海洋微生物來源化合物p-3在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了海洋微生物來源化合物P?3 在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。該化合物可以通過增加抗衰老基因Sirt 1的表達，提高細胞端粒酶活性，可顯著降低細胞的老化程度，對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的細胞衰老具有明顯的保護作用。本發(fā)明 P?3在制備抗衰老損傷及相關(guān)性疾病藥物中的應(yīng)用發(fā)掘了 P?3 新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域，且 P?3安全無毒，藥理作用強，有很好的藥用前景。
【專利說明】
海洋微生物來源化合物P-3在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及海洋微生物來源化合物P-3的新應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋微生物來源化合物P-3是南海紅樹林真菌Xylaria SP . 2508的代謝產(chǎn)物 xyloke化1 A的合成衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
[0003]
[0004] 已發(fā)現(xiàn)該化合物通過調(diào)芐基因MMPs而有促血管新生的活性，而血管新生在缺血性 疾病，如冠屯、病，缺血性腦卒中的治療中具有重要意義，故該化合物可被用作缺血性疾病治 療藥物的活性成分。
[0005] 老齡化問題被認為是21世紀Ξ大世界性社會問題之一，而衰老和老年病的發(fā)生是 相生相伴的，二者具有相同的病理生理過程，如神經(jīng)內(nèi)分泌素亂、糖類及脂類代謝素亂、免 疫系統(tǒng)損傷等。隨著年齡的增大，一些老年性疾病的發(fā)生率和患病率均明顯增加，如冠屯、 病、糖尿病、動脈粥樣硬化等。因此，尋找一種可W有效的延緩細胞衰老，并預(yù)防和治療衰老 相關(guān)性疾病的藥物對我國的醫(yī)療發(fā)展具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供海洋微生物來源化合物P-3在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[000引發(fā)明人經(jīng)過長期的研究發(fā)現(xiàn)P-3可增加細胞抗衰老基因 Sbt 1表達，提高細胞端 粒酶活性，顯著降低細胞的老化程度，對血管緊張素 Π 誘導(dǎo)的細胞老化具有明顯的保護作 用，可W用于制備抗衰老及衰老相關(guān)疾病的藥物。特別是W腎素血管緊張素醒固酬系統(tǒng) (RAAS)激活和（或)端粒酶/SIRT1受損為特征的衰老損傷及相關(guān)性疾病。
[0009]其中，可W將P-3制備成藥物領(lǐng)域可W接受的各種劑型，如片劑、膠囊等等。
[0010]與現(xiàn)有的P-3的應(yīng)用相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0011] (1)本發(fā)明的化合物P-3具有良好的抗細胞衰老作用。
[0012] (2)本發(fā)明的化合物P-3安全無毒，藥理作用強，預(yù)示著很好的藥用前景。
【具體實施方式】
[0013] 下面將描述本發(fā)明的一個實施例，但本
【發(fā)明內(nèi)容】
并不局限于此。
[0014] 實施例1P-3抗細胞衰老的研究 [001引（一)材料與方法
[0016] 1.藥物:P-3，白色粉末。溶于DMS0，膽存濃度1 OOmmo 1 /L，保存于4°C備用。
[0017] 2.細胞培養(yǎng)及模型制備：
[001引采用hEPC(人外周血來源的內(nèi)皮祖細胞)作為體外研究的細胞，90%EGM-2化0NZA) +10%胎牛血清(GIBC0)于37°C5%C02培養(yǎng)箱解育，待細胞生長至7天可用于實驗。
[0019]使用血管緊張素 II誘導(dǎo)細胞老化模型:把生長狀態(tài)良好的hEP巧巾于6孔板，待其生 長至7天時將其正常培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，加入lOOnM血管緊張素 II作用24小時后進行 實驗指標(biāo)的檢測。
[0020] 3、細胞活性檢測--CCK-騎去
[0021] 于96孔板接種10化L hEPC細胞懸液，每組使用6個復(fù)孔，放入37°C溫箱培養(yǎng)，24小 時后加入不同濃度P-3預(yù)刺激1小時，再加入lOOnM血管緊張素 II處理24小時后，每孔中加入 1化L CCK-8溶液，在37°C溫箱中避光解育4小時后，于酶標(biāo)儀測定在45化m波長檢測各組吸 光度，將各組吸光度與空白對照組相比較，從而計算各組細胞的存活比例。
[0022] 4、SA-i3-半乳糖巧酶染色檢測細胞的衰老程度
[0023] 在6孔板中培養(yǎng)hEPC7天，加入lOOnM血管緊張素11，24小時后去除培養(yǎng)基，用?85洗 2遍，每孔加入1血固定液室溫固定，15min后PBS洗2遍，每孔加入按照SA-0-gal染色試劑盒 配制的ImL染色混合液，在37°C、無 C〇2條件下解育過夜，用巧光顯微鏡拍照計數(shù)細胞染色 率，被染色的細胞代表衰老細胞。
[0024] 5、端粒酶活性檢測
[0025] 于6孔板培養(yǎng)hEPC7天，P-3預(yù)解1小時后，加入lOOnM血管緊張素 II處理2地，離屯、收 集細胞于離屯、管中，每管加入2(Κ)化裂解液重懸，冰上靜置30min后離屯、取上清，同時取陰性 對照85 °C加熱lOmin。進行TRAP反應(yīng)，每個PCR管中加入25化反應(yīng)混合液、化L待測樣品及對 照樣品，進行PCR擴增。對應(yīng)每個樣品加入20化變性試劑、5化擴增產(chǎn)物室溫解育lOmin，于預(yù) 包被的96孔板中每孔加入22扣L雜交緩沖液、100化混合液37°C搖床解育化，去除緩沖液并 用Washing buffer洗Ξ次，每孔加入10化L甲基聯(lián)苯胺溶液染色，20min后每孔加入10化L終 止液。用Microplate化LISA) reader讀取450nm處的吸光值。
[00%] 6.抗衰老基因 SIRT1蛋白的表達檢測
[0027] SIRT1蛋白的表達采用western blot的方法檢測，于6孔板培養(yǎng)hEPC7天，P-3預(yù)解1 小時，加入lOOnM血管緊張素 II處理24h后，用冰PBS洗細胞Ξ次，加入含有蛋白酶抑制劑 (Cocktai 1)的裂解液RIPA 60~80ul;在冰上裂解細胞5~lOmin。用干凈細胞刮刮下細胞及 細胞裂解液，12000r/min 4°C離屯、12min，棄沉淀，小屯、吸取上清蛋白液，-80°C保存。用BCA 法進行定量，按標(biāo)準曲線計算出樣品濃度，W相同的上樣總蛋白量將樣品與上樣緩沖液W 4:1的比例混合，95°C溫浴5min使蛋白在上樣緩沖液的作用下變性。配置聚丙締酷胺(SDS- PAGE)凝膠，分離膠8%，濃縮膠5%。使用微量上樣器將樣品加入濃縮膠的各個跑道中，恒壓 80V電泳90min;將分離膠與濾紙、PVDF膜用電轉(zhuǎn)夾包裹好后一起置入電轉(zhuǎn)槽中，在電轉(zhuǎn)緩沖 液中恒流200mA電轉(zhuǎn)90min。電轉(zhuǎn)結(jié)束后取出PVDF膜，在室溫用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉 化;隨后加入相應(yīng)的Sbtl抗體，Wactin作為內(nèi)參，4°C冰箱過夜。TBST洗膜5min X 3次，加入 相應(yīng)的二抗化RP標(biāo)記，1:1000，用抗體稀釋液稀釋)后室溫搖床上解育1-化;TBST洗膜lOmin X 3次，在暗室中將PVD刊莫與E化發(fā)光液(A液:B液，1:1)混合，于X光膠片上曝光，洗片機沖洗 膠片，隨后使用Image J 1.39U進行灰度分析。WSbtl與內(nèi)參actin的灰度比值代表Sbtl 的表達水平，并把control組的比值設(shè)為1，其它組與之相比較分析Sbtl的表達高低。
[00巧]7、統(tǒng)計分析
[0029] 本實驗為多組定量數(shù)據(jù)間兩兩比較，且符合正態(tài)性及方差齊性的要求，因此選用 方差分析(One-way AN0VA)作為統(tǒng)計分析的方法。使用SPSS軟件執(zhí)行統(tǒng)計分析操作。
[0030] (二)實驗結(jié)果
[0031] 1.不同劑量P-3對Angll誘導(dǎo)的hEPC損傷的保護作用如表1。
[0032] 表1不同劑量P-3處理對Ang II誘導(dǎo)的hEPC活性的影響
[0033]
[0035] *經(jīng)單因素方差分析得到Angll組與空白對照組的細胞活性具有統(tǒng)計學(xué)差異(P< 0.05);
[0036] #經(jīng)單因素方差分析得到P-3 0.2ιχΜ處理組與Angn組的細胞活性具有統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.05)
[0037] ##經(jīng)單因素方差分析得到P-3 1μΜ/5μΜ/25μΜ處理組與Angn組的細胞活性具有統(tǒng) 計學(xué)差異(P<〇.〇l)
[0038] 上述實驗結(jié)果說明P-3具有保護hEPC血管緊張素損傷的作用，增加細胞生存率，且 呈現(xiàn)劑量依賴(0.04-25μΜ)效應(yīng)。
[0039] 2.Ρ-3的SA-β-半乳糖巧酶染色研究如表2。
[0040] 表2不同劑量Ρ-3對Angll誘導(dǎo)hEPC衰老的保護能力
[0041]
[0042] **經(jīng)單因素方差分析得到Angn組與空白對照組的細胞衰老程度具有統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.01)；
[0043] ##經(jīng)單因素方差分析得到P-3 ΙμΜ/ΙΟμΜ處理組與Angll組的細胞衰老程度具有統(tǒng) 計學(xué)差異(P<〇.〇l);
[0044] 上述實驗結(jié)果說明hEPC細胞體外Angll誘導(dǎo)衰老模型構(gòu)建成功，衰老比例約為空 白對照組的360 % ;同時，P-3具有抗hEPC衰老的作用，且呈現(xiàn)劑量依賴(0.1 -1 ΟμΜ)效應(yīng)。
[0045] 3.Ρ-3 ΙμΜ處理對Angll誘導(dǎo)的hEPC的端粒酶活性的作用如表3。
[0046] 表3P-3 ΙμΜ處理對Angll誘導(dǎo)的hEPC的端粒酶活性的影響
[0047]
[0049] **經(jīng)單因素方差分析得到Angn組與空白對照組的細胞端粒酶活性具有統(tǒng)計學(xué)差 異(P<〇.〇l);
[0050] #經(jīng)單因素方差分析得到P-3 ΙμΜ處理組與Angn組的細胞端粒酶活性具有統(tǒng)計學(xué) 差異(P<0.05)
[0051] 上述實驗結(jié)果說明P-3 ΙμΜ具有顯著提高hEPC端粒酶活性的作用。
[0化2] 4.P-3 ΙμΜ處理對SIRT1表達的作用如表4。
[0053] 表4Ρ-3 ΙμΜ處理對hEPC中SIRT1表達的影響
[0化4]
[0055] *經(jīng)單因素方差分析得到Angn組與空白對照組的Sbtl表達具有統(tǒng)計學(xué)差異(P< 0.05);
[0化6] ##經(jīng)單因素方差分析得到P-3 ΙμΜ處理組與Angll組的Sbtl表達具有統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.01)
[0057]上述實驗結(jié)果說明P-3 lliM具有顯著提高hEPC中抗衰老基因 Sbtl表達的作用。 [0化引 （Ξ)討論
[0059] 現(xiàn)今的研究認為，衰老源于細胞活性的降低，進而導(dǎo)致細胞、組織和器官的衰老， 因此衰老即是細胞的衰老。隨著衰老機制的研究進入分子時代，各種導(dǎo)致衰老的原因包括 自由基理論、熱量限制、端粒酶學(xué)說W及表觀遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域都有了新的發(fā)展。在屯、血管 疾病，如高血壓、屯、血管重構(gòu)，屯、衰等的發(fā)病過程中，腎素-血管緊張素-醒固酬系統(tǒng)(RAAS) 的激活起著重要的作用，其中Angll是RAAS系統(tǒng)中關(guān)鍵的活性分子，Angll可通過激活A(yù)TI受 體，上調(diào)NADPH氧化酶的蛋白表達，誘導(dǎo)過多的自由基生成導(dǎo)致細胞衰老；也可通過下調(diào)抗 衰老基因 SIRT，降低線粒體的數(shù)量等多種方式誘導(dǎo)細胞衰老，在WRAAS系統(tǒng)激活為特征的 衰老損傷及相關(guān)性疾病中發(fā)揮著重要的作用。因此，在本實施例1中，我們WAngll誘導(dǎo)細 胞衰老為模型具有一定的代表性。
[0060] 端粒酶和β-半乳糖巧酶活性檢測是目前最公認的細胞衰老檢測手段。端粒是真核 染色體末端像帽子一樣的特殊結(jié)構(gòu)，可穩(wěn)定染色體、防止染色體末端融合、保護染色體結(jié)構(gòu) 基因及調(diào)節(jié)正常細胞生長。端粒酶則是幫助端粒合成的分子，使端粒的長度和結(jié)構(gòu)得W穩(wěn) 定，從而保護染色體。細胞隨著端粒的變短而衰老，而當(dāng)端粒酶的活性足W維護端粒的長度 時，細胞將會延遲衰老。0-半乳糖巧酶在人體大部分細胞上均有表達，且隨著衰老的進程， 表達逐漸增加，因此β-半乳糖巧酶染色是常用的檢測細胞衰老的指標(biāo)。我們的研究結(jié)果發(fā) 現(xiàn)Ρ-3能夠明顯提高細胞生存率，增加端粒酶活性，減少β-半乳糖巧酶的細胞染色率，具有 良好的抗細胞衰老的作用。
[0061] SIRT1又稱沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶1，是一種依賴于煙酷胺嚷嶺二核巧酸的去乙 酷化酶，主要分布于細胞核內(nèi)。現(xiàn)今的研究認為，SIRT1是一種長壽基因，是當(dāng)今衰老領(lǐng)域的 分子學(xué)研究熱點。當(dāng)細胞發(fā)生損傷時，SIRT1可W通過去乙酷化ρ53，F(xiàn)0X0和Ku等蛋白W減輕 細胞調(diào)亡的趨勢；除此之外，SIRT1可W通過控制新陳代謝，熱量消耗，脂肪存儲，維持氧化 應(yīng)激下線粒體的正常功能W及抑制炎癥等多個方面來延緩衰老。研究表明抑制SIRT1表達 會促進細胞衰老，敲除SIRT1后細胞死亡率明顯增多；而激活其同源體的表達可W延長酵母 的存活期。在本研究發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)P-3能夠顯著提高細胞中Sbtl的表達，對抗Angll誘 導(dǎo)的細胞衰老。
[0062]總之，本發(fā)明研究通過檢測細胞存活率，β-半乳糖巧酶染色，端粒酶活性和抗衰老 基因 Sbtl的表達證明了海洋微生物來源的化合物Ρ-3具有良好的抗細胞衰老作用。
【主權(quán)項】
1. 海洋微生物來源化合物P-3在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于是以腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)激活或端粒 酶/SIRTl受損為特征的衰老損傷及相關(guān)性疾病。
【文檔編號】A61P39/06GK105920580SQ201610281054
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】杜艷華, 龐冀燕, 王冠蕾
【申請人】中山大學(xué)