用于從微生物細胞獲得微生物油的方法

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用于從微生物細胞獲得微生物油的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及從細胞獲得脂質的方法，其是通過裂解該細胞以形成裂解的細胞組合物，以及從去乳化裂解的細胞組合物獲得該脂質。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法所制備的脂質。本發(fā)明還涉及具有特定的茴香胺值、過氧化物值，和/或磷含量的微生物脂質。
【專利說明】用于從微生物細胞獲得微生物油的方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求申請日為2013年12月20日的美國臨時申請No.61/918,922的申請日權益，其公開內容在此通過提述并入。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，所述方法通過裂解所述細胞以形成裂解細胞組合物，然后從所述裂解細胞組合物回收該油。本文還公開了包含一種或多種PUFA的微生物油，所述PUFA是通過本發(fā)明所述的至少一種方法從微生物細胞回收的。
[0005] 含有一種或多種PUFA的微生物油是由微生物所生產，如，例如，藻類及真菌。
[0006] 從微生物細胞獲得含PUFA的油的通常方法涉及:使能夠生產所需的油的微生物在發(fā)酵器、池或生物反應器中生長以產生微生物細胞生物質(biomass);從所述生物質生長的發(fā)酵培養(yǎng)基分離該生物質;干燥該微生物細胞生物質，使用不與水互溶的有機溶劑(例如己烷)從該干燥的細胞提取所述油；以及從所述油去除該有機溶劑(例如己烷）。此方法還可以涉及用水稀釋含有所述細胞生物質的該發(fā)酵培養(yǎng)基，然后進行離心以從經稀釋的發(fā)酵培養(yǎng) 基分離所述生物質。
[0007] 從微生物細胞獲得含PUFA的油的另一種方法涉及:使能夠生產所需的油的微生物在發(fā)酵器、池或生物反應器中生長以產生微生物細胞生物質；通過使用機械力（例如均質化）、酶處理、或化學處理破壞細胞壁而將所述含PUFA的油釋放至該細胞生長的發(fā)酵培養(yǎng)基中；以及用與水混溶的有機溶劑(例如異丙醇)從所得的組合物(其包含含有PUFA的油、細胞碎片和液體）回收該油。可以從該組合物機械地分離所述油，并且必須從所述油和水性生物質廢物流二者去除醇。
[0008] 上述任一項從微生物細胞獲得含PUFA的油的方法的工業(yè)規(guī)模利用，需要使用大量的揮發(fā)性且可燃的有機溶劑，這產生了危險的操作條件且需要使用昂貴的防爆設備。此外，使用有機溶劑會產生有機溶劑廢物流，其需要執(zhí)行昂貴的溶劑回收工藝以解決對于揮發(fā)性有機化合物(VOC)排放的嚴格環(huán)境限制，這又導致需要更多的人力以及昂貴的設備。
[0009] 并且，上述方法中使用熱來干燥細胞和/或從回收的油去除溶劑可降解含PUFA的油且增加能源的使用，這可進一步增加加工成本。當含PUFA的油暴露于氧時(如當微生物細胞壁的完整性被破壞時)和/或微生物細胞暴露于熱時，發(fā)生降解。
[0010] 用于從微生物細胞獲得含PUFA的油的無溶劑方法涉及:使能夠生產所需的油的微生物在發(fā)酵器、池或生物反應器中生長，以產生微生物細胞生物質;通過使用機械力（例如均質化）、酶處理、或化學處理破壞細胞壁而將所述含PUFA的油釋放至該細胞生長的發(fā)酵培養(yǎng)基中；以及通過提升PH、添加鹽、加熱，和/或攪拌所得的組合物而從所得的組合物（其包含含有PUFA的油、細胞碎片和液體）回收粗制油。然而，此種從細胞獲得含PUFA的油的無溶劑方法可需要長的油回收時間、大量的鹽，和/或許多步驟，其都能增加加工成本。
[0011]結果，仍然需要一種用于從微生物細胞獲得高質量的含PUFA的油的方法，其不使用揮發(fā)性有機溶劑、可以使用容易得到的設備進行、需要最小數(shù)目的步驟、具有更短的油回收時間，并且能提供高質量的含PUFA的油的高產量/收率(yield)。
[0012] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括降低所述裂解細胞組合物的pH)以形成去乳化的裂解細胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離該油；以及(d)回收該油；
[0013] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括將裂解細胞組合物的pH降低至約6或更低）以形成去乳化的裂解細胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離該油；以及(d)回收該油。
[0014] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括通過添加按重量計裂解細胞組合物的約0.5% 至約20%的量的酸來降低裂解細胞組合物的pH)以形成去乳化的裂解細胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離該油；以及(d)回收該油。
[0015] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括將裂解細胞組合物的pH降低至約6或更低）以形成去乳化的裂解細胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離該油；以及(d)回收該油，其中（a)或(b)的至少一個還包括將該組合物加熱到至少70°C的溫度。
[0016] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括通過添加按重量計裂解細胞組合物的約0.5% 至約20%的量的酸來降低裂解細胞組合物的pH)以形成去乳化的裂解細胞組合物；（c)所述去乳化的裂解細胞組合物分離該油；以及(d)回收該油，其中(a)或(b)的至少一個還包括將該組合物加熱到至少70°C的溫度。
[0017] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括添加酸以降低裂解細胞組合物的pH至約6或更低并攪拌所述裂解細胞組合物）以形成去乳化的裂解細胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離該油；以及(d)回收該油。
[0018] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括降低裂解細胞組合物的pH)以形成去乳化的裂解細胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離該油；以及(d)回收該油，其中將 (a)及(b)組合在一起以形成一步裂解及去乳化步驟。
[0019] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化以形成去乳化的裂解細胞組合物；（C)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離該油；以及(d)回收該油，其中將(a)及(b)組合在一起以形成一步裂解及去乳化步驟，其包括提升pH。
[0020]本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)在適于形成去乳化的裂解細胞組合物的pH處裂解包含所述微生物油的細胞；（b)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離該油；以及(C)回收該油，其中所述去乳化的裂解細胞組合物是在裂解過程中獲得的。
[0021 ]本文公開了通過本文所述方法的任一種獲得的微生物油。
[0022]多不飽和脂肪酸(PUFA)是根據(jù)距脂肪酸的甲基端的第一個雙鍵的位置來分類的； ω -3 (n-3)脂肪酸在第三個碳上含有第一個雙鍵，而ω -6 (n-6)脂肪酸在第六個碳上含有第一個雙鍵。例如，二十二碳六烯酸（"DHA"）是一種鏈長為22個碳并有6個雙鍵的ω -3長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，通常稱為"22: 6η-3"。在一個實施方案中，PUFA選自ω -3脂肪酸、 ω-6脂肪酸，及其混合物。在另一個實施方案中，PUFA選自LC-PUFA。在又一個實施方案中， PUFA選自二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸 (ARA)、γ -亞麻酸(GLA)、二高-γ -亞麻酸(DGLA)、十八碳四稀酸（stearidonic acid,SDA)，及其混合物。在另一個實施方案中，PUFA選自DHA、ARA，及其混合物。在又一個實施方案中， PUFA是DHA。在又一個實施方案中，PUFA是ARA。
[0023] LC-PUFA是含有至少3個雙鍵且具有18個或更多個碳或是20個或更多個碳的鏈長的脂肪酸。ω-6系列的LC-PUFA包括但不限于二高-γ-亞麻酸（C20:3n-6)、花生四烯酸 (C20:4n-6)( "ARA"）、二十二碳四稀酸或腎上腺酸(adrenic acid) (C22:4n-6)，以及二十二碳五烯酸(C22: 5n-6) ( "DPA n-6"）。ω-3系列的LC-PUFA包括但不限于二十碳三烯酸(C20: 311-3)、二十碳四烯酸（020:411-3)、二十碳五烯酸（020 :511-3)(1?^)、二十二碳五烯酸 (C22:5n-3)，以及二十二碳六烯酸(CSSin-S)13LC-PUFA還包括具有大于22個碳以及4個或更多個雙鍵的脂肪酸，包括但不限于C24:6(n-3)與C28:8(n-3)。
[0024] PUFA可以為如下形式：游離脂肪酸、鹽、脂肪酸酯（例如甲酯或乙酯）、單酰甘油 (MAG)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)，和/或磷脂(PL)。
[0025] 高度不飽合脂肪酸(HUFA)是含有4個或更多個不飽和碳-碳鍵的ω -3和/或ω -6多不飽和脂肪酸。
[0026] 如本文所用的，"細胞"意指一種含油生物材料，如源自油質微生物的生物材料。由微生物生產的或從微生物細胞獲得的油稱為"微生物油"。由藻類和/或真菌所生產的油還分別稱為藻類油和/或真菌油。
[0027] 如本文所用的，"微生物細胞"或"微生物"意指生物體，例如藻類、細菌、真菌、原生生物、酵母，及其組合，例如單細胞生物。在一些實施方案中，微生物細胞是真核細胞。微生物細胞包括但不限于金藻(例如不等鞭毛類(Stramenopi Ies)界的微生物]、綠藻、娃藻類、溝鞭藻類（dinof lagel Iates)(例如溝鞭藻（Dinophyceae)目的微生物，包括隱甲藻 (Crypthecodinium)屬的成員，如例如，寇氏隱甲藻（Crypthecodini um cohnii或 C.cohnii));破囊壺菌目（Thraustochytriales)的微藻類;酵母(子囊菌類或擔子菌類），以及毛霉屬（Mu cor)和被孢霉屬（Mortierella)的真菌，包括但不限于高山被孢霉 (Mortierella alpina)及施穆克被抱霉（Mortierella sect · schmuckeri )，以及腐霉屬 (Pythium)，包括但不限于詭譎腐霉(Pythium insidiosum) 〇
[0028] 在一個實施方案中，微生物細胞來自被孢霉屬、隱甲藻屬，或是破囊壺菌目。在又一個實施方案中，微生物細胞來自寇氏隱甲藻。在又一個實施方案中，微生物細胞選自寇氏隱甲藻、高山被孢霉、破囊壺菌屬、裂殖壺菌(Sch i z 〇 chy tr i um)屬，及其混合物。
[0029] 在又一個實施方案中，微生物細胞包括但不限于屬于以下的微生物:被孢霉屬、耳霉屬(Conidiobolus)、腐霉屬、疫霉屬(Phytophthora)、青霉屬(PeniciIlium)、枝孢霉屬 (Cladospori um)、毛霉屬、鐮孢屬（Fusar ium)、曲霉屬（Aspergillus)、紅酵母屬 (Rhodotorula)、蟲霉屬（Entomophthora)、刺抱囊霉屬（Echinosporangium)，以及水霉屬 (Saprolegnia)。在另一個實施方案中，ARA獲取自微生物細胞，所述微生物細胞來自被孢霉屬，包括但不限于長孢被孢霉（MortiereIla elongata)、微小被孢霉（Mortierel Ia exigua)、喜濕被孢霉（Mortierella hygrophila)、高山被孢霉、施穆克被孢霉 (Mortierella schmuckeri)，以及小被抱霉(Mortierella minutissima)。在另一個實施方案中，ARA獲取自微生物細胞，所述微生物細胞來自：長孢被孢霉IF08570、微小被孢霉 IF08571、喜濕被孢霉 IF05941、高山被孢霉 IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、 CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、和 CBS754.68,及其突變體。在又一個實施方案中，微生物細胞來自高山被孢霉。
[0030] 于更進一步中，微生物細胞是來自破囊壺菌目（Thraustochytriales)的微藻，其包括但不限于破囊壺菌屬(Thraustochytrium)(物種包括arudimentale、金黃色破囊壺菌 (aureum)、benthicola、球破囊壺菌(globosum)、金尼破囊壺菌(kinnei)、動孢破囊壺菌 (111〇1：；^11111)、多增殖性破囊壺菌(1]11111：；[1'11(1；[11161^316)、厚皮破囊壺菌(。3(3117(161'1]111111)、層出破囊壺菌(proliferum)、粉紅破囊壺菌(roseum)，以及紋帶破囊壺菌（striatum));裂殖壺菌屬（Schizochytrium)(物種包括聚生裂殖壺菌（aggregatum)、limnaceum、紅樹林裂殖壺菌 (mangrovei )、微小裂殖壺菌（minutum)、八孢裂殖壺菌（octosporum));吾肯氏壺菌屬 (Ulkenia)(物種包括變形吾肯氏壺菌(amoeboidea)、克格倫吾肯氏壺菌(kerguelensis)、小吾肯氏壺菌（mi nuta)、深海吾肯氏壺菌（profunda)、福射吾肯氏壺菌（radiate)、 sailens、沙氏吾肯氏壺菌（sarkariana)、schizochytrops、威瑟氏吾肯氏壺菌 (visurgensis)、約肯氏吾肯氏壺菌（yorkensis));Aurantiacochytrium 屬； Ob Iongichytrium屬、Sicyoidochytium屬、Parientichytrium屬、Botryochytrium屬，及其組合。在吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)內所描述的物種會視為裂殖壺菌屬的成員。在另一個實施方案中，微生物細胞來自破囊壺菌目。在又一個實施方案中，微生物細胞來自破囊壺菌屬。在又一個實施方案中，微生物細胞來自裂殖壺菌屬。在又一個實施方案中，微生物細胞選自破囊壺菌屬、裂殖壺菌屬，或其混合物。
[0031 ]在一個實施方案中，該方法包括裂解包含微生物油的微生物細胞以形成裂解細胞組合物。術語"裂解(lyse)"及"裂解(lysing)"意指使微生物細胞的壁和/或膜破裂的方法。在一個實施方案中，通過至少一種選自下組的處理來裂解微生物細胞:機械處理、化學處理、酶處理、物理處理，及其組合。在另一個實施方案中，所述方法包括裂解包含微生物油的微生物細胞以形成裂解細胞組合物，其中所述裂解選自機械處理、化學處理、酶處理、物理處理，及其組合。
[0032]在一些實施方案中，在裂解細胞之前，可以對所述細胞進行洗滌和/或巴氏消毒 (pasteurize)。在一些實施方案中，洗滌細胞包括使用水溶液(例如水)來去除任何細胞外的水溶性或水分散性化合物。在一些實施方案中，可以將細胞洗滌一次、二次、三次，或更多次。在一些實施方案中，對細胞進行巴氏消毒包括加熱該細胞以使任何不合意的酶(例如任何可能降解該油或降低PUFA產量/收率的酶)失活。在一些實施方案中，可以洗滌該細胞然后在裂解該細胞之前對其進行巴氏消毒。在一些實施方案中，要裂解的細胞包含于發(fā)酵液中。
[0033]在一些實施方案中，所述方法包括裂解包含微生物油的未洗滌的微生物細胞以形成裂解細胞組合物。在一些實施方案中，用例如水首先洗滌含有包含微生物油的微生物細胞的發(fā)酵液，然后裂解該細胞以形成裂解細胞組合物。在其他實施方案中，所述方法包括裂解發(fā)酵液中未洗滌的細胞以形成裂解細胞組合物。
[0034]機械處理包括但不限于均質化、超聲、冷壓、碾磨，及其組合。在一些實施方案中，所述方法包括通過均質化來裂解細胞。在一些實施方案中，所述方法包括用均質機來裂解該細胞。
[0035] 均質化包括但不限于使用下列設備的方法：弗氏細胞壓碎器（French cell press)、超聲破碎器、均質機，微流化器(microfluidizer)、球磨機、棒磨機、爍磨機(pebble mill)、珠磨機(bead mill)、高壓碾磨輯、立軸式沖擊機(vertical shaft impactor)、工業(yè) 共混機、高剪切混合機、槳式混合機、polytron均質機、工業(yè)均質機(例如Niro Soavi VHP均質機及APV Rannie和APV Gaulin均質機）、工業(yè)高剪切流體處理器(high shear fluid processors)(例如微流體高剪切流體處理器）、細胞裂解/珠磨均質機(例如Dyno-Mill和 Buhler)，及其組合。在一些實施方案中，細胞流經任選加熱的均質機。在一些實施方案中，合適的均質化可以包括1次至3次通過處于高壓和/或低壓的均質機。
[0036] 在一些實施方案中，均質化過程中的壓強為150巴（bar)至1，400巴；150巴至1，200 巴；150巴至900巴；150巴至300巴；300巴至1,400巴；300巴至1,200巴；300巴至900巴；400巴至800巴；500巴至700巴；或600巴。在一些實施方案中，均質化過程中的壓強為2，000psi至 20,000卩8；[;2,000卩8；[至18,000卩8；[;2,000卩8；[至16,000卩8；[;2,000卩8；[至14,000卩8；[;2， OOOpsi至12，000psi;2,OOOpsi至10，000psi;2，OOOpsi至8，000psi;2,OOOpsi至6,OOOpsi; 2,000卩8；[至4,000卩8；[;4,000卩8；[至20,000卩8；[;4,000卩8；[至18,000卩8；[;4,000卩8；[至16， OOOpsi;4，000psi至14,000psi;4，000psi至12，000psi;4,OOOpsi至10，000psi;4,OOOpsi至 8，000psi;4,OOOpsi至6，000psi;6,OOOpsi至20，000psi;6,OOOpsi至18，000psi;6,OOOpsi 至16，OOOpsi;6，OOOpsi至14，OOOpsi;6，OOOpsi至12，OOOpsi;6，OOOpsi至10，OOOpsi;6， OOOpsi至8，000psi;8,OOOpsi至20，000psi;8,OOOpsi至18，000psi;8,OOOpsi至16,OOOpsi; 8，OOOpsi至14，OOOpsi;8，OOOpsi至12，OOOpsi;8，OOOpsi至10，OOOpsi;10,OOOpsi至20， OOOpsi;10,OOOpsi至18，000psi;10,OOOpsi至16，000psi;10,OOOpsi至14，000psi; 10， OOOpsi至12，000psi;12,OOOpsi至20，000psi;12,OOOpsi至18，000psi;12,OOOpsi至16， OOOpsi;12,OOOpsi至14，000psi;14,OOOpsi至20，000psi;14,OOOpsi至18，000psi; 14， OOOpsi至16，000psi;16,OOOpsi至20，000psi;16,OOOpsi至18，000psi;或18,OOOpsi至20， OOOpsi0
[0037]在一些實施方案中，在均質化前將微生物細胞在高剪切混合機中混合。在一些實施方案中，所述高剪切混合機以如下范圍的轉速操作：至少5，OOOrpm;至少7，500rpm;至少 10，OOOrpm;至少12，500rpm;至少15，OOOrpm; 5，OOOrpm至15，OOOrpm; 5，OOOrpm至12， 500rpm;5,OOOrpm至10,OOOrpm;5,OOOrpm至7，500rpm;7，500rpm至15,OOOrpm;7，500rpm至 12，500rpm;7，500rpm至10,OOOrpm;10,OOOrpm至15,OOOrpm;10,OOOrpm至12，500rpm;或12， 500rpm至15，OOOrpm。
[0038] 物理處理包括但不限于:加熱，其包括但不限于，電阻式(resistive)、對流、蒸汽、流體浴、太陽能，及其組合。在一些實施方案中，在釜中加熱細胞，所述釜在其壁之內/之上具有電阻線圈。在一些實施方案中，在液體浴中加熱細胞，所述液體浴具有穿過其間的管子。
[0039]化學處理包括但不限于：提高細胞的pH;降低細胞的pH;使細胞接觸化學品；及其組合。
[0040] 在一些實施方案中，通過提高細胞的pH來裂解細胞。在一些實施方案中，通過添加堿來提高pH。堿包括但不限于氫氧化物（例如1^0!1、似0!1、1(0!1工&(0!1)2，及其組合）、碳酸鹽類（例如，Na 2CO3，K2CO3，MgCO3，及其組合）、碳酸氫鹽類（例如，LiHCO 3，NaHCO3，KHCO3，及其組合），及其組合。堿可以是固體形式(例如晶體，顆粒，與小丸）；液體形式(例如水溶液）；及其組合。
[0041 ] 在一些實施方案中，該堿具有1至12、1至10、1至8、1至6、1至5、2至12、2至10、2至8、 2至6、2至5、3至10、3至6、3至5、4至10、4至8、4至6、5至10、或5至8的pKb。本文所用的術語 "pK b"意指堿的堿締合常數(shù)(Kb)的負對數(shù)。Kb意指堿在水中的離子化的平衡常數(shù)，其中：
[0042] B + mo ^ HB+ + Off-;并且堿B的Kb定義為:= [ΗΒ「]』?Η ] ~ [Β]
[0043] 在一些實施方案中，pH選自約8或以上;約9或以上；約10或以上;約11或以上；以及約12或以上。在其他實施方案中，pH選自如下pH:7至13;7至12;7至11;7至10;7至9;8至13;8 至12 ;8至11;8至10;8至9;9至12;9至11 ;9至10;10至12;以及10至11。
[0044] 在一些實施方案中，細胞的pH可以通過氯堿法來提升。在一些實施方案中，對含氯化鈉和細胞的發(fā)酵液進行電解，其導致形成氫氧化鈉，這使該細胞的PH提高。在一些實施方案中，發(fā)酵液包含氯化鈣或氯化鉀代替氯化鈉，或是除氯化鈉之外還有氯化鈣或氯化鉀，并且電解分別導致形成氫氧化鈣或氫氧化鉀，由此提高該細胞的pH。
[0045] 在一些實施方案中，通過降低細胞的pH來裂解細胞。在一些實施方案中，通過添加酸來降低pH。酸包括但不限于:硫酸;磷酸;鹽酸;氫溴酸;氫碘酸;次氯酸;亞氯酸;氯酸;高氯酸;氟硫酸;硝酸;氟銻酸;氟硼酸;六氟磷酸;鉻酸;硼酸；乙酸;檸檬酸；甲酸;及其組合。在一些實施方案中，pH選自約7或更低;約6.5或更低;約6或更低;約5.5或更低;約5或更低；約4.5或更低；約4或更低；約3.5或更低；約3或更低；約2.5或更低；約2或更低；約1.5或更低；約1或更低;和約〇 . 5或更低。在其他實施方案中，pH選自約0.5至約7;約0.5至約6.5;約 0.5至約6;約0.5至約5.5;約0.5至約5;約0.5至約4.5;約0.5至約4;約0.5至約3.5;約0.5至約3;約0.5至約2.5;約0.5至約2;約0.5至約1.5;約0.5至約1;約1至約7;約1至約6.5;約1至約6;約1至約5.5;約1至約5;約1至約4.5;約1至約4;約1至約3.5;約1至約3;約1至約2.5;約 1至約2;約1至約1.5;約1.5至約7;約1.5至約6.5;約1.5至約6;約1.5至約5.5;約1.5至約5; 約1.5至約4.5;約1.5至約4;約1.5至約3.5;約1.5至約3;約1.5至約2.5;約1.5至約2;約2至約7;約2至約6.5;約2至約6;約2至約5.5;約2至約5;約2至約4.5;約2至約4;約2至約3.5;約 2至約3;約2至約2.5;約2.5至約7;約2.5至約6.5;約2.5至約6;約2.5至約5.5;約2.5至約5; 約2.5至約4.5;約2.5至約4;約2.5至約3.5;約2.5至約3;約3至約7;約3至約6.5;約3至約6; 約3至約5.5;約3至約5;約3至約4.5;約3至約4;約3至約3.5;約3.5至約7;約3.5至約6.5;約 3.5至約6;約3.5至約5.5;約3.5至約5;約3.5至約4.5;約3.5至約4;約4至約7;約4至約6.5; 約4至約6;約4至約5.5;約4至約5;約4至約4.5;約4.5至約7;約4.5至約6.5;約4.5至約6;約 4.5至約5.5;約4.5至約5;約5至約7;約5至約6.5;約5至約6;約5至約5.5;約5.5至約7;約 5.5至約6.5;約5.5至約6;約6至約7;約6至約6.5;和約6.5至約7。
[0046] 在一些實施方案中，添加如下量的酸來降低pH:按細胞培養(yǎng)液(cell broth)的重量（或體積）計約2 %至約10 %，約2 %至約9 %，約2 %至約8 %，約2 %至約7 %，約2 %至約 6%，約3%至約6%，約4%至約6%，約5%至約6%，約2%至約5%，約2%至約4%，約2%至約3%，約3%至約5%，約3%至約4%，或約4%至約5%。
[0047]酶處理意指使細胞接觸一種或多種酶。酶包括但不限于：蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、殼多糖酶、果膠酶，及其組合。蛋白酶的非限制性實例包括絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、Alacase，及其組合。纖維素酶的非限制性實例包括蔗糖酶、麥芽糖酶、乳糖酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、淀粉酶、溶菌酶、神經氨酸酶、半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、透明質酸酶、普魯蘭酶（pul Iulanase )、葡糖腦苷脂酶、半乳糖基神經酰胺酶、乙酰基半乳糖胺酶 (&06丨7]^3]^〇1：083111；[11丨(^86)、巖藻糖苷酶、己糖胺酶、艾杜糖醛酸糖苷酶（丨(1111'011丨(1386)、麥芽糖酶-葡糖淀粉酶，及其組合。殼多糖酶的非限制性實例包括殼三糖苷酶 (chitotriosidase)。果膠酶(pectinase)的非限制性實例包括果膠裂合酶(pectolyase)、 Pectozyme、聚半乳糖醛酸酶，及其組合。在一些實施方案中，一些酶通過加熱來活化。在一些實施方案中，裂解不包括酶的使用。
[0048] 如本文所用的，"裂解細胞組合物"意指包含一個或多個裂解的細胞(包括細胞碎片和細胞的其他內容物）、與微生物油(來自所述裂解的細胞)和任選的培養(yǎng)液(其含有液體 (如水）、營養(yǎng)素、和微生物細胞)組合的組合物。在一些實施方案中，微生物細胞包含于含水的發(fā)酵液或培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，裂解細胞組合物意指這樣的組合物，其包含一個或多個裂解的細胞、細胞碎片、微生物油、該細胞的天然內容物，以及來自發(fā)酵液的水組份。在一個實施方案中，該裂解細胞組合物包含液體、細胞碎片以及微生物油。在一些實施方案中，裂解細胞組合物呈水包油乳液形式，其包含連續(xù)水相和分散油相的混合物。在一些實施方案中，分散油相以按乳化的裂解細胞組合物的重量(或體積)計約1 %至約60 % ;約1 %至約50% ;約1 %至約40% ;約1 %至約30% ;約1 %至約20%;約5%至約60% ;約5%至約50% ; 約5%至約40% ;約5 %至約30% ;約5%至約20% ;約10 %至約60% ;約10%至約50% ;約 10%至約40% ;約20%至約60% ;20%至50% ;20%至約40% ;約30%至約60%;約30%至約 50% ;或約40%至約60%的濃度存在。
[0049] 在一些實施方案中，裂解微生物細胞導致自細胞或細胞生物質中的內源性材料形成乳液，所述內源性材料包括但不限于蛋白質、磷脂、碳水化合物，及其組合。雖然不被任何的具體理論的束縛，據(jù)信本發(fā)明的方法能將乳化的裂解細胞組合物破碎或去乳化，允許微生物油從該裂解細胞組合物分離。術語"乳液"和"乳化的"意指兩個或更多個不互溶相或層的混合物，其中一個相或層分散于另一個相或層中。術語"破碎(break)"、"破碎(break-up)"、"去乳化（demulsify)"、"去乳化作用（demulsification)"、"去乳化 (demulsifying)"，以及"破碎(breaking)"意指分離乳液的不互溶相或層的方法。例如，對乳化的裂解細胞組合物進行破碎或去乳化是意指這樣的方法，通過該方法，乳化的裂解細胞組合物從具有一個或多個相或層的乳液轉變?yōu)榫哂袃蓚€或更多個相或層的組合物。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法使乳化的裂解細胞組合物從單相破碎成二相或更多相。在一些實施方案中，所述二相或更多相包括油相和水相。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法使乳化的裂解細胞組合物破碎成至少三相。在一些實施方案中，所述三相選自油相、水相，以及固相。在一些實施方案中，所述相選自油相、乳化相、水相，以及固相。
[0050] 在一些實施方案中，所述方法包括通過降低裂解細胞組合物的pH將該裂解細胞組合物去乳化。在一些實施方案中，通過添加酸來降低pH。所述酸包括但不限于:硫酸;磷酸；鹽酸;氫溴酸;氫碘酸;次氯酸;亞氯酸;氯酸;高氯酸;氟硫酸;硝酸;氟銻酸;氟硼酸;六氟磷酸;鉻酸;硼酸；乙酸;檸檬酸；甲酸;及其組合。在一些實施方案中，PH選自7或更低;約6.5或更低；約6或更低;約5.5或更低；約5或更低;約4.5或更低；約4或更低；約3.5或更低；約3或更低;約2.5或更低;約2或更低;約1.5或更低;約1或更低;和約0.5或更低。在一些實施方案中，所述方法包括將裂解細胞組合物的PH降低至約6或更低。在其他實施方案中，pH選自約 0.5至約7;約0.5至約6.5;約0.5至約6;約0.5至約5.5;約0.5至約5;約0.5至約4.5;約0.5至約4;約0.5至約3.5;約0.5至約3;約0.5至約2.5;約0.5至約2;約0.5至約1.5;約0.5至約1; 約1至約7;約1至約6.5;約1至約6;約1至約5.5;約1至約5;約1至約4.5;約1至約4;約1至約 3.5;約1至約3;約1至約2.5;約1至約2;約1至約1.5;約1.5至約7;約1.5至約6.5;約1.5至約 6;約1.5至約5.5;約1.5至約5;約1.5至約4.5;約1.5至約4;約1.5至約3.5;約1.5至約3;約 1.5至約2.5;約1.5至約2;約2至約7;約2至約6.5;約2至約6;約2至約5.5;約2至約5;約2至約4.5;約2至約4;約2至約3.5;約2至約3;約2至約2.5;約2.5至約7;約2.5至約6.5;約2.5至約6;約2.5至約5.5;約2.5至約5;約2.5至約4.5;約2.5至約4;約2.5至約3.5;約2.5至約3; 約3至約7;約3至約6.5;約3至約6;約3至約5.5;約3至約5;約3至約4.5;約3至約4;約3至約 3.5;約3.5至約7;約3.5至約6.5;約3.5至約6;約3.5至約5.5;約3.5至約5;約3.5至約4.5; 約3.5至約4;約4至約7;約4至約6.5;約4至約6;約4至約5.5;約4至約5;約4至約4.5;約4.5 至約7;約4.5至約6.5;約4.5至約6;約4.5至約5.5;約4.5至約5;約5至約7;約5至約6.5;約5 至約6;約5至約5.5;約5.5至約7;約5.5至約6.5;約5.5至約6;約6至約7;約6至約6.5;以及約6.5至約7。在一些實施方案中，所述方法包括將裂解細胞組合物的pH降低到約0.5至約6。
[0051] 在一些實施方案中，所述方法包括通過添加酸將裂解細胞組合物去乳化，所述添加的酸的量為：按細胞培養(yǎng)液或裂解細胞組合物的重量(或體積)計約〇 . 5 %至約20 %、約 0.5%至約15%、約0.5%至約10%、約0.5%至約9%、約0.5%至約8%、約0.5%至約7%、約 0.5%至約6%、約0.5%至約5%、約0.5%至約4%、約0.5%至約3%、約0.5%至約2%、和約 0.5 %至約1 %。在一個實施方案中，所述方法包括通過添加酸將裂解細胞組合物去乳化，所述添加的酸的量按重量計是裂解細胞組合物的約0.5 %至約20 %。
[0052]在一些實施方案中，所述方法還包括在裂解細胞之前、過程中、或之后對其加熱。在一些實施方案中，所述方法包括將裂解細胞組合物和/或細胞加熱到至少l〇°C，至少20 °C，至少25°C，至少30°C，至少35°C，至少40°C，至少45°C，至少50°C，至少55°C，至少60°C，至少65°C，至少70°C，至少75°C，至少80°C，至少85°C，至少90°C，至少95°C，或至少100°C。在其他實施方案中，所述方法包括將裂解細胞組合物和/或細胞加熱到約10°C至約100°C、約10 。(:至約90°C、約 10 °C至約80°C、約 10°C至約70°C、約20°C 至約 100°C、約20 °C至約90°C、約20 。(:至約80°C、約20 °C至約70°C、約30°C至約 100 °C、約30°C至約90°C、約30 °C至約80°C、約30 。(:至約70°C、約40 °C至約 100 °C、約40 °C 至約90°C、約40 °C至約80 °C、約50 °C 至約 100°C、約50 。(:至約90°C、約50 °C至約80°C、約50°C至約70°C、約60°C 至約 100°C、約60 °C至約90°C、約60 。(:至約80 °C、約70 °C至約100 °C、約70 °C至約90 °C、約80 °C至約100 °C、約80 °C至約90 °C，或約 90 °C至約100 °C。在又一個實施方案中，所述方法包括將裂解細胞組合物加熱到約70 °C至約 100 °C、約70°C至約90°C、約80 °C至約100°C、約80 °C至約90°C，或約90°C至約100°C。在又一個實施方案中，所示方法包括將裂解細胞組合物加熱到至少70°C，至少75°C，至少80°C，至少85 °C，至少90 °C，至少95°C，或至少100 °C。在又一個實施方案中，所述方法還包括將裂解細胞組合物加熱到至少70°C。在又一個實施方案中，該方法還包括將裂解細胞組合物加熱到約70°C至約100°C。
[0053] 在一些實施方案中，所述方法還包括加熱裂解細胞組合物直到該裂解細胞組合物含有選自下組的平均粒度為止:5微米至25微米;5微米至20微米;5微米至15微米;10微米至 25微米；10微米至20微米；10微米至15微米；15微米至25微米；15微米至20微米;和20微米至 25微米。在另一個實施方案中，所述裂解細胞組合物的平均粒度選自：25微米或更低、20微米或更低、15微米或更低、10微米或更低、和5微米或更低。在另一個實施方案中，所述裂解細胞組合物的平均粒度是25微米或更低。在一些實施方案中，平均粒度可以使用，例如 Beckman Coulter LS 13 320粒度分析儀(Beckman Coulter,Brea,CA)來測量。在一些實施方案中，平均粒度可以使用例如Malvern MS2000粒度分析儀(Malvern Instruments Ltd·, Worcestershire ,United Kingdom)來測量。在一些實施方案中，將裂解細胞組合物加熱足夠的時間以將所述裂解細胞組合物去乳化。
[0054] 在一些實施方案中，細胞和/或裂解細胞組合物可以在密閉系統(tǒng)中或具有蒸發(fā)器的系統(tǒng)中進行加熱。在一些實施方案中，細胞和/或裂解細胞組合物可以在具有蒸發(fā)器的系統(tǒng)中進行加熱，從而通過蒸發(fā)來去除該細胞和/或該裂解細胞組合物中存在的一部分水。在一些實施方案中，方法包括在具有蒸發(fā)器的系統(tǒng)中加熱細胞和/或裂解細胞組合物以去除按重量(或體積)計多至1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%重量 (或體積)的該細胞和/或裂解細胞組合物中存在的水。在一些實施方案中，方法包括在具有蒸發(fā)器的系統(tǒng)中加熱細胞和/或裂解細胞組合物，以去除按重量(或體積)計1%至50%、1% 至45%、1 %至40%、1 %至35%、1 %至30%、1 %至 25%、1 %至20%、1 %至 15%、1 %至 10%、 1%至5%、5%至50%、5%至45%、5%至40%、5%至35%、5%至30%、5%至25%、5%至 20%、5 % 至15 %、5% 至10 %、10 %至 50%、10 % 至 45 %、10% 至 40 %、10 %至 35%、10 % 至 30%、10%至 25%、10%至 20%、10%至 15%、15%至 50%、15%至 45%、15%至 40%、15%至 35%、15%至30%、15%至25%、15%至20%、20%至50%、20%至45%、20%至40%、20%至 35%、20%至30%、20%至25%、25%至50%、25%至45%、25%至40%、25%至35%、25%至 30%、30%至50%、30%至45%、30%至40%、30%至35%、35%至50%、35%至45%、35%至 40%、40%至50%、40%至45%、或45%至50% 的水。
[0055] 在一些實施方案中，所述方法還包括向裂解細胞組合物添加乳化劑。在一些實施方案中，所述乳化劑是去污劑。在一些實施方案中，所述乳化劑為表面活性劑。在一些實施方案中，在裂解之前、過程中，或之后添加該乳化劑。在一個實施方案中，在裂解之后添加該乳化劑。在一些實施方案中，將該乳化劑添加至裂解細胞組合物。本文中所用的術語"乳化劑"意指使乳液穩(wěn)定的物質。乳化劑選自離子性乳化劑、非離子性乳化劑，及其組合。在一些實施方案中，所述乳化劑是離子性乳化劑。
[0056]在一些實施方案中，離子性乳化劑選自陰離子乳化劑、陽離子乳化劑，及其組合。在一些實施方案中，陰離子乳化劑可以是陰離子硫酸鹽乳化劑，例如烷基硫酸鹽(例如月桂基硫酸銨、月桂基硫酸鈉(SLS)/十二烷基硫酸鈉(SDS)，及其組合），烷基醚硫酸鹽(例如月桂醇聚醚（Iaureth)硫酸鈉/月桂基醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉，及其組合），及其組合；陰離子磺酸鹽乳化劑，例如多庫酯鹽(docusate)(例如磺基琥珀酸二辛酯鈉、磺酸鹽氟表面活性劑(例如全氟辛烷磺酸鹽和全氟丁烷磺酸鹽）、烷基苯磺酸鹽，及其組合）；陰離子磷酸鹽乳化劑(例如烷基芳基醚磷酸鹽、烷基醚磷酸鹽，及其組合）；陰離子羧酸鹽乳化劑(例如烷基羧酸鹽(如硬脂酸鈉、月桂酰肌氨酸鈉 (sodium lauroyl sarcosinate)、羧酸鹽氟表面活性劑(例如全氟壬酸鹽、全氟辛酸鹽，及其組合），及其組合）；及其組合。在一些實施方案中，乳化劑是陰離子乳化劑。在一個實施方案中，陰離子乳化劑選自陰離子硫酸鹽乳化劑、陰離子磺酸鹽乳化劑、陰離子磷酸鹽乳化劑、陰離子羧酸鹽乳化劑，及其組合。在另一個實施方案中，陰離子乳化劑是陰離子硫酸鹽乳化劑。在又一個實施方案中，陰離子硫酸鹽乳化劑選自月桂基硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、月桂醇聚醚硫酸鈉、月桂基醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉，及其組合。在又一個實施方案中，陰離子硫酸鹽乳化劑是十二烷基硫酸鈉。
[0057]在一些實施方案中，陽離子乳化劑可以是pH依賴性伯胺;pH依賴性仲胺;pH依賴性叔胺;奧替尼啶二鹽酸鹽(octenidine dihydrochloride);永久性帶電荷季銨陽離子(例如烷基三甲基銨鹽（例如鯨錯基三甲基溴化銨（cetyl trimethylammonium bromide)(CTAB)/ 十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide)、鯨錯基三甲基氯化銨 (CTAC)，及其組合），鯨錯基氯化吡啶（pyr id in ium) (CPC)、苯扎氯銨（benza Ikonium chloride，BAC)、節(jié)索氯銨（benzethonium chloride，BZT)、5_溴-5-硝基-1，3_二噁燒、二甲基雙十八烷基氯化銨、雙十八烷基二甲基溴化銨(DODAB)，及其組合）；及其組合。
[0058]在一些實施方案中，乳化劑的分子量選自500克/摩爾或更低、450克/摩爾或更低、 400克/摩爾或更低、350克/摩爾或更低、和300克/摩爾或更低。在進一步的實施方案中，乳化劑的分子量選自250克/摩爾至500克/摩爾、250克/摩爾至450克/摩爾、250克/摩爾至400 克/摩爾、250克/摩爾至350克/摩爾、250克/摩爾至300克/摩爾、300克/摩爾至500克/摩爾、 300克/摩爾至450克/摩爾、300克/摩爾至400克/摩爾、300克/摩爾至350克/摩爾、350克/摩爾至500克/摩爾、350克/摩爾至450克/摩爾、350克/摩爾至400克/摩爾、400克/摩爾至500 克/摩爾、400克/摩爾至450克/摩爾、和450克/摩爾至500克/摩爾。例如，SDS的分子量是288 克/摩爾，而CTAB的分子量是364克/摩爾。在又一個實施方案中，乳化劑的分子量選自250 克/摩爾至450克/摩爾、250克/摩爾至400克/摩爾、250克/摩爾至350克/摩爾，以及250克/ 摩爾至300克/摩爾。
[0059]在一些實施方案中，乳化劑作為粉末添加。在一些實施方案中，乳化劑在溶液中添加，所述溶液具有如下量的乳化劑濃度:5%至50%、5%至45%、5%至40%、5%至35%、5% 至 30%、10%至 50%、10%至 45%、10%至 40%、10%至 35%、10%至 30%、15%至 50%、15% 至 45%、15%至40%、15%至35%、15%至30%、20%至50%、20%至45%、20%至40%、20% 至 35%、20%至30%、25%至50%、25%至45%、25%至40%、25%至35%、25%至30%、30% 至 50%、30%至45%、30%至40%、和30%至35%。
[0060] 在一些實施方案中，乳化劑(例如以粉末形式或于溶液中）以選自如下的量添加：按重量(或體積)計發(fā)酵液或裂解細胞組合物的〇 .2%至10%、0.2%至9.5%、0.2%至9%、 0.2%至8.5%、0.2%至8%、0.2%至7.5%、0.2%至7%、0.2%至6.5%、0.2%至6%、0.2% 至5.5%、0.2%至5%、0.2%至4.5%、0.2%至4%、0.2%至3.5%、0.2%至3%、0.2%至 2.5%、0.2%至2%、0.2%至1.5%、0.2%至1%、0.2%至0.5%、0.5%至10%、0.5%至 9.5%、0.5%至9%、0.5%至8.5%、0.5%至8%、0.5%至7.5%、0.5%至7%、0.5%至 6.5%、0.5%至6%、0.5%至5.5%、0.5%至5%、0.5%至4.5%、0.5%至4%、0.5%至 3.5%、0.5%至3%、0.5%至2.5%、0.5%至2%、0.5%至1.5%、0.5%至1%、1%至10%、 1% 至9.5%、1% 至9%、1% 至8.5%、1% 至8%、1% 至 7.5%、1% 至7%、1% 至6.5%、1% 至 6%、1%至5.5%、1%至5%、1%至4.5%、1%至4%、1%至3.5%、1%至3%、1%至2.5%、 1 %至2%、1 %至 1.5%、1.5%至 10%、1.5%至 9.5%、1.5% 至 9%、1.5%至 8.5%、1.5% 至 8%、1.5%至 7.5%、1.5%至7 %、1.5%至6.5%、1.5%至6%、1.5%至 5.5%、1.5%至5 %、 1.5%至4.5%、1.5%至4%、1.5%至3.5%、1.5%至3%、1.5%至2.5%、1.5%至2%、2%至 10%、2%至9.5%、2%至9%、2%至8.5%、2%至8%、2%至7.5%、2%至7%、2%至6.5%、 2% 至6 %、2% 至5.5%、2% 至5 %、2% 至4.5%、2% 至4%、2% 至3.5%、2% 至3 %、2% 至 2.5%、2.5% 至 10 %、2.5% 至9.5%、2.5% 至9 %、2.5% 至8.5%、2.5% 至8 %、2.5% 至 7.5%、2.5% 至7 %、2.5% 至6.5%、2.5% 至6 %、2.5% 至5.5%、2.5% 至5 %、2.5% 至 4.5%、2.5%至4%、2.5%至3.5%、2.5%至3%、3%至10%、3%至9.5%、3%至9%、3%至 8.5%、3%至8%、3%至7.5%、3%至7%、3%至6.5%、3%至6%、3%至5.5%、3%至5%、 3%至4.5%、3%至4%、和3%至3.5%。在另一個實施方案中，乳化劑(例如以粉末形式或于溶液中）以選自如下的量添加:按重量(或體積)計選自發(fā)酵液或裂解細胞組合物的〇. 2 %至 5%、0.5%至5%、1 %至5%、1.5%至5%、2%至5%、2.5%至5%、和3%至5%。在又一個實施方案中，乳化劑以如下的量添加:按重量計是裂解細胞組合物的〇. 2%至10%。
[0061] 在一些實施方案中，乳化劑降低發(fā)酵液或裂解細胞組合物的界面張力（即表面張力）。如本文所使用的，術語"界面張力"或"表面張力"意指作用于二相之間的界面處一米長的假想的線（imaginary line one meter in length)上的力。在一些實施方案中，由乳化劑所形成的乳液的界面張力比由內源性材料所形成的乳液更低。在一些實施方案中，界面張力可以按達因/厘米(dynes/cm)來測量。
[0062] 在一些實施方案中，乳化劑增加發(fā)酵液或裂解細胞組合物的ζ電位 (zetapotential)絕對值（即提高正ζ電位或是降低負ζ電位）。在一些實施方案中，添加陰離子乳化劑能導致發(fā)酵液或裂解細胞組合物的ζ電位下移（即降低正ζ電位或是提高負位）。在一些實施方案中，添加陽離子乳化劑能導致發(fā)酵液或裂解細胞組合物的ζ電位上移 (即提高正ζ電位或是降低負ζ電位）。如本文所用的，術語"ζ電位"意指乳液中粒子之間的電動電位。在一些實施方案中，ζ電位可以按mV來測量。在一些實施方案中，由乳化劑所形成的乳液的ζ電位的絕對值比內源性材料形成的乳液更高。
[0063] 在一些實施方案中，添加離子性乳化劑產生水包油乳液。在一些實施方案中，水包油乳液包括但不限于油、水、以及離子性乳化劑。
[0064] 在一些實施方案中，所述方法還包括向裂解細胞組合物添加鹽。術語"鹽"意指離子性化合物，其通過用金屬(例如，堿金屬、堿土金屬，及過渡金屬)或帶正電荷的化合物(例如NH4+)代替來自酸的氫離子而形成。在一些實施方案中，鹽類可以是堿金屬鹽、堿土金屬鹽、硫酸鹽，或其組合。鹽中存在的帶負電荷的離子的種類包括但不限于：鹵化物、硫酸根、硫酸氫根、亞硫酸根，磷酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、碳酸根、碳酸氫根，及其組合。在一些實施方案中，鹽選自：氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉、氯化鈣、硫酸鉀、硫酸鎂、谷氨酸一鈉、硫酸銨、氯化鉀、氯化鐵、硫酸鐵、硫酸鋁、乙酸銨，及其組合。在一些實施方案中，鹽不包括NaOH。鹽可以作為固體(例如以結晶、無定形的、團狀的(pelletized)，和/或顆粒形式)和/或含例如水的溶液(例如稀釋溶液、飽和溶液，或過飽和溶液)添加。
[0065] 在一些實施方案中，以如下量添加鹽:5g/l至25g/l、5g/l至10g/l、10g/l至15g/l、 15g/l至20g/l、20g/l至25g/l、或10g/l至20g/l。
[0066] 在其他實施方案中，鹽以如下量添加至裂解細胞組合物:按重量(或體積)計是裂解細胞組合物的20 %或更少，15 %或更少，10 %或更少，7.5 %或更少，5 %或更少，或2 %或更少。在一些實施方案中，鹽以如下量添加至該裂解細胞組合物:按重量(或體積)計細胞裂解組合物（例如總培養(yǎng)液重量(或體積））的約0.05 %至約20 %、約0.1 %至約20 %、約0.1 % 至約15 %、約0.1 %至約10 %、約0.5%至約20%、約0.5 %至約15 %、約0.5%至約10 %、約 0.5%至約5%、約0.5%至約4%、約0.5%至約3%、約0.5%至約2.5%、約0.5%至約2%、約 0.5%至約1.5%、約0.5%至約1 %、約1 %至約20%、約1 %至約15%、約1 %至約10%、約1 % 至約5%、約1 %至約4%、1 %至約3%、約1 %至約2.5%、約1 %至約2%、約1 %至約1.5%、約 1.5%至約5%、約1.5%至約4%、約1.5%至約3%、約1.5%至約2.5%、約1.5%至約2%、約 2%至20%、約2%至約15%、約2%至約10%、約2%至約5%、約2%至約4%、約2%至約3%、約2 %至約2.5%、約2.5%至約5%、約2.5 %至約4%、約2.5 %至約3%、約3%至約5 %、約 3 %至約4%、約4%至約5 %、約5 %至約20 %、約5 %至約15 %、約5 %至約10 %、約10 %至約 20 %、約10 %至約15 %、或約15 %至約20 %。例如，當裂解細胞組合物重量為I，OOOkg時，以按重量(或體積)計0.5%至20%的量添加的鹽需要添加5kg至200kg的鹽至該裂解細胞組合物。在一些實施方案中，鹽以如下量添加至該裂解細胞組合物:按重量(或體積)計所述裂解細胞組合物的約〇 . 05 %至約20 %、按重量（或體積）約0.1 %至約20 %、按重量（或體積）約 0.5 %至約15 %，或按重量(或體積)約2 %至約10 %。
[0067] 在一些實施方案中，所述方法還包括（i)在裂解細胞之前、過程中、或之后進行攪拌；（i)在將裂解細胞組合物去乳化之前、過程中、或之后進行攪拌;或其組合。術語"攪拌 (agitating)"和"攪拌(agitation)"是指通過施加力來影響細胞和/或裂解細胞組合物內的運動的方法。在一些實施方案中，該方法包括通過攪動、混合、共混、振蕩、振動，或其組合而攪拌細胞和/或裂解細胞組合物。
[0068] 在一些實施方案中，攪拌器是分散型攪拌器，其將堿和/或鹽分散于該細胞組合物或裂解細胞組成物之中。在一些實施方案中，攪拌器具有加熱板。在一些實施方案中，攪拌器具有供攪動用的外罩。在一些實施方案中，攪拌器具有一個或多個葉輪。如本文使用的， "葉輪"意指這樣的裝置，其經安排以在旋轉時使細胞組合物或裂解細胞組合物運動。適合供本發(fā)明使用的葉輪包括直葉片葉輪、拉什頓葉片葉輪(Rushton blade impeller)、軸向流式葉輪、徑向流式葉輪、凹面葉片盤葉輪、高效葉輪、螺旋槳(propellers)、槳(paddles)、禍輪(turbines)，及其組合。
[0069] 在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括分別以0.1hp/l ,OOOgal至10hp/l，000gal、 0.5hp/l,OOOgal至8hp/l，000gal、lhp/l,OOOgal至6hp/l，000gal、或2hp/l,OOOgal至5hp/ I，000gal的細胞或組合物來攪拌細胞和/或裂解細胞組合物。在一些實施方案中，所述方法包括分別以〇 . lhp/1000gal至10hp/1000gal的細胞或組合物來攪拌細胞和/或裂解細胞組合物。
[0070]在一些實施方案中，本發(fā)明包括以如下轉速進行攪拌：IOrpm或更低、20rpm或更低、50rpm或更低、IOOrpm或更低、150rpm或更低、200rpm或更低、250rpm或更低、300rpm或更低、350rpm 或更低、400rpm 或更低、IOrpm 至 400rpm、IOrpm 至 350rpm、IOrpm 至 300rpm、IOrpm 至250rpm、IOrpm至200rpm、IOrpm至150rpm、IOrpm至lOOrprn、IOrpm至50rpm、IOrpm至20rpm、 20rpm至400rpm、20rpm至350rpm、20rpm至300rpm、20rpm至250rpm、20rpm至200rpm、20rpm至 150印111、20印1]1至100印111、20印1]1至50印111、50印1]1至400印111、50印1]1至350印111、50印1]1至300印111、 50rpm至250rpm、50rpm至200rpm、50rpm至150rpm、50rpm至IOOrpm、IOOrpm至400rpm、IOOrpm 至350rpm、IOOrpm至300rpm、IOOrpm至250rpm、IOOrpm至200rpm、IOOrpm至150rpm、150rpm至 400rpm、150rpm至350rpm、150rpm至300rpm、150rpm至250rpm、150rpm至200rpm、200rpm至 400rpm、200rpm至350rpm、200rpm至300rpm、200rpm至250rpm、250rpm至400rpm、250rpm至 350rpm、250rpm 至 300rpm、300rpm 至400rpm、300rpm 至 350rpm、或 350rpm 至400rpm。在一些實施方案中，攪拌以350rpm或更低的轉速進行。
[0071 ]在一些實施方案中，所述方法包括用攪拌器來攪拌細胞和/或裂解細胞組合物，所述攪拌器具有90英尺/分鐘至1，200英尺/分鐘、200英尺/分鐘至1，000英尺/分鐘、300英尺/ 分鐘至800英尺/分鐘、400英尺/分鐘至700英尺/分鐘、或500英尺/分鐘至600英尺/分鐘的葉輪尖端速率。在一些實施方案中，所述方法包括用攪拌器來攪拌，所述攪拌器具有200英尺/分鐘至1000英尺/分鐘的葉輪尖端速率。
[0072]在一些實施方案中，方法包括使用攪拌器來攪拌細胞和/或裂解細胞組合物，所述攪拌器具有如下葉輪尖端速率:5厘米/秒至900厘米/秒、5厘米/秒至750厘米/秒、5厘米/秒至500厘米/秒、5厘米/秒至350厘米/秒、5厘米/秒至300厘米/秒、5厘米/秒至250厘米/秒、5 厘米/秒至200厘米/秒、5厘米/秒至150厘米/秒、5厘米/秒至100厘米/秒、5厘米/秒至50厘米/秒、5厘米/秒至25厘米/秒、25厘米/秒至900厘米/秒、25厘米/秒至750厘米/秒、25厘米/ 秒至500厘米/秒、25厘米/秒至350厘米/秒、25厘米/秒至300厘米/秒、25厘米/秒至250厘米/秒、25厘米/秒至200厘米/秒、25厘米/秒至150厘米/秒、25厘米/秒至100厘米/秒、25厘米/秒至50厘米/秒、50厘米/秒至900厘米/秒、50厘米/秒至750厘米/秒、50厘米/秒至500厘米/秒、50厘米/秒至350厘米/秒、50厘米/秒至300厘米/秒、50厘米/秒至250厘米/秒、50厘米/秒至200厘米/秒、50厘米/秒至150厘米/秒、50厘米/秒至100厘米/秒、100厘米/秒至900 厘米/秒、100厘米/秒至750厘米/秒、100厘米/秒至500厘米/秒、100厘米/秒至350厘米/秒、 100厘米/秒至300厘米/秒、100厘米/秒至250厘米/秒、100厘米/秒至200厘米/秒、100厘米/ 秒至150厘米/秒、150厘米/秒至900厘米/秒、150厘米/秒至750厘米/秒、150厘米/秒至500 厘米/秒、150厘米/秒至350厘米/秒、150厘米/秒至300厘米/秒、150厘米/秒至250厘米/秒、 150厘米/秒至200厘米/秒、200厘米/秒至900厘米/秒、200厘米/秒至750厘米/秒、200厘米/ 秒至500厘米/秒、200厘米/秒至350厘米/秒、200厘米/秒至300厘米/秒、200厘米/秒至250 厘米/秒、250厘米/秒至900厘米/秒、250厘米/秒至750厘米/秒、250厘米/秒至500厘米/秒、 250厘米/秒至350厘米/秒、250厘米/秒至300厘米/秒、300厘米/秒至900厘米/秒、300厘米/ 秒至750厘米/秒、300厘米/秒至500厘米/秒、300厘米/秒至350厘米/秒、350厘米/秒至900 厘米/秒、350厘米/秒至850厘米/秒、350厘米/秒至800厘米/秒、350厘米/秒至750厘米/秒、 350厘米/秒至700厘米/秒、350厘米/秒至650厘米/秒、350厘米/秒至600厘米/秒、350厘米/ 秒至550厘米/秒、350厘米/秒至500厘米/秒、350厘米/秒至450厘米/秒、350厘米/秒至400 厘米/秒、400厘米/秒至900厘米/秒、400厘米/秒至850厘米/秒、400厘米/秒至800厘米/秒、 400厘米/秒至750厘米/秒、400厘米/秒至700厘米/秒、400厘米/秒至650厘米/秒、400厘米/ 秒至600厘米/秒、400厘米/秒至550厘米/秒、400厘米/秒至500厘米/秒、400厘米/秒至450 厘米/秒、450厘米/秒至900厘米/秒、450厘米/秒至850厘米/秒、450厘米/秒至800厘米/秒、 450厘米/秒至750厘米/秒、450厘米/秒至700厘米/秒、450厘米/秒至650厘米/秒、450厘米/ 秒至600厘米/秒、450厘米/秒至550厘米/秒、450厘米/秒至500厘米/秒、500厘米/秒至900 厘米/秒、500厘米/秒至850厘米/秒、500厘米/秒至800厘米/秒、500厘米/秒至750厘米/秒、 500厘米/秒至700厘米/秒、500厘米/秒至650厘米/秒、500厘米/秒至600厘米/秒、500厘米/ 秒至550厘米/秒、550厘米/秒至900厘米/秒、550厘米/秒至850厘米/秒、550厘米/秒至800 厘米/秒、550厘米/秒至750厘米/秒、550厘米/秒至700厘米/秒、550厘米/秒至650厘米/秒、 550厘米/秒至600厘米/秒、600厘米/秒至900厘米/秒、600厘米/秒至850厘米/秒、600厘米/ 秒至800厘米/秒、600厘米/秒至750厘米/秒、600厘米/秒至700厘米/秒、600厘米/秒至650 厘米/秒、650厘米/秒至900厘米/秒、650厘米/秒至850厘米/秒、650厘米/秒至800厘米/秒、 650厘米/秒至750厘米/秒、650厘米/秒至700厘米/秒、700厘米/秒至900厘米/秒、700厘米/ 秒至850厘米/秒、700厘米/秒至800厘米/秒、700厘米/秒至750厘米/秒、750厘米/秒至900 厘米/秒、750厘米/秒至850厘米/秒、750厘米/秒至800厘米/秒、800厘米/秒至900厘米/秒、 800厘米/秒至850厘米/秒、或850厘米/秒至900厘米/秒。術語"葉輪尖端速率"，意指當葉輪環(huán)繞其中心軸旋轉時，其最外部分的速率。
[0073] 在一些實施方案中，攪拌（以及任選的如本文所述的額外步驟)是在含有葉輪的容器中進行的，其中所述葉輪直徑與該容器體積之比是0.1至0.5、0.1至0.4、0.2至0.5、0.2至 0·4、0·3至0.5、或0.3至0.4。
[0074] 在一些實施方案中，攪拌（以及任選的如本文所述的額外步驟)是在含有葉輪的容器中進行的，其中所述葉輪直徑對該容器內徑之比是至少0.25、至少0.34、至少0.65、0.25 至 0.65、0.25至0.33、0.3至0.6、0.3至0.5、0.3至0.4、0.34至0.65、0.34至0.6、0.34至0.55、 0.37至0.55、0.4至0.65、0.4至0.6、0.4至0.5、或0.42至0.55。
[0075] 在一些實施方案中，攪拌包括將細胞和/或裂解細胞組合物混合從而使該細胞和/ 或裂解細胞組合物處于由如下雷諾數(shù)(Reynolds)描述的流動條件下：10至10,000、1，000至 10,000、1，500至10,000、或2,000至10,000。在一些實施方案中，攪拌過程中裂解的細胞乳液具有2,000或更多、3,000或更多、或5,000或更多、或2,000至10,000、3,000至10,000、或 5,000至10,000的雷諾數(shù)。
[0076] 在一些實施方案中，攪拌器皿可以具有2個葉輪。在一些實施方案中，所述葉輪是拉什頓葉片葉輪。在一些實施方案中，所述葉輪是以至少與最小的葉輪直徑相等的距離彼此分離。在一些實施方案中，所述葉輪尖端至尖端為30英寸至40英寸、33英寸至37英寸、33 英寸、34英寸、35英寸、36英寸或37英寸。在一些實施方案中，所述攪拌器皿具有至少10,000 升、至少20，OOO升、至少30，OOO升、至少40，OOO升或至少50，OOO升的容積。在一些實施方案中，所述攪拌器皿具有90英寸至110英寸、95英寸至105英寸、98英寸、99英寸、100英寸、101 英寸、或102英寸的內徑。在一些實施方案中，第一葉輪位于距攪拌器皿底部15英寸至20英寸、16英寸至19英寸、或17英寸至18英寸，而第二葉輪位于第一個葉輪之上60英寸至80英寸、65英寸至75英寸、68英寸、69英寸、70英寸、71英寸、72英寸、73英寸、74英寸、或75英寸。在一些實施方案中，以至少50rpm、至少60rpm、或至少70rpm攪拌裂解細胞組合物。在一些實施方案中，以50rpm至70rpm、50rpm至60rpm、或60rpm至70rpm攪拌裂解細胞組合物。
[0077]在一些實施方案中，所述方法還包括攪拌所述裂解細胞組合物。在一些實施方案中，攪拌裂解細胞組合物的方法使該裂解細胞組合物去乳化。
[0078]在一些實施方案中，去乳化過程中形成的油珠的平均粒度選自：5微米至50微米;5 微米至45微米;5微米至40微米;5微米至35微米;5微米至30微米;5微米至25微米;5微米至 20微米;5微米至15微米；10微米至50微米；10微米至45微米；10微米至40微米；10微米至35 微米；10微米至30微米；10微米至25微米；10微米至20微米；10微米至15微米；15微米至50微米；15微米至45微米；15微米至40微米；15微米至35微米；15微米至30微米；15微米至25微米；15微米至20微米；20微米至50微米；20微米至45微米;20微米至40微米；20微米至35微米；20微米至30微米；20微米至25微米；25微米至50微米;25微米至45微米；25微米至40微米；25微米至35微米；25微米至30微米；30微米至50微米;30微米至45微米；30微米至40微米;30微米至35微米；35微米至50微米；35微米至45微米;35微米至40微米;40微米至50微米;40微米至45微米;和45微米至50微米。在另一個實施方案中，去乳化過程中形成的油珠的平均粒度選自：至少10微米、至少15微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35 微米、及至少40微米或更大。在另一個實施方案中，去乳化過程中形成的油珠的平均粒度選自：至少10微米、至少15微米、至少20微米、及至少25微米。在一些實施方案中，平均粒度可以使用例如Beckman Coulter LS 13 320粒度分析儀(Beckman Coulter,Brea,CA)來測量。在一些實施方案中，平均粒度可以使用例如Malvern MS2000粒度分析儀（Malvern Instruments Ltd.，Worcestershire，United Kingdom)來測量。
[0079] 在一些實施方案中，使裂解細胞組合物經受乳化劑、酸、鹽、熱以及攪拌中的一種或多種以形成去乳化的裂解細胞組合物。
[0080] 在一些實施方案中，所述方法還包括將所述裂解及去乳化步驟組合在一起以形成一步裂解及去乳化步驟。
[0081 ]在一些實施方案中，所述方法還包括將所述裂解及去乳化步驟組合在一起以形成一步裂解及去乳化步驟，所述步驟包括提升該細胞及裂解細胞組合物的pH。在一些實施方案中，所述一步裂解及去乳化步驟包括將該細胞及裂解的細胞組合物的PH提升至約8或以上。在一些實施方案中，所述一步裂解及去乳化步驟包括添加堿來提升該細胞及裂解細胞組合物的pH。在一些實施方案中，所述一步裂解及去乳化步驟包括添加堿來將該細胞及該裂解細胞組合物的PH提升至約8或以上。
[0082] 在一些實施方案中，可以添加至所述一步裂解及去乳化步驟的堿選自上文中已描述的堿。在一些實施方案中，所述一步裂解及去乳化步驟的細胞及裂解細胞組合物的pH可以提升至選自如下的pH:約8或更高；約9或更高；約10或更高；約11或更高;和約12或更高。在其他實施方案中，所述一步裂解及去乳化步驟的細胞及裂解細胞組合物的PH可以提升至選自如下的pH: 7至13; 7至12; 7至11; 7至10; 7至9 ;8至13 ;8至12 ;8至11 ;8至10 ;8至9 ;9至12; 9至11 ;9至10; 10至12;和10至11。
[0083] 在一些實施方案中，所述細胞在合適的pH處進行裂解以形成去乳化的裂解細胞組合物。在一些實施方案中，通過添加上文中已描述的堿來得到合適的pH。在一些實施方案中，合適的pH選自7至13; 7至12; 7至11; 7至10; 7至9; 8至13; 8至12; 8至11; 8至10; 8至9 ;9至 13;9至12;9至11 ;9至10; 10至13; 10至12;和10至11。在其他實施方案中，合適的pH選自10至 13。在另外的實施方案中，合適的pH選自至少10、至少11、至少12、和至少13。
[0084] 在一些實施方案中，合適的pH通過以選自如下的量添加堿來得到：按重量（或體積)計，細胞培養(yǎng)液或組合物的約〇. 5%至約20%、約0.5%至約15%、約0.5 %至約10 %、約 0.5 %至約9 %、約0.5 %至約8 %、約0.5 %至約7 %、約0.5 %至約6 %、約0.5 %至約5 %、約 0.5%至約4%、約0.5%至約3%、約0.5%至約2%、和約0.5%至約1 %。在一個實施方案中，通過以按培養(yǎng)液重量計約0.5%至約20%的量添加堿來得到合適的pH。
[0085] 在其他實施方案中，合適的pH通過添加上文中已描述的酸來得到。在一些實施方案中，合適的pH選自7或更低；約6.5或更低；約6或更低；約5.5或更低；約5或更低；約4.5或更低；約4或更低;約3.5或更低；約3或更低;約2.5或更低；約2或更低；約1.5或更低；約1或更低;和約0.5或更低。在一些實施方案中，合適的pH選自6或更低。在一些實施方案中，合適的pH選自約0.5至約7;約0.5至約6.5;約0.5至約6;約0.5至約5.5;約0.5至約5;約0.5至約 4.5;約0.5至約4;約0.5至約3.5;約0.5至約3;約0.5至約2.5;約0.5至約2;約0.5至約1.5; 約0.5至約1;約1至約7;約1至約6.5;約1至約6;約1至約5.5;約1至約5;約1至約4.5;約1至約4;約1至約3.5;約1至約3;約1至約2.5;約1至約2;約1至約1.5;約1.5至約7 ;約1.5至約 6.5;約1.5至約6;約1.5至約5.5;約1.5至約5;約1.5至約4.5;約1.5至約4;約1.5至約3.5; 約1.5至約3;約1.5至約2.5;約1.5至約2;約2至約7;約2至約6.5;約2至約6;約2至約5.5;約 2至約5;約2至約4.5;約2至約4，約2至約3.5;約2至約3;約2至約2.5;約2.5至約7;約2.5至約6.5;約2.5至約6;約2.5至約5.5;約2.5至約5 ;約2.5至約4.5;約2.5至約4;約2.5至約 3.5;約2.5至約3;約3至約7;約3至約6.5;約3至約6;約3至約5.5;約3至約5;約3至約4.5;約 3至約4;約3至約3.5;約3.5至約7;約3.5至約6.5;約3.5至約6;約3.5至約5.5;約3.5至約5; 約3.5至約4.5;約3.5至約4;約4至約7;約4至約6.5;約4至約6;約4至約5.5;約4至約5;約4 至約4.5;約4.5至約7;約4.5至約6.5;約4.5至約6;約4.5至約5.5;約4.5至約5;約5至約7; 約5至約6.5;約5至約6;約5至約5.5;約5.5至約7;約5.5至約6.5;約5.5至約6;約6至約7;約 6至約6.5;及約6.5至約7。在一些實施方案中，合適的pH選自約0.5至約6。
[0086] 在一些實施方案中，所述方法包括將含有微生物油的未洗滌的裂解細胞去乳化以形成未洗滌的去乳化的裂解細胞組合物;然后從該未洗滌的去乳化的裂解細胞組成物分離該油。未洗滌的去乳化的裂解細胞組合物是指這樣的方法，其不用例如水或緩沖液(其隨后通過離心來去除）來洗滌裂解細胞組合物。洗滌裂解細胞組合物可減少從細胞獲得的油的總產量/收率。
[0087] 在可供選擇的實施方案中，所述裂解細胞組合物的洗滌次數(shù)可以減少1次、2次、3 次或更多次。在一些實施方案中，洗滌不超過1次、2次，或3次。
[0088] 在一些實施方案中，形成裂解細胞組合物、添加乳化劑至裂解細胞組合物、使裂解細胞組合物接觸酸或降低裂解細胞組合物的pH、使裂解細胞組合物接觸鹽、加熱裂解細胞組合物、以及攪拌裂解細胞組合物的各種組合可以在單一器皿中進行。在一些實施方案中，使細胞接觸酸或降低細胞的pH、添加乳化劑至裂解細胞組合物、使細胞接觸鹽、加熱細胞，以及攪拌細胞的各種組合可以在單一器皿中進行。在一些實施方案中，所述單一器皿包括發(fā)酵器皿。在一些實施方案中，所述發(fā)酵器皿可具有20，OOO升、至少50，OOO升、至少100，OOO 升、至少120,000升、至少150,000升、至少200,000升、或至少220,000升的容積。在一些實施方案中，所述發(fā)酵器皿可具有20,000升至220,000升、20,000升至100,000升、20,000升至 50,000升、50,000 升至 220,000 升、50,000升至 150,000 升、50,000升至 100,000升、100,000 升至 220，000升、100，000升至 150，000升、100，000 升至 120，000升、150，000升至 220，000 升、 150，000升至200，000升、或200，000升至220，000升的容積。
[0089] 在一些實施方案中，可將在器皿中形成的一定量的細胞和/或裂解細胞組合物轉移至一個或多個攪拌器皿中。在一些實施方案中，所述攪拌器皿可具有至少20，000升、至少 30，000升、至少40，000升或至少50，000升的容積。在一些實施方案中，所述攪拌器皿可具有 20,000升至 50,000 升、20,000 升至 40,000升、20,000升至 30,000 升、30,000升至 50,000升、 30，000升至40，000升或40，000升至50，000升的容積。
[0090] -般而言，本文所述的方法不利用有機溶劑來從微生物細胞獲得、分離，或者以其他方式回收微生物油。在一些實施方案中，從微生物細胞獲得微生物油時不使用有機溶劑。在另一個實施方案中，在本文所述方法的過程中，不將有機溶劑以足以獲得微生物油的量或濃度的添加至細胞、裂解細胞組合物，和/或油。有機溶劑包括極性溶劑、非極性溶劑、水混溶溶劑、水不混溶溶劑，及其組合。
[0091] 在一些實施方案中，所述方法還包括從去乳化的裂解細胞組合物分離油。在一些實施方案中，所述方法包括通過將去乳化的裂解細胞組合物離心而從該去乳化的裂解細胞組合物分離油。在一些實施方案中，通過允許去乳化的裂解細胞組合物靜置而從該去乳化的裂解細胞組合物分離油，其中所述油是使用重力從該去乳化的裂解細胞組合物分離的 (例如作為分離層）。在一些實施方案中，分離通過親脂性膜實現(xiàn)。在一些實施方案中，所述分離包括在10°C至100°c的溫度離心。在一些實施方案中，通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離所述油:首先提升pH(例如通過添加如上所述的堿），然后離心該去乳化的裂解細胞組合物以獲得該油。
[0092] 在一些實施方案中，通過向去乳化的裂解細胞組合物添加堿來提升所述去乳化的裂解細胞組合物的pH。可向去乳化的裂解細胞組合物添加的堿與上文所述的那些相同。在一些實施方案中，所述pH選自約7.5或更高;約8或更高；約9或更高；約10或更高；約11或更高；和約12或更高。在其他實施方案中，所述pH是選自如下的pH: 7至13; 7至12; 7至11; 7至 10;7至9;8至13;8至12;8至11 ;8至10;8至9;9至12;9至11;9至10 ;10至12;和10至11。
[0093] 在一些實施方案中，所述方法包括從去乳化的裂解細胞組合物分離油，所述分離是通過在至少l〇°C、至少20°C、至少25°C、至少30°C、至少35°C、至少40°C、至少45°C、至少50 。(：、至少55 °C、至少60 °C、至少65 °C、至少70 °C、至少75°C、至少80 °C、至少85°C、至少90 °C、至少95°C、或至少100°C的溫度離心所述去乳化的裂解細胞組合物來進行的。在一些實施方案中，所述方法包括從去乳化的裂解細胞組合物分離油，所述分離是通過在l〇°C至100°C、10 。(：至 90°C、10°C 至 80°C、20°C 至 100°C、20°C 至 90°C、20°C 至 80°C、25°C 至 100°C、25°C 至 90°C、 25 °C 至80 °C、25 °C 至75 °C、30 °C 至 100 °C、30 °C 至90 °C、30 °C 至80 °C、40 °C 至 100 °C、40 °C 至90 °(：、40°(：至80°(：、50°(：至100°(：、50°(：至90°(：、50°(：至80°(：、50°(：至70°(：、60°(：至100°(：、60°(：至 90°(：、60°(：至80°(：、60°(：至70°(：、70°(：至100°(：、70°(：至90°(：、70°(：至80°(：、80°(：至100°(：、80 1€ 至90°C、或90°C至100°C的溫度離心所述去乳化的裂解細胞組合物來進行的。
[0094] 在一些實施方案中，離心是以1千克每分鐘（kg/min)至500kg/分鐘、Ikg/分鐘至 400kg/分鐘、Ikg/分鐘至300kg/分鐘、Ikg/分鐘至200kg/分鐘、Ikg/分鐘至IOOkg/分鐘、 Ikg/分鐘至75kg/分鐘、Ikg/分鐘至50kg/分鐘、Ikg/分鐘至40kg/分鐘、Ikg/分鐘至30kg/分鐘、Ikg/分鐘至25kg/分鐘、Ikg/分鐘至IOkg/分鐘、IOkg/分鐘至500kg/分鐘、IOkg/分鐘至 400kg/分鐘、IOkg/分鐘至300kg/分鐘、IOkg/分鐘至200kg/分鐘、IOkg/分鐘至IOOkg/分鐘、 IOkg/分鐘至75kg/分鐘、IOkg/分鐘至50kg/分鐘、IOkg/分鐘至40kg/分鐘、IOkg/分鐘至 30kg/分鐘、20kg/分鐘至500kg/分鐘、20kg/分鐘至400kg/分鐘、20kg/分鐘至300kg/分鐘、 20kg/分鐘至200kg/分鐘、20kg/分鐘至IOOkg/分鐘、20kg/分鐘至75kg/分鐘、20kg/分鐘至 50kg/分鐘、20kg/分鐘至40kg/分鐘、25kg/分鐘至500kg/分鐘、25kg/分鐘至400kg/分鐘、 25kg/分鐘至300kg/分鐘、25kg/分鐘至200kg/分鐘、25kg/分鐘至IOOkg/分鐘、25kg/分鐘至 75kg/分鐘、25kg/分鐘至50kg/分鐘、30kg/分鐘至60kg/分鐘、30kg/分鐘至50kg/分鐘、 30kg/分鐘至40kg/分鐘、50kg/分鐘至500kg/分鐘、IOOkg/分鐘至500kg/分鐘、或200kg/分鐘至500kg/分鐘的（去乳化的裂解細胞組合物進入離心機的)進料速率進行的。
[0095] 在一些實施方案中，所述方法包括以l，000g至25,00(^、1，00(^至20,00(^、1，000 8 至10,00(^、2,00(^至25,00(^、2,00(^至20,00(^、2,00(^至15,00(^、3,00(^至25,00(^、3， OOOg至20，000g、5,000g至25,000g、5,000gS20,000g、5,000gSl5,000g、5,000gSl0, 000g、5 ,OOOg至8,000g、10 ,OOOg至25,000g、15 ,OOOg至25,000g、或至少l,000g、至少2， OOOg、至少4，000g、至少5，000g、至少7，000g、至少8，000g、至少 10，000g、至少 15，000g、至少 20，000g、或至少25，000g的離心力對去乳化的裂解細胞組合物進行離心。如本文所用的， "g"意指標準重力或約9.8m/s 2。在一些實施方案中，所述方法包括以4，OOOrpm至14， 000印111、4,000印1]1至10,000印111、6,000印1]1至14,000印111、6,000印1]1至12,000印111、8,000至14， 000rpm、8，OOOrpm至12，OOOrpm、或8，OOOrpm至10，OOOrpm離心去乳化的裂解細胞組合物。 [00 96] 在一些實施方案中，可以通過例如傾析、撇除（skimming)、真空處理、栗送、吸取 (sucking off )、抽取(drawing off )、虹吸（siphoning)，或以其他方式從分離的組合物表面回收微生物油來回收所述油。
[0097] 在一些實施方案中，所述方法包括將回收的油進行干燥以從該油去除水。在一些實施方案中，干燥該油可包括但不限于加熱該油以蒸發(fā)水。在一些實施方案中，干燥后所述油具有按油的重量（或體積）百分比計為低于3%、低于2.5%、低于2%、低于1.5%、低于 1 %、低于0.5%、低于0.1 %、或0%的水含量。在一些實施方案中，干燥后所述油具有按油的重量(或體積）百分比計為〇%至3%、0%至2.5%、0%至2%、0%至1.5%、0%至1%、0%至 0.5%、0.1%至3%、0.1%至2.5%、0.1%至2%、0.1%至1.5%、0.1%至1%、0.1%至 0.5%、0.5%至3%、0.5%至2.5%、0.5%至2%、0.5%至1.5%、0.5%至1%、1%至3%、1% 至2.5%、1 %至2%、1 %至1.5%、1.5%至3%、1.5%至2.5%、1.5%至2%、2%至3%、2%至 2.5%、或2.5%至3%的水含量。
[0098] 本發(fā)明公開了可以通過本文所述任一種方法從微生物細胞獲得的微生物油。在一些實施方案中，所述油包含按重量(或體積)計至少30%的花生四烯酸。在一些實施方案中，所述油包含按重量(或體積)計至少30%的二十二碳六烯酸。
[0099]茴香胺值(AV)根據(jù)AOCS官方方法Cd 18-90來確定。在一個實施方案中，本文所述的油具有低于約50;低于約40;低于約30;低于約20;低于約15;或低于約10的AV。在一些實施方案中，所述油具有低于約50的AV。術語茴香胺值意指次級反應產物(例如油的氧化過程中產生的醛和酮）的測量值。
[0100]過氧化物值(PV)根據(jù)AOCS官方方法Cd 8-53來確定。在一個實施方案中，本文所述的油具有低于約20meq/kg;低于約10meq/kg;或低于約5meq/kg的PV。在一些實施方案中，所述油具有低于5meq/kg的PV。術語過氧化物值意指初級反應產物(例如油的氧化過程中產生的過氧化物和氫過氧化物)的測量值。如本文所用，過氧化物值以meq/kg測量。
[0101 ] 在一些實施方案中，所述油具有IOOppm或更低、95ppm或更低、90ppm或更低、85ppm 或更低、80ppm或更低、75ppm或更低、70ppm或更低、65ppm或更低、60ppm或更低、55ppm或更低、50ppm或更低、45ppm或更低、40ppm或更低、35ppm或更低、30ppm或更低、25ppm或更低、 20ppm或更低、15ppm或更低、IOppm或更低、9ppm或更低、8ppm或更低、7ppm或更低、6ppm或更低、5ppm或更低、4ppm或更低、3ppm或更低、2ppm或更低、或Ippm或更低的磷含量。在一些實施方案中，所述油具有約8ppm或更低的磷含量。
[0102] 在一些實施方案中，所述油包含一種或多種PUFA。在一些實施方案中，所述油包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少 50 %、至少60 %、至少70 %或至少80 %的PUFA(按PUFA重量計）。在一些實施方案中，所述油包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50 %、至少60 %、至少70 %或至少80 %的DHA(按DHA重量計），和/或至少10 %、至少 15%、或至少20%的DPA n-6(按DPAn-6重量計），和/或至少10%、至少15%、或至少20%的 EPA(按EPA重量計），和/或至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、或至少80%的ARA(按ARA重量計）。在一些實施方案中，所述油包含低于50%、低于40%、低于 30%、低于20%、低于15%、低于10%、或低于5%的EPA(按EPA重量計）。在一些實施方案中，所述油包含低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、或低于5%的 DHA(按DHA重量計）。在一些實施方案中，油包含按重量(或體積)計低于10%、低于5%、低于 2%、低于1 %、或低于0.5%的固醇類。
[0103] 在一些實施方案中，油包含按重量(或體積)計至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%、至少95%、或50%至95%、50%至90%、50%至85%、50%至80%、50%至 75%、60%至95%、60%至90%、60%至85%、70%至95%、70%至90%、70%至85%、75%至 95%、75%至90%、或75%至85%的甘油三酯。
[0104] 在一些實施方案中，所述甘油三酯包含按重量(或體積)計至少10 %、至少20%、至少30 %、至少35%、至少40 %、至少50%、至少60 %、至少70%或至少80 %的DHA。在一些實施方案中，所述甘油三酯包含按重量(或體積)計至少10%、至少20%、至少30%、至少35%、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、或至少 80%的ARA。在一些實施方案中，所述甘油三酯包含按重量(或體積)計至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少15%、至少10%、或至少5%的EPA。
[0105] 在一些實施方案中，通過本文所述方法的任一種獲得和/或回收的微生物油是粗制油。在另一個實施方案中，本文所述的油是精制油。"粗制油"是從微生物細胞獲得的、未經進一步加工的油。"精制油"是通過用精制、漂白，和/或脫臭的標準流程處理粗制油而獲得的油。參見例如，美國專利No. 5，130，242。在一些實施方案中，精制包括但不限于:苛性精制法(caustic ref ining)、脫膠、酸處理、堿處理、冷卻、加熱、漂白、脫臭、脫酸，及其組合。
[0106] 在一些實施方案中，所述方法包括濃縮包含微生物細胞的發(fā)酵液。在一些實施方案中，該方法包括濃縮裂解細胞組合物。如本文使用的，"濃縮"意指從組合物去除水。濃縮可以包括但不限于蒸發(fā)、化學干燥、離心等等，及其組合。在一些實施方案中，將細胞組合物或裂解細胞組合物濃縮以提供按裂解細胞組合物的重量(或體積)計至少4%，至少5%，至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，或至少30%的油濃度。在一些實施方案中，將細胞組合物或裂解細胞組合物濃縮以提供按裂解細胞組合物的重量(或體積)計4 %至40 %、4 % 至30%、4%至20%、4%至15%、5%至40%、5%至30%、5%至20%、10%至40%、10%至 30%、10%至20%、15%至40%、15%至30%、20%至40%、20%至30%、25%至40%、或30% 至40 %的油濃度。
[0107] 供本發(fā)明使用的微生物細胞的有效培養(yǎng)條件包括但不限于允許生產油的有效的培養(yǎng)基、生物反應器、溫度、PH、以及氧條件。有效的培養(yǎng)基是指任何這樣的培養(yǎng)基，其中通常培養(yǎng)微生物細胞，例如破囊壺菌目微生物細胞。此類培養(yǎng)基通常包含水性基質，其具有可同化的碳源、氮源、與磷酸鹽源，以及適當?shù)柠}、礦物質、金屬，及其他營養(yǎng)物，如維生素。供本發(fā)明使用的微生物細胞可以培養(yǎng)于常規(guī)的發(fā)酵生物反應器、搖瓶、試管、微滴定盤，以及培養(yǎng)皿(petri plate)內。
[0108] 在一些實施方案中，微生物細胞包含按重量(或體積)計至少30%的油，按重量(或體積)計至少35 %的油，按重量（或體積）計至少40 %的油，按重量（或體積)計至少50 %的油，按重量(或體積)計至少60 %的油，按重量(或體積)計至少70 %的油，或按重量(或體積）計至少80%的油。在一些實施方案中，供本發(fā)明使用的微生物細胞能夠產生至少0.1克每升每小時（g/L/h)的 DHA，至少 0 · 2g/L/h 的 DHA，至少 0 · 3g/L/h 的 DHA，或至少 0 · 4g/L/h 的 DHA。在一些實施方案中，供本發(fā)明使用的微生物細胞能夠產生至少0.01克每升每小時(g/L/h)的 ARA，至少0.05g/L/h的ARA，至少0. lg/L/h的ARA，至少0.2g/L/h的ARA，至少0.3g/L/h的ARA，或至少0.4g/L/h的ARA。
[0109] 在一些實施方案中，根據(jù)本文所述方法的任一種而獲得的油、用過的生物質，或其組合可以直接地用作食品或食品成分，如下列兒童食品，嬰兒配方、飲料、醬汁、基于乳品的食品（例如奶、酸乳、奶酪與冰淇淋）、油類(例如烹調油(cooking oil)或色拉調味汁(salad dressing))，以及烘焙食物;營養(yǎng)補充劑(例如以膠囊或片劑形式）；用于任何非人動物的飼料或飼料補充劑(例如其產物(例如肉、奶、或蛋)供人消耗的動物）；食物補充劑；以及藥物 (于直接或附加療法應用中）。術語"動物"意指屬于動物界(kingdom Animalia)的任何生物，且包括任何人類動物，和由其得到產品（例如奶、蛋、禽肉、牛肉、豬肉或羊肉）的非人動物。在一些實施方案中，該油和/或生物質可以用于海產食品中。海產食品來源于，但不限于魚、奸與貝類。術語"產物"包括由此類動物得到的任何產品，包括但不限于肉、蛋、奶或其他產物。當將該油和/或生物質喂予此類動物時，多不飽和油可并入此類動物的肉、奶、蛋或其它產品中以增加這些油中它們的含量。實施例
[oho] 實施例1
[0111] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。將未洗滌的細胞培養(yǎng)液以180RPM的速度攪拌并加熱至60 °C。通過添加50wt%NaOH溶液以將培養(yǎng)液pH調整至7-7.5，以及以基于培養(yǎng)液重量添加0.5%的量添加 Alca丨ase? 2.4FG (可從Novozymes (Frankl inton，NC)得到）來裂解細胞。在維持攪拌之時，通過添加按重量計98 %的出5〇4溶液來將裂解細胞組合物的pH調整至4。以按裂解細胞組合物的重量計2%的量添加固體NaCl，并將該組合物加熱至90°C且保持20小時。通過添加 50wt%Na0H溶液將該組合物的pH調整至7·5-8·5，然后以8000RPM離心（Thermo Scientific SorvelI ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出91.7%的DHA(按重量計DHA)。
[0112] 實施例2
[0113] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。通過添加按重量計20 %的秘〇4溶液以將細胞培養(yǎng)液的pH調整至2,然后將培養(yǎng)液加熱至90°C且保持45小時，從而形成去乳化的裂解細胞組合物。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油:添加50wt%Na0H溶液以將該組合物的pH 調整至7.5_8.5,然后以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出51.62 %的DHA(以DHA重量計）。
[0114] 實施例3
[0115] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。通過添加按重量計20 %的秘〇4溶液以將細胞培養(yǎng)液的pH調整至2;以按培養(yǎng)液的重量計2%的量添加固體NaCl;以及將培養(yǎng)液加熱至90°C并保持18小時，從而形成去乳化的裂解細胞組合物。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機）5分鐘以提供粗制油，其產出38.82 %的DHA(以DHA重量計）。
[0116] 實施例4
[0117] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (300g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計2%的按重量計98%的出3〇4溶液，并將培養(yǎng)液加熱至90°C4小時。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油:添加50wt %Na0H溶液將該組合物的pH調整至7-8.5，在90°C 保持21小時，并以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出72%的DHA(以重量計DHA)。所述粗制油具有145的茴香胺值(AV)。
[0118] 實施例5
[0119] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。將未洗滌的細胞培養(yǎng)液以180RPM的速度攪拌并加熱至60 °C。通過添加50wt %Na0H以將培養(yǎng)液pH調整至7-7.5，以及以基于培養(yǎng)液重量0.5%的量添加 Alealas.e? 2.4FG (可從Novozymes (Frankl inton，NC)得到）來裂解細胞。在維持攪拌之時，通過添加按重量計98 %的H2S〇4溶液以將裂解細胞組合物的pH調整至4,然后將組合物加熱至90°C。在90°C45小時之后，以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R 離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出81 %的DHA(以DHA重量計）。所述粗制油具有14.5的AV。
[0120] 實施例6
[0121] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (300g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計2.5%的按重量計98%的出3〇4溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90°C5小時。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油:添加50wt %NaOH溶液以將該組合物的pH調整至7-8.5，在90°C幾個小時后，以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機） 5分鐘以提供粗制油，其產出92.5%的DHA(以DHA重量計）。
[0122] 實施例7
[0123] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計2%的按重量計98%的出3〇4溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90 °C5-6小時。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油:添加50wt %NaOH溶液以將pH調整至7-8.5，在90°C幾個小時后，以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出82.63%的DHA(以DHA重量計）。
[0124] 實施例8
[0125] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp.))的細胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計1 %的按重量計98 %的出3〇4溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90 °C 5-10小時。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：添加50wt %NaOH溶液以將pH調整至7-8.5，并以 8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出42%的DHA(以DHA重量計）。
[0126] 實施例9
[0127] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp.))的細胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計3 %的按重量計98 %的出3〇4溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90 °C 1-5小時。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：添加50wt %Na0H溶液以將pH調整至7-8.5，并以 8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出88%的DHA(以DHA重量計）。
[0128] 實施例10
[0129] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計4%的按重量計70%的硝酸溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90°C1小時。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：添加50wt %Na0H溶液將pH調整至7-8.5，并以8000RPM將組合物離心(Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出82% 的DHA(以DHA重量計）。
[0130] 實施例11
[0131] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計2 %的按重量計70 %的硝酸溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90°C5-6小時。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：添加50wt %NaOH溶液以將pH調整至7-8.5，并以 8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出58.5%的DHA(以DHA重量計）。
[0132] 實施例12
[0133] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計2.5 %的按重量計70 %的硝酸溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90 °C5小時。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油:添加50wt %NaOH溶液以將pH調整至7-8.5，在90°C幾個小時后，以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出74 %的DHA(以DHA重量計）。
[0134] 實施例13
[0135] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp.))的細胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計4%的磷酸，然后將培養(yǎng)液加熱至90°C5小時。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：添加50的％他0招容液將?!1調整至7-8.5，在90°(：幾個小時后，以80001?^將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機）5分鐘以回收粗制油，該組合物的45g 樣品產出1.0 mL的粗制油。
[0136] 實施例14
[0137] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp.))的細胞培養(yǎng)液 (350g)于60°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計8%的磷酸，然后將培養(yǎng)液加熱至90°C3小時。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：添加50的％他0招容液將?!1調整至7-8.5，在90°(：幾個小時后，以80001?^將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機）5分鐘以回收粗制油，該組合物的45g 樣品產出〇.5mL的粗制油。
[0138] 實施例15
[0139] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (2000L)置于以190rpm攪拌的處理罐內。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計4 %的按重量計98 %的出3〇4溶液，然后將培養(yǎng)液加熱至90-95 °C 1小時。通過如下從該去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：將該組合物冷卻至75°C，添加50wt%Na0H溶液以將pH調整至7-8.5，將組合物混合過夜，并以1754RPM、8L/分鐘將組合物在線（in I ine) 離心以提供粗制油，其產出93 %的DHA (以DHA重量計），以及具有0.69meq的過氧化物值 (PV)、23.9的AV、及1.04的游離脂肪(FFA)含量的粗制油。
[0140] 實施例16
[0141] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (550L)置于以190rpm攪拌的處理罐內。將細胞培養(yǎng)液加熱至60°C，通過添加50wt. %NaOH溶液將pH調整至7.3-7.5，以及以按培養(yǎng)液的重量計0.5%的量添加堿性蛋白酶(alcalase)。2 小時后，通過添加按重量計98 %的H2S〇4將裂解細胞組合物的pH調整至4,并加熱至90°C，同時維持攪拌。在90°C20小時后，通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油:將組合物冷卻至75°(：，通過添加50?丨.％此0!1溶液將？!1調整至8.5，將組合物保持過夜，并以 1754RPM、8L/分鐘將組合物在線離心以提供粗制油，其產出84%的DHA(以DHA重量計），以及具有Omeq的過氧化物值(PV )、7.3的AV、及0.17的FFA含量的粗制油。
[0142] 實施例17
[0143] 將含有微生物細胞(被孢霉屬(Mortierella))的細胞培養(yǎng)液（2500-3000升)置于傾析罐(decanting tank)內數(shù)個小時以沉降。一旦沉降，將50-60%無生物質的液體抽出棄去。然后使?jié)饪s的未洗滌的巴氏消毒的細胞培養(yǎng)液通過與處理罐相連(in line to)的高剪切混合機(Siemens ULTRA-Turrax UTL 1000/10于60Hz)。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計3 %的按重量計98 %的賊〇4溶液以將pH調整至IjO. 9至1.5，并將培養(yǎng)液加熱至94 °C 20-24小時，或直至ImL的培養(yǎng)液在IOmL的去離子水中的稀釋液產出25μπι 或更小的粒度為止。用脫氧水將去乳化的裂解細胞組合物稀釋至10%的固體含量（用 Omnimark Uwave濕度分析儀產生的數(shù)目），并且如果加水造成溫度下降至低于85°C則再加熱至85°C。通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：添加50wt%Na0H溶液以將組合物的pH調整至7.8-8.2，允許該組合物混合30分鐘或者直至樣本的離心顯示完全沒有乳液層為止，并以1750RPM、7升/分鐘的流速在線離心（Seital SR1010)該組合物7-10小時以回收粗制油。
[0144] 三個分離批次的細胞培養(yǎng)液各自獨立進行以上的方法。
[0145] 第1批次粗制油產出86.6%的ARA(以ARA重量計），以及具有26.1的AV和0.39meq的 PV的干燥的、過濾的粗制油。
[0146] 第2批次粗制油產出87.6%的ARA(以ARA重量計），以及具有14的AV和0.31meq的PV 的干燥的、過濾的粗制油。
[0147] 第3批次粗制油產出85 %的ARA(以ARA重量計），以及具有24.7的AV和0.51meq的PV 的干燥的、過濾的粗制油。
[0148] 實施例18
[0149] 將含有微生物細胞(被孢霉屬(Mortierella))的細胞培養(yǎng)液（1000 mL)于70°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計4%的硝酸(70% 溶液）以將pH調整至0.7-1.0，并將培養(yǎng)液加熱至90°C同時以200rpm的速度攪拌30小時。通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油:添加50wt % NaOH溶液以將組合物的pH調整至8.0-8.2,并以8000g將組合物離心（Thermo Sorvell ST 40R)5分鐘以提供粗制油，其產出74.13%的ARA(以ARA重量計），以及具有27.9的AV的粗制油。
[0150] 實施例19
[0151] 將含有微生物細胞(被孢霉屬(Mortierella))的細胞培養(yǎng)液（1000 mL)于70°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物：添加按培養(yǎng)液重量計15%的磷酸 (85%溶液）以將pH調整至0.7至1.5,并將組合物加熱至90 °C同時以200rpm的速度攪拌50小時。通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：添加50w/w NaOH溶液以將組合物的pH調整至8.0-8.2,并以8000g將組合物離心(Thermo Sorvell ST 40R)5分鐘以提供粗制油，其產出42.61 %的ARA(以ARA重量計）。粗制油具有16.1的AV。
[0152] 實施例20
[0153] 將含有微生物細胞(被孢霉屬(Mortierella))的細胞培養(yǎng)液（1000 mL)于70°C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計6%的鹽酸(32% 溶液）以將pH調整至O . 7-1.5，并將培養(yǎng)液加熱至90°C同時以200rpm的速度攪拌50小時。通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：添加50w/w NaOH溶液以將組合物的pH調整至8.0-8.2,并以8000g將組合物離心（Thermo Sorvell ST 40R)5分鐘以提供粗制油，其產出72.61 %的ARA(以ARA重量計）。粗制油具有11.1的AV。
[0154] 實施例21
[0155] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp.))的細胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加12.5wt % NaOH 溶液至細胞培養(yǎng)液以將pH調整至11，添加按培養(yǎng)液重量計2 %的NaCl，并將組合物加熱至90 °C。在90°C25小時后，通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出71 %的 DHA (以DHA重量計）。
[0156] 實施例22
[0157] 將含有微生物細胞(被孢霉屬(Mortierella))的未洗滌的細胞培養(yǎng)液(2129.8kg) 于70°C巴氏消毒1小時，然后經過與處理罐相連的高剪切混合機（Siemens ULTRA-Turrax UTL 1000/10于60Hz)。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計3.5% 的按重量計98%的硫酸溶液以將?!1調整到0.7(或0.07)至1.5，加熱至90°(：，并保持28小時同時以200RPM的速度攪拌。通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：中和該組合物并通過添加50 %NaOH和按組合物重量計2 %NaCl以將pH調整至8.0，然后將組合物離心 (SeitalSRlOlO)以提供粗制油，其產出77.4%的ARA(以ARA重量計），以及具有12.4的AV、 2.27 %的FFA含量、及0.13meq的PV的粗制油。
[0158] 實施例23
[0159] 將含有微生物細胞(寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii))的未洗滌的細胞培養(yǎng)液（7 5 0 g )于6 0 °C巴氏消毒1小時。通過使細胞培養(yǎng)液以1 2，0 0 0 P SI經過均質機 (Microfluidizer M110)兩次而將細胞機械裂解。將裂解細胞組合物置于圓形燒瓶中并通過如下去乳化:添加按組合物重量計4 %的硫酸(98 %純)溶液，加熱至90 °C同時以200RPM攪拌，并維持28小時。通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：中和該組合物并通過添加50 %NaOH溶液將pH調整至8.0，然后以8000g將組合物離心（Thermo Sorval I ST 40R)5分鐘以提供粗制油，其產出45%的DHA(以DHA重量計）（基于FAME分析），以及具有 12 · 35的AV和1 · 09meq的PV的粗制油。
[0160] 實施例24
[0161] 將含有微生物細胞(裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.))的未洗滌的細胞培養(yǎng)液(750g)于60°C巴氏消毒1小時并置于以250RPM攪拌的IL燒瓶中。將溫度提升至60 °C以減少由于粘性所致的混合時間。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計4%的50%Na0H以將pH調整至12.62;加熱至90 °C;以及允許反應26小時直至pH降至 7.75為止。通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：以8000g將組合物離心 (Thermo Sorvall ST40R)5分鐘以提供粗制油，其產出88%的DHA(以DHA重量計）（基于FAME 分析)。
[0162] 實施例25
[0163] 將含有微生物細胞(裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.))的未洗滌的細胞培養(yǎng)液(750g)于60°C巴氏消毒1小時并置于以250RPM攪拌的IL燒瓶中。將溫度提升至60 °C以減少由于粘性所致的混合時間。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計4%的50 %NaOH溶液以將pH調整至12.93;加熱至90°C;以及允許反應26小時直至pH降至7.95為止。通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：以8000g將組合物離心 (Thermo Sorval I ST40R) 5分鐘以提供粗制油，其產出82 · 5 %的DHA(以DHA重量計）（基于 FAME分析)。
[0164] 實施例26
[0165] 將含有微生物細胞(裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.))的未洗滌的細胞培養(yǎng)液(750g)于60°C巴氏消毒1小時并置于以250RPM攪拌的IL燒瓶中。將溫度提升至60 °C以減少由于粘性所致的混合時間，并將PH提升至7.5。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計3.5%的50%NaOH溶液以將pH調整至12.28;加熱至90°C ;以及允許反應32小時直至pH降至7.88為止。通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：以 8000g將組合物離心（Thermo Sorvall ST 40R)5分鐘以提供粗制油，其產出88%的DHA(以 DHA重量計）（基于FAME分析）。
[0166] 實施例27
[0167] 將含有微生物細胞(裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.))的未洗滌的細胞培養(yǎng)液(750g)于60°C巴氏消毒1小時并置于以250RPM攪拌的IL燒瓶中。將溫度提升至60 °C以減少由于粘性所致的混合時間。通過如下形成去乳化的裂解細胞組合物:添加按培養(yǎng)液重量計4.0%的50%Na0H溶液以將pH調整至12.87;加熱至90°C ;以及允許反應36小時直至pH 降至8.15為止。通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：以8000g將組合物離心 (Thermo Sorvall ST 40R)5分鐘以提供粗制油，其產出84%的DHA(以DHA重量計）（基于 FAME分析)。
[0168] 比較實施例1
[0169] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬物種（Schizochytrium sp .))的細胞培養(yǎng)液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。以180RPM的速度攪拌未洗滌的細胞培養(yǎng)液并加熱至60 °C。通過添加 50wt %Na0H溶液以將細胞的pH調整至7-7.5，和以基于培養(yǎng)液重量0.5%的量添加 Alca丨ase:? 2.4FG (可從Novozymes (Frankl inton，NC)得到）來裂解細胞。在維持攪拌之時，通過如下將裂解細胞組合物去乳化：同時添加 12.5wt%Na0H溶液以將pH調整至10-11并以按組合物重量計2 %的量添加 CaCl2，然后將該組合物加熱至90 °C并保持68小時。通過如下從去乳化的裂解細胞組合物分離微生物油：以8000RPM將組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油，其產出62.5%的DHA(按DHA重量計）以及具有 43.8的AV的粗制油。
【主權項】
1. 一種用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸的微生物油的方法，其中該方法包括： (a) 裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合物； (b) 將所述裂解細胞組合物去乳化以形成去乳化的裂解細胞組合物； (c) 從所述去乳化的裂解細胞組合物分離所述油；以及 (d) 回收所述油；其中(b)包括降低所述裂解細胞組合物的pH。2. 權利要求1的方法，其中（a)或(b)中至少一個還包括將所述細胞或組合物加熱到至少70。。。3. 權利要求1或2的方法，其中（a)或(b)中至少一個還包括將所述細胞或組合物加熱到約 70°C 至約 100°C。4. 前述任一權利要求的方法，其中(b)還包括添加乳化劑至所述裂解細胞組合物。5. 前述任一權利要求的方法，其中(b)還包括將所述pH降低至約6或更低。6. 前述任一權利要求的方法，其中（b)還包括將所述裂解細胞組合物的pH降低至約0.5 至約6。7. 前述任一權利要求的方法，其中（b)還包括以按重量計所述裂解細胞組合物的約 0.5 %至約20 %的量添加酸。8. 前述任一權利要求的方法，其中（b)還包括以按重量計所述裂解細胞組合物的約 0.05 %至約20 %的量添加鹽。9. 前述任一權利要求的方法，其中(b)還包括攪拌所述裂解細胞組合物。10. 前述任一權利要求的方法，其中(a)還包括攪拌所述細胞。11. 前述任一權利要求的方法，其中所述酸選自：硫酸、磷酸、鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、次氯酸、亞氯酸、氯酸(chloric)、高氯酸(perchloric)、氟硫酸、硝酸、氟銻酸、氟硼酸、六氟磷酸、鉻酸、硼酸、乙酸、檸檬酸、甲酸，及其組合。12. 前述任一權利要求的方法，其中所述酸為硫酸。13. 前述任一權利要求的方法，其中(a)的細胞是未洗滌的。14. 前述任一權利要求的方法，其中(a)的細胞包含于發(fā)酵液中。15. 前述任一權利要求的方法，其中（c)還包括離心所述去乳化的裂解細胞組合物。16. 前述任一權利要求的方法，其中所述多不飽和脂肪酸選自ω-3脂肪酸，ω-6脂肪酸，及其混合物。17. 前述任一權利要求的方法，其中所述多不飽和脂肪酸選自二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(ARA)、γ -亞麻酸(GLA)、二高-γ -亞麻酸(DGLA)、十八碳四稀酸(stearidonic acid,SDA)，及其混合物。18. 權利要求17的方法，其中所述多不飽和脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)。19. 權利要求17的方法，其中所示多不飽和脂肪酸是花生四烯酸(ARA)。20. 前述任一權利要求的方法，其中所述微生物細胞是藻類、酵母、真菌、原生生物，或細菌細胞。21. 前述任一權利要求的方法，其中所述微生物細胞來自被孢霉屬(Mort i ere I Ia )、隱甲藻屬（Crypthecodinium)，或破囊壺菌目（Thraustochytriales) ·22. 權利要求20的方法，其中所述微生物細胞來自破囊壺菌目。23. 權利要求21的方法，其中所述微生物細胞來自破囊壺菌屬(Thraustochytrium)、裂殖壺菌屬（Schizochytrium)，或其混合物。24. 權利要求20的方法，其中所述微生物細胞來自高山被孢霉(Mortierella Alpina)。25. 前述任一權利要求的方法，其中所述裂解細胞組合物包含液體、細胞碎片以及微生物油。26. 前述任一權利要求的方法，其中不使用有機溶劑而從所述細胞獲得所述油。27. 前述任一權利要求的方法，其中所述去乳化的裂解細胞組合物的平均粒度是25微米或更小。28. 權利要求4-27任一項的方法，其中所述乳化劑是離子性乳化劑。29. 權利要求28的方法，其中所述離子性乳化劑是陰離子乳化劑，其選自陰離子硫酸鹽乳化劑、陰離子磺酸鹽乳化劑、陰離子磷酸鹽乳化劑、陰離子羧酸鹽乳化劑，及其組合。30. 權利要求29的方法，其中所述離子性乳化劑是陰離子硫酸鹽乳化劑，其選自月桂基硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、月桂醇聚醚硫酸鈉（sodium laureth sulfate)、月桂基醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉 (sodium myreth sulfate)，及其組合。31. 權利要求4-30任一項的方法，其中以按重量計所述裂解細胞組合物的0.2%至10% 的量添加所述乳化劑。32. 權利要求8-30任一項的方法，其中所述鹽選自下組：堿金屬鹽、堿土金屬鹽、硫酸鹽，及其組合。33. 前述任一權利要求的方法，其中(d)的油是粗制油。34. 權利要求33的方法，其中(d)還包括精制所述粗制油以獲得精制油。35. 前述任一權利要求的方法，其中所述油包含按重量計至少30 %的花生四烯酸。36. 前述任一權利要求的方法，其中所述油包含按重量計至少30 %的二十二碳六烯酸。37. 前述任一權利要求的方法，其中所示油具有低于約50的茴香胺值。38. 前述任一權利要求的方法，其中所述油具有約8ppm或低的磷含量。39. 前述任一權利要求的方法，其中所示油具有低于約5meq/kg的過氧化物值。40. 通過前述任一權利要求的方法獲得的油。41. 前述任一權利要求的方法，其中將(a)和(b)組合在一起以形成一步裂解及去乳化步驟。42. 前述任一權利要求的方法，其中（c)還包括提升所述去乳化的裂解細胞組合物的 pH〇43. -種用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸的微生物油的方法，其中所述方法包括： (a) 裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合物； (b) 將所述裂解細胞組合物去乳化以形成去乳化的裂解細胞組合物； (c) 從所述去乳化的裂解細胞組合物分離所述油；以及 (d) 回收所述油；其中將(a)和(b)組合在一起以形成一步裂解及去乳化步驟，所述步驟包括提升pH。44. 權利要求43的方法，其中所述一步裂解及去乳化步驟包括將pH提升至約8或以上。45. 權利要求43的方法，其中所述一步裂解及去乳化步驟包括添加堿以將pH提升至約8 或以上。46. -種用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸的微生物油的方法，其中該方法包括： (a) 在適合形成去乳化的裂解細胞組合物的pH裂解包含所述微生物油的細胞； (b) 從所述去乳化的裂解細胞組合物分離所述油；以及 (c) 回收所述油；其中所述去乳化的裂解細胞組合物在所述裂解過程中獲得。
【文檔編號】A61K31/20GK105960235SQ201480074728
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2014年12月19日
【發(fā)明人】M·巴克, N·塔巴耶內賈德, G·尚克, N·F·萊寧格爾, S·K·L·馬修斯
【申請人】帝斯曼知識產權資產管理有限公司

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