轉(zhuǎn)錄因子FoxO3在制備腦缺血再灌注保護神經(jīng)損傷藥物中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)錄因子FoxO3在制備腦缺血再灌注保護神經(jīng)損傷藥物中的應用。本發(fā)明構(gòu)建兩種過表達FoxO3質(zhì)粒并包裝成腺病毒Ad?WT?FoxO3和Ad?TM?FoxO3調(diào)控FoxO3的表達，探討在OGD/R和MCAO/R損傷中FoxO3對自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin?1表達的影響。本發(fā)明經(jīng)實驗證明FoxO3過表達可促進自噬相關(guān)蛋白的激活，對腦缺血再灌注損傷有保護作用。本發(fā)明為腦缺血損傷防治提供新思路、新途徑，為神經(jīng)保護劑的研究提供新的靶點。
【專利說明】
轉(zhuǎn)錄因子Fox03在制備腦缺血再灌注保護神經(jīng)損傷藥物中的 應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設及轉(zhuǎn)錄因子化X03在制備腦缺血再灌注保護神 經(jīng)損傷藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 缺血性腦卒中是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高 等特點（H曰nkey GJ,et 曰l.Five-ye曰r survival after first-ever stroke曰nd related prognostic factors in the Perth Community Stroke Study. Stroke ,2000,31(9)， 2080-2086.)，對它的預防和治療已經(jīng)成為全社會和醫(yī)學界關(guān)注的重點課題。研究發(fā)現(xiàn)，缺 血性腦卒中患者腦組織的修復和功能恢復的關(guān)鍵是重建血流(Yu J，et al.Activation of autophagy in rat brain cells following focal cerebral ischemia reperfusion through enhanced e邱ression of Atgl/pULK and LC3[J].Mol Med Rep,2015,12(3): 3339-3344.)。然而，一段時間的缺血之后再恢復血流可能會導致腦組織損傷加重，甚至出 現(xiàn)不可逆性損傷的現(xiàn)象，稱為腦缺血再灌注損傷（Roger VL，et al.Heai't disease and stroke statistics--2012update:a report from the American Heart Association.Circulation,2012,125(1):θ2-θ220.和Mathers CD，et al.Projections of global mortality and burden of disease from 2002to 2030].PLoS Med,2006,3(11): e442.)。腦缺血損傷期間涉及到多種病理生理過程，包括氧化應激、興奮性毒性、炎癥、稠亡 臥及壞死等（Koike M，et al. Inhibition of autophagy prevents hippocampal pyramidal neuron death after hypoxic-ischemic injury.Am J Pathol,2008,172(2): 454-469.)。如何減輕神經(jīng)元的損傷、挽救獅臨死亡的神經(jīng)細胞是治療腦缺血再灌注損傷的 關(guān)鍵。目前臨床治療腦缺血主要有兩種方案（Minner叫J，et al·· Improving outcome after stroke:time to treat new tai'gets.Stroke,2012,43(2) :295-296.),-種是溶栓 劑，抗凝劑^及抗血小板聚集藥物的聯(lián)合應用。但是，這些藥物的應用有一定的時間局限性 并且可能會導致出血并發(fā)癥。第二種療法就是神經(jīng)保護，而大多數(shù)神經(jīng)保護劑的療效比較 弱或者有嚴重的毒副作用。因此，繼續(xù)深入研究缺血性腦卒中的病理生理機制，尋找新的藥 物作用靴點，對于缺血性腦卒中的防治和神經(jīng)保護劑的開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003] 近年來研究發(fā)現(xiàn)，自日籃在神經(jīng)元存活與死亡中具有至關(guān)重要的作用(Naeser MA， et 過l.Potenti過1 for tr過nscr過ni過1 laser or LED ther過py to treat stroke， traumatic brain injury,and neurodegenerative disease[J].Photomed Laser Surg, 2011,29(7) :443-446.),自日籃這一現(xiàn)象已成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中的熱點。自日籃是一個高 度保守的細胞過程，主要調(diào)控細胞的營養(yǎng)、能量及生長因子的狀態(tài)(Gosman-Hedstrom G，et al.Effects of acupuncture treatment on daily life activities and quality of life:a controlled，prospective，and randomized study of acute stroke patients.Stroke,1998,29(10):2100-2108.和Gabryel B，et al.Neuronal autophagy in cerebral ischemia--a potential target for neuroprotective strategies? Pharmacol Rep,2012,64(1) :1-15.),在多種細胞功能如線粒體轉(zhuǎn)化，蛋白質(zhì)降解和能量代 謝中發(fā)揮重要的作用化ulda S.Autophagy and cell death.Autophagy，2012,8(8) :1250- 1251.)。自瞻也能夠降解細胞內(nèi)的細胞膜，細胞器和小分子物質(zhì)，一方面幫助細胞把受損或 衰老的細胞器、細胞內(nèi)異物W及不再需要的生物大分子清除；另一方面也能夠為細胞內(nèi)細 胞器的構(gòu)建提供原料，即細胞結(jié)構(gòu)的重新再循環(huán)（He C，Klionsky DJ.Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy[J].Annu 民ev Genet,2009,43:67- 93.)。同時在應激或饑餓時也能為細胞提供生存必須的營養(yǎng)物質(zhì)^幫助細胞度過難關(guān) (Kuma A，et al.The role of autophagy during the early neonatal starvation period.NaUire，2004,432(7020) :1032-1036. )D自日籃的過度發(fā)生也可誘導細胞發(fā)生程序性 死亡，被稱為II型程序性細胞死亡(Xevine B，et al .Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.Dev Cell ,2004,6 (4) :463-477.)，與稠亡性程序性細胞死亡相似，自日籃性程序性細胞死亡是可被控制和調(diào)節(jié) 的，越來越受到腦缺血損傷防治研究人員的關(guān)注。有報道指出在不同的腦缺血損傷模型中， 包括缺氧-缺血（Li L，et al.Autophagy and hippocampal neuronal injury . Sleep Brea化，2014,18(2):243-249·和Hu Z，et al.Mechanism and Regulation of Autophagy and Its Role in Neuronal Diseases.Mol Neurobiol,2015,52(3): 1190-1209·)、局部 (Sheng 民，et al.Autophagy regulates endoplasmic reticulum stress in ischemic preconditioning. Autophagy ,2012,8(3) :310-325.)及全腦（Balduini W，et al.Autophagy in hypoxia-ischemia induced brain injury: evidence and speculations .Autophagy ,2009,5(2) :221-223.)缺血等，自日籃均被激活D在局部腦缺血損 傷中，缺血后大贏腦組織中自日籃的標志性蛋白Beclin-1和LC3n的表達明顯上升。在大贏大 腦中動脈閉塞模型(middle cerebral ai^tery occlusion，MCAO)中也觀察到紋狀體及海馬 區(qū)域中蛋白LC3n表達增加，自日籃小體數(shù)量增多，海馬和大腦皮質(zhì)中的Beclin-1表達也明顯 增加（Ginet V，et al.Enhancement of autophagic flux after neonatal cerebral hypoxia-ischemia and its region-specific relationship to apoptotic mechanisms.Am J Pathol ,2009,175(5): 1962-1974·)。盡管多項研究已證明腦缺血后自瞻 在神經(jīng)元中的活性增強，但是調(diào)節(jié)其活性的信號通路未完全明確（Carloni S，et al.Protective role of autophagy in neonatal hypoxia-ischemia induced brain inju巧.Neurobiol Dis，2008,32(3) :329-339.)。目前研究最多的是(：13331?131(/?邸^及 Class III PI3K/PKB途徑對自日籃的調(diào)控（Klionsky DJ，et al.Autophagy and P70S6kinase.Autophagy.2005;1(1):59-61.和Kamada Y，et al.Tor-mediated induction of autophagy via an Apgl protein kinase complex.J Cell Biol.2000；150(6):1507- 1513.)DClassIPI3K是自日籃的負調(diào)節(jié)分子，它可麟酸化麟酸麟脂醜肌醇4P(PtdIns 4P)和 PtdIns(4,5)P2,生成PtdIns(3,4)P2和？巾(11〇3(3,4,5作3，然后結(jié)合八1^/?拙和它的活化分 子PDK1，抑制自日籃的發(fā)生（Baehrecke EH.Autophagy:dual roles in life and death?Nat 民ev Mol Cell Biol .2005:6(6):505-510.和Klionsky DJ-Tlie molecular machinery of autophagy:unanswered questions.J Cell Sci.2005;118(Ptl):7-18.)。而Class III PI3K/PKB主要參與初期自日籃體的形成，促進自日籃。在生理狀態(tài)下，這種雙向調(diào)節(jié)能夠保持一 種動態(tài)平衡，自隧被維持在一定的水平，從而確保了細胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。但在應激條件下， 家族成員可能會失去運種對自隧的雙重調(diào)節(jié)作用，從而使自隧的水平上調(diào)或下調(diào)(Wen YD， et al.Neuronal injury in rat model of permanent focal cerebral ischemia is associated with activation of autophagic and lysosomal pathways.Autophagy， 2008,4(6):762-769·)。
[0004] 腦缺血缺氧后，神經(jīng)元損傷直接影響著腦缺血的發(fā)展、預后W及對治療的敏感性。 但自瞻在腦缺血損傷過程中到底對神經(jīng)元起保護還是損傷作用還存在爭議。有研究提示自 口籃在缺血缺氧早期對神經(jīng)元具有保護作用（Ginet V，et al .Enhancement of autophagic flux after neonatal cerebral hypoxia-ischemia and its region-specific relationship to apoptotic mechanisms .Am J Pathol，2009，175(5): 1962-1974.);亦有 證據(jù)表明，腦缺血后神經(jīng)元主要通過P13K/Akt途徑產(chǎn)生自日籃，促進神經(jīng)元的損傷(Wang JY， et al. Severe global cerebral ischemia-induced programmed necrosis of hippocampal CAl neurons in rat is prevented by3-methyladenine:a widely used inhibitor of autophagy.J Neuropathol Exp Neurol，2011，70(4):314-322.)。 Sadoshima等推測，自日籃激活的程度和特異性不同，可能對腦缺血后損傷的神經(jīng)元產(chǎn)生不同 的影響，輕至中度自瞻對缺血缺氧神經(jīng)元起保護作用，而重度自瞻則可導致神經(jīng)元死亡 (Liu C，et al.Autophagy and protein aggregation after brain ischemia.J Neurochem，2010,115( 1):68-78. )D因此，自日籃是把雙刃劍，既能將細胞內(nèi)的有害物質(zhì)清除， 維持神經(jīng)細胞的穩(wěn)定;又能引起細胞器的過度損傷甚至使神經(jīng)細胞死亡。只有進一步將腦 缺血損傷后自瞻的調(diào)控機制搞清楚，才能更加了解自瞻在哪些情況下具有神經(jīng)保護作用或 損傷作用，從而為防治腦缺血損傷W及尋找新的治療靴點提供更重要的理論依據(jù)。
[0005] 研究表明，腦^外組織中，轉(zhuǎn)錄因子FoxO在自日籃過程的信號轉(zhuǎn)導中起著非常重要 的作用dFoxO是For化ead家族中的一個亞群，是一種進化上高度保守的蛋白，可調(diào)節(jié)多種細 胞功能，包括分化，增殖，代謝和存活（Sadoshima J.The role of autophagy during ischemia/repei'fusion. Autophagy ,2008,4(4) :402-403 ·) D哺乳動物中包括四個FoxO成 員，F(xiàn)oxOl、Fox03a/Fox03、Fox04和Fox06(Xu F，et al.Neuronal autophagy in cerebral ischemia.Neurosci Bull,2012,28(5):658-666.和
[0006] Arico S, et al. The tumor suppressor PTEN positively regulates macroautophagy by inhibiting the phosphatidyl inositol 3-kinase/protein kinase B pathway.J Biol Chem，2001，276(38):35243-35246.)D它是膜島素/膜島素樣生長因子 (insulin/lnsulin-liLke growth factor，INS/IGF-l)信號通路中的關(guān)鍵分子（Sin組 A，et al. Harnessing the tumor suppressor function of FOXO as an alternative therapeutic approach in cancer.Curr Drug Targets，2011，12(9):1311-1321.)dFoxO 的活性可受麟酸化、乙醜化、亞基化和蛋白酶水解等方式調(diào)節(jié)，其中麟酸化是最主要的調(diào)節(jié) 方式。尸〇^0可^被各種激酶麟酸化，但是Akt對它的麟酸化是其中最重要的一種Dinsulin/ IGF受體的活化可激活麟脂醜肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt通路，PI3K途徑激活Akt進入細胞核， 導致FoxO從細胞核轉(zhuǎn)位至細胞漿，并被蛋白酶體降解，從而抑制FoxO轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性 (Kobayashi Y，et al.SI民Tlis critical relator of FOXO-mediated transcription in response to oxidative stress.Int J Mol Med.2005;16(2):237-243.)D研究發(fā)現(xiàn)，缺血 后化xO轉(zhuǎn)錄因子與DM結(jié)合能力增強，提示缺血后化xO活性增強，并誘導缺血神經(jīng)元調(diào)亡。 腦缺血損傷神經(jīng)細胞自隧可通過脫冬酶依賴和非依賴兩種途徑導致神經(jīng)元調(diào)亡，即自隧和 調(diào)亡兩者相互關(guān)耳關(guān)（Qin AP,et al .Mechanisms of lysosomal proteases participating in cerebral ischemia induced neuronal death.Neurosci Bull.2008;24(2):117-123. 和Uchiyama Y,et al.Autophagic neuron death in neonatal brain ischemia/ hypoxia.Auto地agy.2008;4(4):404-408.)。化如轉(zhuǎn)錄因子是否參與腦缺血再灌注損傷神 經(jīng)細胞自隧的調(diào)控呢？目前尚未見任何文獻報道。
[0007] 近年研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ox03是整個化xO家族最核屯、的成員，它參與并調(diào)節(jié)著其它家族成 員基因的表達（Zhu WL , et al. Forkhead box protein 03 transcription factor neg曰tively regul曰tes 曰utoph曰gy in hum曰n c曰ncer cells by inhibiting forkhe曰d box protein Olexpression and cytosolic accumulation.PLoS One,2014,9(12): ell5087.)。多項研究表明，F(xiàn)ox03能通過影響氨基酸的代謝從而在自隧的過程中起著直接 白勺作用（Chon邑 ZZ,et al .Activating Akt and the brain's resources to drive cellular survival and prevent inflammatory injury.Histol Histopathol,2005,20 (1): 299-315.) "Fox03轉(zhuǎn)錄因子是否參與腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細胞自隧的調(diào)控呢？目前 尚未見任何文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供轉(zhuǎn)錄因子化x〇3的新功能、新用途，即轉(zhuǎn)錄因子Fox03在制 備腦缺血再灌注保護神經(jīng)損傷藥物中的應用;本發(fā)明的另一目的也在于提供一種新的缺血 性腦卒中臨床治療手段。
[0009] 本發(fā)明中的轉(zhuǎn)錄因子i^xOSI^TYanscription factor Forldiead box 03)，基因序 列號 NM_001455。
[0010] 本發(fā)明著重探討轉(zhuǎn)錄因子化χ〇3對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細胞自隧相關(guān)蛋白表達 的影響；本發(fā)明構(gòu)建兩種過表達化χ〇3質(zhì)粒即野生型質(zhì)粒Wild type化x03(WT-Fox03)和持 續(xù)激活性質(zhì)粒constitutively active化說3(了1斗〇說3)并包裝成腺病毒Ad-WT-F'oxOS和 Ad-TM-Fox03調(diào)控化x03的表達，初步探討在0GD/R和MCA0/R損傷中化x03對自隧相關(guān)蛋白 LC3和Beclin-1表達的影響。本發(fā)明明確了化x03轉(zhuǎn)錄因子對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細胞自 隧相關(guān)蛋白表達的影響，為腦缺血損傷防治提供新思路、新途徑，為神經(jīng)保護劑的研究提供 新的祀點。
[0011] 本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)錄因子化X03在制備腦缺血再灌注保護神經(jīng)損傷藥物或保健品中 的應用。
[0012] 本發(fā)明可用于保護腦缺血再灌注中的神經(jīng)損傷，也可用于預防或治療腦缺血引起 的神經(jīng)損傷，進一步地用于預防或治療缺血性腦卒中。
[0013] 本發(fā)明設及的神經(jīng)損傷，優(yōu)選的，是指缺氧缺糖導致的神經(jīng)元細胞損傷。
[0014] 所述的保護神經(jīng)損傷，作用機制是通過化X03過表達來促進自隧相關(guān)蛋白的激活。
[0015] 進一步地，本發(fā)明提供了提高轉(zhuǎn)錄因子Fox03表達量的試劑在制備腦缺血再灌注 保護神經(jīng)損傷藥物或保健品中的應用。
[0016] 所述的提高轉(zhuǎn)錄因子Fox03表達量的試劑，包括但不限于：
[0017] 1)化X〇3J〇X〇3的編碼基因；
[001引 2)Fox03的過表達質(zhì)粒；
[0019] 3)含有化x03編碼基因的重組載體；
[0020] 4)含有化x03編碼基因的重組病毒；
[0021] 5)含有化x03編碼基因的重組病毒載體。
[0022] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述的藥物或保健品的活性成份為含有化X03編碼基因的慢病毒 載體或腺病毒載體。
[0023] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下：
[0024] 1.在GenBank中查詢目的基因 W及它的上下游的序列，用軟件VectorNTI進行引物 設計，然后交由公司合成引物。RT-PCR體外擴增目的基因。將表達載體pAdeno-EFl-B細- MCMV-EGFP-3FLAG用限制性內(nèi)切酶Nhel-HF和Afl Π 進行雙酶切。將目的基因片段和線性化 載體進行無縫克隆連接，從而構(gòu)建WT-Fox03和TM-Fox03質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)過大量擴增、抽提 W及純化后測序檢驗。
[00巧]2.應用AdMax系統(tǒng)在皿K293A細胞中包裝獲得重組腺病毒載體Ad-WT斗0x03和Ad- TM-FOX03，經(jīng)擴增、純化后進行滴度測定。
[00%] 3.通過感染復數(shù)(multiplicity of infection,M0I)預實驗確定Ad-WT-F'oxOS和 Ad-TM-Fox03感染HT22細胞的最佳感染條件。
[0027] 4.通過MTT比色法檢測細胞活力;Western blot檢測0GD/R損傷不同時間自隧相關(guān) 蛋白LC3，Beclin-l與Fox03蛋白的表達變化，建立穩(wěn)定的HT22細胞氧糖剝奪/復氧復糖 (0GD/R)損傷模型。
[002引 5.應用Ad-WT-Fox03和Ad-TM-Fox03感染HT22細胞后，Western blot和免疫巧光檢 測自隧相關(guān)蛋白LC3、Becl in-1和化x03蛋白的表達變化，評價化x03對0GD/R損傷后自隧相 關(guān)蛋白表達的影響。
[00巧]6.通過神經(jīng)功能評分、TTC染色和Western blot檢測Fox03蛋白和自隧相關(guān)蛋白 LC3，Bee 1 in-1的表達，建立大鼠大腦中動脈栓塞/再灌注(MCA0/R)損傷模型。
[0030] 7.側(cè)腦室注射Ad-WT-Fox03和Ad-TM-Fox03，MCA0/R損傷后，TTC染色和皿染色分別 觀察大鼠腦梗死面積與大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞的形態(tài)學改變;Western blot觀察MCA0/R 損傷后缺血半暗帶中自隧相關(guān)蛋白LC3，Beclin-l和化x03蛋白的表達變化，評價Fox03對 MCA0/R損傷后自隧相關(guān)蛋白表達的影響。
[0031] 本發(fā)明的實驗結(jié)果證實：
[0032] 1.HT22細胞感染Ad-WT-Fox03和Ad-TM-Fox03后，F(xiàn)ox03的表達增力日，促進了自隧相 關(guān)蛋白LC3和Becl in-1蛋白的表達，W感染Ad-TM-Fox03細胞增加更為顯著。
[0033] 2.建立大鼠缺血化復灌24h的損傷模型，Ad-WT斗0x03和Ad-TM-Fox03側(cè)腦室注射 后，F(xiàn)ox03的表達增加，促進了LC3和Beclin-1蛋白的表達，W注射Ad-TM-Fox03增加更為顯 著;大鼠腦缺血梗死面積減小;海馬CA1區(qū)錐體細胞排列素亂情況有所改善，提示化x03過表 達可促進自隧相關(guān)蛋白的激活，對腦缺血再灌注損傷有保護作用。
[0034] 3.本發(fā)明為腦缺血損傷防治提供新思路、新途徑，為神經(jīng)保護劑的研究提供新的 祀點。
【附圖說明】
[00對圖1:化x03目的基因序列的PCR擴增，A. WT-FOX03的瓊脂糖凝膠電泳；B. TM-FOX03 的瓊脂糖凝膠電泳;C. Marker。
[0036] 圖2:pAden〇-EFl-BGH-MCMV-EGFP-3FLAG 載體雙酶切，A.pAdeno-EFl-
[0037] BGH-MCMV-EGFP-3FLAG 瓊脂糖凝膠電泳;B. Marker。
[003引圖3:Fox03重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定，A.WT-FOX03的菌落PCR;B.TM-Fox03的菌落 PCR。
[0039] 圖4:重組腺病毒質(zhì)粒Ad-CMV-GFP轉(zhuǎn)染HEK293A細胞。
[0040] 圖5:重組腺病毒質(zhì)粒Ad-WT-Fox03轉(zhuǎn)染HEK293A細胞。
[0041 ] 圖6:重組腺病毒質(zhì)粒Ad-TM-Fox03轉(zhuǎn)染肥K293A細胞。
[0042] 圖7:重組腺病毒擴增。
[0043] 圖8:重組腺病毒的滴度測定。
[0044] 圖9:對照腺病毒感染HT22細胞。
[0045] 圖10:0GD損傷不同時間對HT22細胞活性的影響(**p<0.01，***p<0.001)。
[0046] 圖11: 0GD損傷不同時間后對HT22細胞中自隧相關(guān)蛋白LC3與Bee 1 in-1表達水平的 影響，A.自隧相關(guān)蛋白的表達;B-C.圖A的柱狀統(tǒng)計圖（*p<0.05，**p<0.01)。
[0047] 圖12: 0GD化，R不同時間后對HT22細胞中自隧蛋白LC3、Becl in-1及Fox03蛋白表達 水平的影響，A.自隧相關(guān)蛋白的表達;B.Fox03蛋白的表達;C-E.圖A與B的柱狀統(tǒng)計圖（**p< 0.01.*p<0.05.)。
[004引圖13:巧光顯微鏡觀察綠色巧光表達。
[0049] 圖14:Weste;rn blot檢測標簽蛋白HA表達結(jié)果。
[0050] 圖15:重組腺病毒對自隧相關(guān)蛋白表達的影響，A.自隧相關(guān)蛋白的表達;B. Fox03 蛋白的表達;C-E.圖A與B的柱狀統(tǒng)計圖（*p<0.05，**p<0.01)。
[0051 ]圖16:免疫巧光檢測0GD/R后自隧標志物LC3的表達影響。
[0052]圖17:大腦中動脈栓塞模型后大鼠腦TTC染色后的變化。
[0化3] 圖18:缺血化，復灌不同時間對缺血半暗帶中自隧相關(guān)蛋白LC3，Beclin-1和化x03 蛋白表達的影響，A.自隧相關(guān)蛋白的表達;B.Fox03蛋白的表達C-E.圖A與B的柱狀統(tǒng)計圖（* p<0.05,**pi<0.01)。
[0054] 圖19:側(cè)腦室注射過表達腺病毒質(zhì)粒后對半影區(qū)域中自隧蛋白LC3，Beclin-l及 Fox03蛋白表達水平的影響，A.自隧相關(guān)蛋白的表達;B. Fox03蛋白的表達;C-E.圖A與B的柱 狀統(tǒng)計圖（卸<0.05，**p<0.01)。
[0055] 圖20:TTC染色觀察側(cè)腦室注射過表達腺病毒后，MCA0/R損傷后大鼠腦梗死面積的 變化。
[0056] 圖21:肥染色后，海馬CA1區(qū)錐體細胞的形態(tài)學改變。
[0化7]圖 22:實施例所用載體 pAden〇-EFl-BGH-MCMV-EGFP-3FLAG 質(zhì)粒圖。
【具體實施方式】
[0058]現(xiàn)結(jié)合實施例和附圖，對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。下列實 施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0059] 實施例1:.轉(zhuǎn)錄因子Fox03過表達腺病毒載體的構(gòu)建
[0060] 1.FOX03目的基因的克隆
[0061 ] W人化x03的cDNA(基因序列號NM_001455)為模板，P1為引物(表1)進行目的片段 的PCR擴增，1 %的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物，得到約2098bp的特異性擴增條帶，與 目的條帶大小相符（圖1A);WWT-Fox03基因為模板，分別^口2^3，口4，口5為引物(表1)進行 目的片段的PCR擴增，得到特異性擴增條帶：169bp的片段a，666bp的片段b，22化P的片段C和 1098bp的片段d，與目的條帶大小相符(圖1B)。
[00創(chuàng)表1基因克隆引物
[0063]
[0065] 特異性擴增條帶：
[0066] 16抓9的片段日，序列如沈9 10備：13所示；
[0067] 66669的片段6，序列如沈9 10備:14所示；
[006引 2256口的片段(3，序列如沈9 10備：15所示；
[0069] 109869的片段(1，序列如沈9 10備:16所示。
[0070] 2. pAden〇-EFl-BGH-MCMV-EGFP-3FLAG 載體的雙酶切
[0071] 所用的表達載體為H215pAden〇-EFl-B細-MCMV-EGFP-3化AG，購自和元生物技術(shù) (上海)有限公司，質(zhì)粒圖譜如圖22所示，酶切位點為化e I-HF和Afl II。
[0072] 按表2配制反應體系，混勻，37°C水浴中解育化W上。
[0073] 利用限制性內(nèi)切酶Nhel-HF和An Π 對表達載體進行雙酶切，酶切產(chǎn)物進行1 %的 瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，結(jié)果在5000-6000bp之間觀察到與酶切產(chǎn)物預期大小相符 的條帶（圖2)。
[0074] 表2雙酶切反應體系
[0075]
[0076] 3 .Fox03 重組質(zhì)粒 WT-FOX03 和 TM-FOX03 的菌落 PCR 鑒定
[0077] (1)連接反應
[0078] 按表3配制反應體系，將目的基因片段和線性化載體W摩爾比1:1加到離屯、管中， 使用無縫克隆試劑盒進行重組反應。
[0079] 表3連接反應體系
[0080]
[0081 ]混勻后在37°C解育30min，然后轉(zhuǎn)移至冰上放置5min，直接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中。
[0082] (2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌
[0083] 取100μΙ感受態(tài)細菌在冰上解凍，每管加質(zhì)粒載體(體積《10μ1，DNA《50ng)，輕彈 W混勻內(nèi)容物，在冰上放置30min。
[0084] 將EP管放到預加溫到42°C的循環(huán)水浴中的浮板上，放置90s-2min，不要搖動EP管。
[0085] 快速將EP管轉(zhuǎn)移到冰浴上，使細菌冷卻l-2min。
[0086] 每離屯、管加不含抗菌素的40化1 LB培養(yǎng)基，事先用水浴鍋將培養(yǎng)基加溫到37°C， 然后將管轉(zhuǎn)移到37Γ搖床上，溫育45min至比使細菌復蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性 標記基因。
[0087] 將適當體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細菌涂布到含有相應抗生素抗性（lOOug/ml的終濃 度）的LB固體培養(yǎng)基上旋轉(zhuǎn)均勻涂布直至有發(fā)澀的感覺，即讓平板干燥，然后倒置平皿，于 37°C培養(yǎng)，12-1化后可出現(xiàn)菌落。
[0088] (3)菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子
[0089] 挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子重懸于10μ1 LB培養(yǎng)液中，取化1作為模板進行菌落PCR 鑒定。
[0090] 結(jié)果顯示在75化p-lkb之間觀察到與目的基因大小相符的條帶（圖3)。菌落鑒定得 到的陽性克隆，經(jīng)測序公司測序驗證正確。
[0091] 4.重組腺病毒Ad-WT-Fox03和Ad-TM-Fox03的包裝、擴增與純化
[0092] 對照質(zhì)粒、重組質(zhì)粒WT-FOX03和TM-FOX03用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胚腎皿K293A細胞，包 裝產(chǎn)生重組腺病毒 Ad-CMV-GFP、Ad-WT-Fox03 和 Ad-TM-Fox03。
[0093] 轉(zhuǎn)染4她后可在巧光顯微鏡下觀察到綠色巧光;轉(zhuǎn)染后約lld，細胞觸角逐漸消失 并膨脹變圓，呈串珠樣改變且部分細胞開始懸浮;轉(zhuǎn)染后第18加寸觀察，肥K293A細胞大量飄 落，細胞已經(jīng)完全病變（圖4-6)。擴增病毒并于巧光顯微鏡下觀察巧光表達情況，可見大量 綠色巧光（圖7)，凍融法收集病毒。重組腺病毒經(jīng)擴增、純化后檢測病毒滴度，本次實驗在顯 微鏡下5個視野中計算的陽性細胞平均數(shù)分別為8、8、6,此孔病毒稀釋了 107倍，根據(jù)W下病 毒滴度公式得出：
[0094] 病毒滴度二每孔陽性細胞數(shù)X每孔視野數(shù)X病毒稀釋的倍數(shù)/0.1ml
[0095] Ad-WT-Fox03病毒滴度為6.32 X l〇iD(I化/ml)，Ad-TM-Fox03病毒滴度為4.0 X l〇w (Ifu/ml)，Ad-CMV-GFP病毒滴度為4.4 X 1〇11 (Ifu/ml)(如圖8所示）。
[0096] 實施例2:過表達Fox03對0GD/R損傷HT22細胞自隧相關(guān)蛋白表達的影響
[0097] 1.感染復數(shù)(M0I)值的確定
[009引分別采用M0I值為50，200，500，1000感染HT22細胞，結(jié)果可見，當M0I為50，200， 500，1000時，感染效率分別為50%，75%，85%，95%，在M0I為500和1000時感染效率最高， 但M0I為1000時，細胞損傷較大。W感染效率高、M0I值低、對細胞毒性小為依據(jù)，本實驗選擇 M0I值200-500之間進行后續(xù)實驗（圖9)。
[0099] 2.HT22細胞0GD/R模型的建立
[0100] (1 )0GD損傷不同時間對HT22細胞活性的影響
[0101] MTT比色法檢測氧糖剝奪不同時間對HT22細胞活性的影響。W正常對照組細胞活 力為100 %，計算出其他各組細胞存活百分率。結(jié)果表明，與正常組相比，0GD 0.5h，化，2h， 4h，6h，化的細胞活力分別降為81.46% ,68.76% ,49.75% ,20.98% ,14.79%和9.87% (圖 10)，呈明顯的時間依賴性。
[0102] (2)Western blot檢測0GD損傷不同時間對HT22細胞自隧相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1 表達的影響
[0103] Western blot檢測結(jié)果表明，與正常對照組相比，0GD損傷0.化后，LC3蛋白表達水 平顯著增高(P<〇.05)，并在氧糖剝奪化時達到頂峰(p<0.01)，隨后降低;Beclin-1蛋白表達 在損傷0.化后略有升高，在氧糖剝奪化時達到高峰，與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<〇. 01)。 結(jié)合Μ?Τ檢測結(jié)果，我們選擇0GD化進行后續(xù)實驗（圖11)。
[0104] (3)Western blot檢測0GD 2h，再灌注不同時間對HT22細胞自隧相關(guān)蛋白LC3， Becl in-1和化x03蛋白表達的影響
[01化]Western blot檢測結(jié)果表明，與正常對照組相比，0GD/R損傷后LC3蛋白表達水平 顯著升高，且在復氧化時達到高峰，有明顯的統(tǒng)計學意義(P<〇.01);隨后1X3表達水平降低 直到復氧2地時，與正常對照組相比，無統(tǒng)計學差異(p〉0.05);相似的，Beclin-1表達水平在 0GD/R損傷后也明顯升高，并在復氧化時達到高峰，與正常對照組相比，有明顯的統(tǒng)計學意 義(p<0.01)。但是，與對照組相比，在0GD/R損傷后，F(xiàn)ox03的表達水平略有升高，差異無統(tǒng)計 學意義(p〉〇. 05)。因此我們的后續(xù)實驗選擇0GD/R損傷后自隧達到峰值時即0GD2h/R化進 行（圖12)。
[0106] 3.重組腺病毒感染HT22細胞的效果
[0107] 將細胞分為4組：空白對照組、Ad-CMV-GFP、Ad-WT-Fox03和Ad-TM-Fox03。為驗證重 組腺病毒是否成功感染HT22細胞，本發(fā)明分別用巧光顯微鏡觀察巧光表達情況，Western blot檢測標簽蛋白HA的表達兩種方法檢測重組腺病毒感染HT22細胞的感染效果。
[0108] (1)巧光顯微鏡觀察巧光表達
[0109] 利用過表達腺病毒和對照腺病毒中含有綠色巧光標記運一特點，本發(fā)明采用巧光 顯微鏡觀察巧光表達初步判斷腺病毒感染的效果。圖為腺病毒感染HT22細胞后的巧光觀察 結(jié)果：巧光顯微鏡下可見Ad-WT-Fox03、Ad-TM-Fox03組和Ad-CMV-GFP組中有大量綠色巧光， 而空白對照組中未見巧光，說明重組腺病毒成功感染了 HT22細胞(圖13)。
[0110] (2)Weste;rn blot檢測標簽蛋白HA表達
[0111] 為更進一步證明重組腺病毒是否成功感染HT22細胞，本發(fā)明利用Ad-WT斗0x03和 Ad-TM-Fox03攜帶HA標簽的特性，用Western blot檢測HT22細胞中HA蛋白的表達，圖為 Western blot檢測結(jié)果。Ad-WT-Fox03和Ad-TM-Fox03，其大小約為2022bp，與HA融合后預測 對應蛋白大小約為75kDa，在感染Ad-WT-Fox03和Ad-TM斗0x03的細胞免疫印跡檢測中可見 清晰條帶，與預期相符，而未感染重組腺病毒與感染對照腺病毒的細胞免疫印跡檢測中沒 有出現(xiàn)條帶，證明重組腺病毒成功感染HT22細胞(圖14)。
[0112] 4.Western blot檢測重組腺病毒感染HT22細胞對0GD/R損傷中自隧相關(guān)蛋白表達 的影響
[0113] 本發(fā)明已證明Ad-WT-Fox03和Ad-TM-Fox03成功感染HT22細胞，那么腺病毒感染 HT22細胞對0GD/R損傷中自隧相關(guān)蛋白表達會有怎樣的影響呢？
[0114] 本實驗將細胞分為5組:空白對照組、0GD/R損傷組、Ad-CMV-GFP+OGD/R損傷組、Ad- WT-Fox03+0GD/R 損傷組和 Ad-TM-Fox03+0GD/R 損傷組。
[0115] Western blot結(jié)果表明，Ad-WT-化X03+0GD/R損傷組和Ad-TM-Fox03+0GD/R損傷組 中化x03表達比0GD/R損傷組明顯增強（p<0.01);與0GD/R損傷組相比，Ad-WT-Fox03+0GD/R 損傷組和Ad-TM-Fox03+0GD/R損傷組中自隧相關(guān)蛋白LC3，Beclin-l表達水平上升，有統(tǒng)計 學差異(p<〇.01)，說明增強化X03的轉(zhuǎn)錄活性可促進自隧相關(guān)蛋白的表達。同時，研究還發(fā) 現(xiàn)Ad-TM-Fox03+0GD/R損傷組中自隧相關(guān)蛋白的表達比Ad-WT-Fox03+0GD/R損傷組高，但經(jīng) 分析沒有統(tǒng)計學差異(P〉〇. 05)(圖15)。
[0116] 5.免疫巧光檢測重組腺病毒感染HT22細胞對0GD/R損傷后自隧標志物LC3的影響
[0117] 腺病毒感染HT22細胞，0GD化/R化后，免疫巧光觀察LC3表達情況。正常狀態(tài)下， LC3蛋白彌散在胞漿中；自隧形成時，LC3蛋白轉(zhuǎn)位至自隧體膜，在巧光顯微鏡下形成多個明 亮的紅色巧光斑點，一個斑點相當于一個自隧體，可W通過計數(shù)來評價自隧活性的高低。巧 光顯微鏡下觀察，可見對照組中細胞核為淺藍色，呈圓形或楠圓形，幾乎沒有明亮的紅色巧 光斑點，說明在正常情況下LC3表達水平較低；而在損傷組中，細胞核濃染，皺縮變小，部分 核呈現(xiàn)碎塊狀濃染，紅色巧光斑點增多，說明LC3表達在0GD/R損傷后升高。且在Ad-WT- 化X03+0GD/R損傷組和Ad-TM-Fox03+0GD/R損傷組中，紅色巧光斑點明顯增多，說明LC3表達 進一步增強。免疫巧光結(jié)果表明過表達Fox03可促進自隧，與western blot結(jié)果一致（圖 16)。
[0118] 實施例3:過表達Fox03對大鼠 MCA0/R損傷腦組織自隧相關(guān)蛋白表達的影響
[0119] 1.大鼠 MCA0/R模型的建立
[0120] (1)行為學觀察
[0121] 腦缺血前大鼠生命體征正常，呈清醒狀態(tài)。缺血后Imin內(nèi)即失去知覺和活動能力， 翻正反射消失，四肢呈僵直狀態(tài)，痛覺消失，雙側(cè)瞳孔散大，同時對強光刺激閉險反射消失， 眼球顏色為灰白色(正常為鮮紅色）。再灌注后眼球顏色立即恢復紅色，瞳孔回縮。且大鼠清 醒后，右側(cè)出現(xiàn)化rner綜合征即右側(cè)眼裂變小，瞳孔縮小；左側(cè)偏擁，W左前肢最為明顯，提 尾懸拉后左前肢騰縮屈曲或被動型過度伸展，同時出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈跌倒。
[0122] (2)TTC染色觀察
[0123] 正常腦組織染色后呈紅色，而缺血再灌注損傷后梗死部位則呈白色，圖17表明我 們成功建立了MCA0/R模型（圖17)。
[0124] 2. Western blot檢測大鼠缺血化，再灌注不同時間對缺血半暗帶中自隧相關(guān)蛋白 LC3，Beclin-l和化x03蛋白表達的影響
[01巧]Western blot結(jié)果表明，MCA0/R損傷后，缺血半暗帶中LC3蛋白表達水平隨復灌時 間的延長而顯著增加，并在復灌2地時達到高峰，與假手術(shù)組相比，有統(tǒng)計學差異(p<0.01); 同樣的，在MCA0/R損傷后，Beclin-1的表達水平也隨著復灌時間的延長而升高且在復灌24h 時達到高峰，與假手術(shù)組相比，有統(tǒng)計學意義(P<〇.01)。但是，與假手術(shù)組相比，F(xiàn)ox03的表 達水平在MCA0/R損傷后比較差異無統(tǒng)計學意義(p〉0.05)(圖18)。
[01%] 因此我們選擇MCA0/R損傷后自隧達到峰值的時間即缺血化，再灌注2地進行后續(xù) 實驗。
[0127] 3.Western blot檢測側(cè)腦室注射腺病毒對MCA0/R損傷中缺血半暗帶的自隧相關(guān) 蛋白LC3，Becl in-1和化x03蛋白表達的影響
[0128] 本發(fā)明已證實過表達化x03使0GD/R損傷中神經(jīng)元自隧相關(guān)蛋白LC3與Becl in-1的 表達升高，那么在體內(nèi)過表達化x〇3對自隧相關(guān)蛋白有怎樣的影響呢？
[0129] 本實驗用側(cè)腦室注射腺病毒的方法對運一問題進行探討。將大鼠隨機分為5組:假 手術(shù)組、MCA0/R 損傷組、Ad-CMV-GFP+MCAO/R 損傷組、Ad-WT-Fox03+MCA0/R 損傷組和 Ad-TM- Fox03+MCA0/R 損傷組。
[0130] Western blot結(jié)果表明，與MCA0/R損傷組相比，Ad-WT-Fox03+MCA0/R損傷組和Ad- TM-FOX03+MCA0/R損傷組中自隧相關(guān)蛋白LC3與Beclin-1表達水平升高，有統(tǒng)計學差異(p< 0.01)，結(jié)果與體外模型一致，說明增強化x03的活性可促進自隧相關(guān)蛋白的表達。且Ad-TM- FOX03+MCA0/R損傷組中自隧相關(guān)蛋白的表達比Ad-WT-Fox03+MCA0/R損傷組高，經(jīng)分析兩者 之間無統(tǒng)計學差異(P〉〇.〇5)(圖19)。
[0131] 4.TTC染色觀察側(cè)腦室注射腺病毒后MCA0/R損傷中大鼠腦梗死面積的變化
[0132] TTC染色結(jié)果表明，與MCA0/R損傷組相比，Ad-WT-Fox03+MCA0/R損傷組和Ad-TM- Fox03+MCA0/R損傷組中大鼠腦梗死面積明顯減小，且Ad-TM-Fox03+MCA0/R損傷組梗死面積 比Ad-WT-Fox03+MCA0/R損傷組?。▓D 20)。
[013引5.肥染色觀察側(cè)腦室注射腺病毒后MCA0/R損傷對海馬CA1區(qū)錐體細胞的形態(tài)影響
[0134] 肥染色結(jié)果顯示，光鏡下假手術(shù)組中可見海馬CA1區(qū)錐體細胞排列整齊，高倍鏡下 可見錐體細胞核大而圓、核仁明顯;MCA0/R損傷組中，海馬CA1區(qū)錐體細胞出現(xiàn)異常變化，排 列素亂，細胞體積縮小，核不規(guī)則。但Ad-WT-Fox03+MCA0/R損傷組和Ad-TM-Fox03+MCA0/R損 傷組中，海馬CA1區(qū)錐體細胞排列素亂情況得到改善(圖21)。
[0135] 本發(fā)明通過對照腺病毒感染HT22細胞實驗，確定了腺病毒感染HT22細胞的最佳 M0I值。本發(fā)明構(gòu)建的過表達腺病毒載體帶有GFP和HA標簽，通過觀察巧光表達及檢測HA蛋 白表達兩種方法證明過表達腺病毒成功感染了 HT22細胞。結(jié)果顯示，過表達化x03使自隧相 關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達加強;免疫巧光染色發(fā)現(xiàn)在過表達化x03后，自隧標志物LC3的 表達明顯增強，與蛋白表達結(jié)果一致。
[0136] 本發(fā)明選擇線栓法進行MCA0模型的操作。行為學觀察與TTC染色結(jié)果表明本發(fā)明 建立的缺血再灌注損傷模型成功。研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注損傷后，自隧相 關(guān)蛋白LC3和Beclin-1表達升高且在缺血化，再灌注2地時達到最高，而化x03總蛋白表達無 明顯改變。研究發(fā)現(xiàn)，自隧對早期的腦缺血再灌注損傷有保護作用。因此本實驗選擇缺血 2h，再灌注24h進行后續(xù)實驗。為保證過表達腺病毒能通過血腦屏障到達腦內(nèi)并直接作用于 腦缺血再灌注損傷灶，本發(fā)明選擇側(cè)腦室注射過表達腺病毒進行后續(xù)實驗。結(jié)果表明，過表 達化x03使自隧相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達加強，且Ad-TM-Fox03比Ad-WT-Fox03更能促 進自隧相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達，但兩者之間無統(tǒng)計學差異(p〉0.05);缺血再灌注損 傷后，行為學觀察發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射過表達腺病毒后，與缺血再灌注損傷組相比，大鼠右側(cè)眼 裂變大，Horner綜合征狀明顯減輕，提尾懸拉后左前肢騰縮屈曲程度減輕;且研究還發(fā)現(xiàn)， 促進自隧后大鼠腦損傷程度減小，說明在短時間內(nèi)自隧的增強對腦缺血再灌注損傷有保護 作用。
[0137] 綜上所述，過表達Fox03轉(zhuǎn)錄因子能促進腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細胞自隧相關(guān)蛋 白的表達，運一發(fā)現(xiàn)有助于我們更加深入了解化x〇3轉(zhuǎn)錄因子在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮 的作用，為腦缺血損傷防治提供新思路、新途徑，為神經(jīng)保護劑的研究開發(fā)提供新的祀點。
[0138] W上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù) 人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，運些變 化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其 等同物界定。
【主權(quán)項】
1. 轉(zhuǎn)錄因子F〇x〇3在制備腦缺血再灌注保護神經(jīng)損傷藥物或保健品中的應用。2. 轉(zhuǎn)錄因子Fox03在制備預防或治療缺血性腦卒中藥物或保健品中的應用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子Fox03在制備腦缺血再灌注保護神經(jīng)損傷藥物或保 健品中的應用，其特征在于，所述的神經(jīng)損傷是指缺氧缺糖導致的神經(jīng)元細胞損傷。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子Fox03在制備腦缺血再灌注保護神經(jīng)損傷藥物或保 健品中的應用，其特征在于，所述的保護神經(jīng)損傷是通過Fox03過表達來促進自噬相關(guān)蛋白 的激活。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子Fox03在制備腦缺血再灌注保護神經(jīng)損傷藥物或保 健品中的應用，其特征在于，所述的藥物或保健品為提高轉(zhuǎn)錄因子Fox03表達量的試劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)錄因子Fox03在制備腦缺血再灌注保護神經(jīng)損傷藥物或保 健品中的應用，其特征在于，所述的提高轉(zhuǎn)錄因子Fox03表達量的試劑選自以下任一： a) Fox03、Fox03的編碼基因； b) Fox03的過表達質(zhì)粒； c) 含有Fox03編碼基因的重組載體； d) 含有Fox03編碼基因的重組病毒； e) 含有Fox03編碼基因的重組病毒載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子Fox03在制備腦缺血再灌注保護神經(jīng)損傷藥物或保 健品中的應用，其特征在于，所述的藥物或保健品的活性成份為含有Fox03編碼基因的慢病 毒載體或腺病毒載體。
【文檔編號】A61K48/00GK105920617SQ201610410833
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】陳霞, 吳曉燕, 周宏智, 劉愛芬
【申請人】南通大學