO. 11 與 SEQ ID NO. 14，SEQ ID NO. 18 與 SEQ ID NO. 16，SEQ ID NO. 19 與SEQID NO. 12為引物，以人凋亡素2配體編碼序列為模板，分別PCR擴(kuò)增三個(gè)單體人凋亡素2配體編碼DNA片段，EcoR I與BamH I酶切SEQ ID NO. 11與SEQ ID NO. 14的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BamH I 與 Sal I 酶切 SEQ ID NO. 18 與 SEQ ID NO. 16 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，Sal I 與 Pst I酶切SEQ ID NO. 19與SEQ ID NO. 12的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，T4DNA連接酶連接各片段，然后插入已用限制性內(nèi)切酶EcoR I與Pst I酶切的上述改建的PBV220載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選含重組質(zhì)粒的克隆，DNA序列測定證實(shí)，即可得到表達(dá)各蛋白質(zhì)的表達(dá)工程菌，相應(yīng)重組質(zhì)粒即為柔性氨基酸連接臂連接的scApo2L表達(dá)質(zhì)粒。同樣的，為獲得金屬蛋白酶切位點(diǎn)(PLGLWA)連接的ScApo2L(例如圖1_D所示)，就以 SEQ ID NO. 11 與 SEQ ID NO. 20，SEQ ID NO. 18 與 SEQ ID NO. 21，SEQ ID NO. 19 與 SEQIDN0. 12為引物，以人凋亡素2配體編碼序列為模板，分別PCR擴(kuò)增三個(gè)單體人凋亡素2配體編碼DNA片段，EcoR I與BamH I酶切SEQ ID NO. 11與SEQ ID NO. 20的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BamH I 與 Sal I 酶切 SEQ ID NO. 18 與 SEQ ID NO. 21 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，Sal I 與 Pst I 酶切SEQ IDN0. 19與SEQ ID NO. 12的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，T4DNA連接酶連接各片段，然后插入已用限制性內(nèi)切酶EcoR I與Pst I酶切的上述改建的PBV220載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選含重組質(zhì)粒的克隆，DNA序列測定證實(shí)，即可得到表達(dá)各蛋白質(zhì)的表達(dá)工程菌，相應(yīng)重組質(zhì)粒即為金屬蛋白酶切位點(diǎn)連接的scApo2L表達(dá)質(zhì)粒。同樣的，Apo2L三個(gè)單體間2段氨基酸連接臂序列可以不同，如圖I所示的E-F。制備這些ScApo2L表達(dá)載體時(shí)，就是PCR擴(kuò)增時(shí)引物間的組合不同，其余構(gòu)建條件是一致的。表I引物核苷酸序列表以Apo2L編碼序列為模板，PCR擴(kuò)增以不同氨基酸連接臂的單鏈化Apo2L(如圖I所示)各單體所用引物。P表示引物，中間數(shù)字表示所編碼的氨基酸的起始或終止位置，f表示正向引物，r表示反向引物，E表示引入EcoR I酶切位點(diǎn)，G表示引入柔性氨基酸連接臂編碼序列，B表示引入BamH I酶切位點(diǎn)，S表示引入Sal I酶切位點(diǎn)，M表示引入金屬蛋
白酶酶切位點(diǎn)編碼序列
名稱 Wn序列號^
p95Ef 5’-gc gaa ttc aca atg acc tct gag gaa acc att tc-39SEQ ID NO. 13
5，-aa gga tcc get tcc gcc ccc gcc get ccc gcc tcc gcc gcc aac taa aaa ggc^
p281 rBG^，SEQ ID NO. 14
ccc g-3
p95Bf 5’-aa gga tcc acc tct gag gaa acc att tc-3’SEQ ID NO.15
*01S5-aa gtc gac get tcc gcc ccc gcc get ccc gc^tcc gcc gcc aac taa aaa ggc
p2oxro(jaby IJJ InU. Io ccc g-3
p95Sf5，_aa gtc gac acc tct gag gaa acc att tc-3 ’SEQ ID NO. 17
pi l4Bf5，-aa gga tcc gtg aga gaa aga ggt cct c-3，SEQ ID NO. 18
pll4Sf5’-aa gtc gac gtg aga gaa aga ggt cct o3’SEQ ID NO. 19
p281rBM 5，-aa gga tcc tec cca taa tcc taa tgg gcc aac taa aaa ggc ccc g-3’SEQ ID N0.20
p281rSM5’-aa gtc gac tgc cca taa tcc taa tgg gcc aac taa aaa ggc ccc g-3’SEQ ID N0.21注所需pll4Ef 即為 P4(SEQ ID NO. 11)，p281rP 即為 P5 (SEQ ID NO. 12)由此得到了一系列分別表達(dá)不同連接方式的scAp02L蛋白質(zhì)的重組質(zhì)粒。特別的，用所列舉的引物制備得到的如圖I所示的8種scApo2L重組蛋白質(zhì)可直接表現(xiàn)出在體外殺傷腫瘤細(xì)胞，在體內(nèi)抑制移植的腫瘤生長的生物學(xué)作用。一種優(yōu)選的表達(dá)scApo2L蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所推斷的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。另一種優(yōu)選的表達(dá)scAp02L蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以如SEQ ID NO. 5所示，所推斷的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。至此，本發(fā)明所涉及的所有核苷酸或氨基酸序列均已列出，見核苷酸和氨基酸序列表。序列表編號說明如下SEQ ID NO. I :Apo2L編碼核苷酸序列SEQ ID NO. 2 Apo2L 氨基酸序列SEQ ID NO. 3 :柔性氨基酸連接臂連接的scApo2L編碼核苷酸序列SEQ ID NO. 4 :柔性氨基酸連接臂連接的scApo2L氨基酸序列SEQ ID NO. 5 :金屬蛋白酶切位點(diǎn)連接的scApo2L編碼核苷酸序列SEQ ID NO. 6 :金屬蛋白酶切位點(diǎn)連接的scApo2L氨基酸序列SEQ ID NO. 7 :pBV_Apo2L 特征核苷酸序列SEQ ID NO. 8-21 :引物和接頭的核苷酸序列實(shí)施例4
轉(zhuǎn)化大腸桿菌，建立工程菌按常規(guī)將實(shí)施例3中獲得的pBV-Apo2L等一系列重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21[基因型hsdS gal(A clts857indl Sam 7 nin 5 lacUV5_I7)](可購自上海生工生物工程公司)，從氨芐抗性菌落中分離質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，測序確認(rèn)，所得的陽性克隆即為表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)的工程菌。實(shí)施例5制備scApo2L蛋白質(zhì)各種培養(yǎng)基如下LB培養(yǎng)基用作試管種子培養(yǎng)，2XYT培養(yǎng)基用作二級種子培養(yǎng)，半合成培養(yǎng)基用于發(fā)酵，補(bǔ)料分批加入培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基配方(g/L):蛋白胨酵母粉NaCl = 10 5 5 ； 2XYT培養(yǎng)基配方(g/L):蛋白胨酵母粉NaCl = 16 10 5 ；半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中配方(g/L):蛋白胨酵母粉KH2PO4 K2HPO4 Na2HPO4. 12H20 (NH4)2SO4 NH4Cl = 5:5:2:4:7: I. 2:0. 2;各種微量元素溶液，濃度為(g/L)=MnSO4. 5H20 CaCl2. 6H20 Na2MoO4. 2H20 ZnCl2CuSO4. 5H20 H3BO4 FeSO4. 7H20 CaCl2. 2H20 MgSO4. 7H20 = 0. 001 0.004 0.002 0.0
02 0. 001 0. 0005 0. 02 0. 02 0. 3 ；發(fā)酵補(bǔ)料配方(g/L):葡萄糖酵母粉蛋白胨MgSO4. 7H20 =200 : 70 : 70 : 5.7。培養(yǎng)基的pH值全部調(diào)為7. 2。各種培養(yǎng)基高溫滅菌后加入氨芐青霉素終濃度至100 Ii g/ml。一級種子培養(yǎng)過夜后，以I : 20 100的比例轉(zhuǎn)接至二級種子，發(fā)酵罐按工作體積的I 5%接種入培養(yǎng)過夜的二級種子。培養(yǎng)分兩個(gè)階段進(jìn)行，32°C培養(yǎng)5-7小時(shí)；升溫至42°C培養(yǎng)4-5小時(shí)。恒流泵添加補(bǔ)料，溶解氧控制在30-50%之間?？傻玫郊s30-100克/升發(fā)酵液的濕菌體。超聲破碎發(fā)酵菌體,離心取上清,過0. 22 u m的濾膜；用NTA Supperf low (Qiagen公司)或TALON Metal Affinity Rsins (Clontech公司)等金屬親和層析柱行親和層析，5 10mmol/L咪唑，pH7. 0洗脫雜蛋白，再以80 100mmol/L咪唑，pH7. 0，洗脫重組蛋白質(zhì)；洗脫液過CM纖維素,收集活性組分；再過Sephacryl S-200進(jìn)一步純化,即可得到高純度的重組蛋白質(zhì)。結(jié)果以圖I-B所示的一種蛋白質(zhì)(即scApo2L)進(jìn)行原核重組表達(dá)為例，所構(gòu)建的工程菌經(jīng)熱誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎后，離心所分離的上清行SDS-PAGE，可見所表達(dá)的蛋白質(zhì)占上清總蛋白的10%以上，進(jìn)一步純化后達(dá)電泳純，結(jié)果見圖2。其余的各種ScApo2L誘導(dǎo)表達(dá)后可取得類似結(jié)果，得到相應(yīng)分子量大小的重組蛋白。實(shí)施例6蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性確定在本實(shí)施例中，測定蛋白質(zhì)所具有的scApo2L活性。scApo2L的活性在體外可以人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌1990株細(xì)胞、人大細(xì)胞肺癌NCI-H460、小鼠黑色素瘤B16等為靶細(xì)胞，確定scApo2L的生物學(xué)活性，體內(nèi)以抑制裸鼠的人結(jié)腸癌HCT-8移植瘤等在體外對ScApo2L敏感、在體內(nèi)能成瘤的小鼠移植瘤為模型，驗(yàn)證scApo2L的生物學(xué)功能。具體測試操作如下I、scApo2L活性分析殺傷各種腫瘤細(xì)胞各種靶細(xì)胞來源于中國科學(xué)院細(xì)胞研究所或上海長海醫(yī)院。主要有人胰導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌1990、8898株，人大細(xì)胞肺癌NCI-460，人結(jié)腸癌HCT-8，人胃癌M85株、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH株、人喉癌Hep-2株、人鼻咽癌CNE-2株、人內(nèi)皮細(xì)胞CEV304株、人成纖維細(xì)胞株、人結(jié)腸癌AT-29、人卵巢癌3A0、鼠成纖維L929株、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251、人乳癌、人肝癌IfepG-2、SMMU7721、人血液學(xué)腫瘤(U937、Jukart、HL60 等)、黑色素瘤 B16_MB、Ehrlich 腹水瘤、Lewis肉瘤等。以H460細(xì)胞為例，將培養(yǎng)細(xì)胞以2X IO8細(xì)胞/L種入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C 5%CO2孵箱中孵育4-6小時(shí)，棄上清；用完全培養(yǎng)基將樣品做梯度稀釋后加入細(xì)胞板；同時(shí)觀 察加入I. 5 u g/ml放線菌素D后對各種因子殺傷細(xì)胞的影響；活性單位定義使培養(yǎng)板孔中的細(xì)胞50%死亡為I個(gè)單位，效價(jià)即達(dá)到50%殺傷時(shí)樣品稀釋度的倒數(shù)。以結(jié)晶紫法作定量分析貼壁細(xì)胞棄上清，以結(jié)晶紫固定液(5g/L結(jié)晶紫，80mL/L甲醛，lg/L NaCl,200mL/L乙醇)染色15分鐘，蒸餾水洗去結(jié)晶紫，晾干，被染色者為活細(xì)胞。每孔再加入200 u L 330mL/L的乙酸，搖床旋轉(zhuǎn)使結(jié)晶紫溶解，置酶聯(lián)儀于波長595nm讀出A值，以未加細(xì)胞的空白孔為A本底。懸浮細(xì)胞以MTT法確定活細(xì)胞數(shù)。其活性效價(jià)以樣品稀釋度的對數(shù)與A595nm的均數(shù)作直線回歸，得到常數(shù)A、B，以(A對照-A本底)/2為50%殺傷終點(diǎn)(Y) o按Y = A+BlgX算出樣品的活性單位，即X值。同時(shí),該細(xì)胞scApo2L蛋白質(zhì)作用下呈典型的凋亡形態(tài)，如IOii g/L的scApo2L作用下，2小時(shí)即觀察到細(xì)胞發(fā)生典型變化。2.蛋白質(zhì)抑制小鼠移植瘤各種腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外的擴(kuò)增液氮凍存的腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)或接種入昆明種小鼠腹腔(IO7細(xì)胞/小鼠)。10天后處死小鼠，無菌條件下吸取小鼠腹水，用PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為108/ml。以該細(xì)胞懸液0.2ml接種于實(shí)驗(yàn)小鼠皮下。隨機(jī)分組，每組6只小鼠，皮下接種的小鼠分別給予0 (PBS，對照組)、10、100、1000 U g (樣品)/kg (小鼠體重)，隔天給藥，2周。停藥I周后，處死小鼠，剝離腫瘤稱重，計(jì)算每組平均瘤重和抑瘤率，分析結(jié)果。抑瘤率以下式計(jì)算
.對照組平均瘤重一給藥組平均瘤重
抑瘤率(％)= - X100%
、’對照組平均瘤重結(jié)果人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8移植瘤的結(jié)果如表2。表2 HCT-8測試結(jié)果表
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，其特征在于它由下列元件組成 (a)有三個(gè)相同的人凋亡素2配體(Apo2L)元件，該元件具有人凋亡素2配體或其活性片段的氨基酸序列，即具有SEQ ID NO. 2中第95-281、或114-281位的氨基酸序列； (b)三個(gè)人Apo2L之間由2段0-20個(gè)氨基酸的連接臂序列連接，形成單鏈化的Apo2L三聚體(scApo2L)。
2.如權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述的連接序列各含6-14個(gè)氨基酸。
3.如權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)具有SEQID N0.4、6中所示的氨基酸序列。
4.一種人工合成的DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有SEQID NO. 3、5中所示的核苷酸序列。
6.—種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的DNA分子。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.—種產(chǎn)生權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的方法，其特征在于步驟如下(1)建立cDNA文庫，篩選得到Apo2L基因；(2)RT-PCR得到Apo2L的編碼序列；(3)構(gòu)建單鏈化Apo2L表達(dá)載體；(4)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，建立工程菌；(5)制備蛋白質(zhì)；(6)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性確定。
9.一種藥物組合物，其特征在于，由藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)組成。
10.權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的用途，其特征在于，用于制備治療腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了以不同氨基酸連接臂連接的單鏈化(single chain)的人凋亡素2配體(Apo2L)三聚體蛋白質(zhì)(scApo2L)，以及編碼這些蛋白質(zhì)的DNA序列，含編碼這些DNA序列的載體，含這些載體的宿主細(xì)胞，用基因工程制備這些蛋白質(zhì)的方法，以及含這些蛋白質(zhì)的藥物組合物。本發(fā)明的單鏈化Apo2L三聚體蛋白質(zhì)具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，所以可以用于制備治療如腫瘤等疾病的藥物。
文檔編號C12N5/10GK102775491SQ20111011887
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者焦炳華, 王梁華 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)