一種呼吸道合胞體病毒疫苗及其制備方法與應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種呼吸道合胞體病毒疫苗及其制備方法與應用。本發(fā)明的呼吸道合胞體病毒疫苗的活性成分為呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫抑制劑；所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述免疫抑制劑為環(huán)孢菌素A。通過試驗證明：本發(fā)明的呼吸道合胞體病毒疫苗不但能增強免疫動物后中和病毒抗體水平的體液免疫反應，同時還能抑制過強的細胞免疫反應，有效和特異性的抑制炎癥相關(guān)病理反應，而且技術(shù)成熟，成本低，無副作用，易于推廣。
【專利說明】
一種呼吸道合胞體病毒疫苗及其制備方法與應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種呼吸道合胞體病毒疫苗及其制備方法與 應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 呼吸道合胞體病毒RSV (Respiratory Syncytial Virus)，為副黏病毒科單鏈負義 RNA病毒，主要引發(fā)新生兒與老年人下呼吸道疾病，也是導致1歲以下嬰兒肺炎的主要原因 之一。流行病學數(shù)據(jù)顯示，大約60%的新生兒在RVS流行季受該病毒感染，5歲以下兒童約 有18 %感染過RSV病毒，其中重癥病例約為18%，住院病例比例約為20%，門診病例15%。 感染者中，全球每年約有3萬嬰幼兒死于RSV感染。每年約1/13五歲以下兒童因 RSV就 醫(yī)，其中60% RSV門診病例為2-5歲兒童。在中國，就重慶市一個地區(qū)，因 RSV感染導致的 兒科病毒性肺炎住院病例約為40%，基本與流感病例比例相同。
[0003] 盡管RSV作為一種嚴重危害嬰幼兒健康的疾病，經(jīng)過近50年的研究，全球仍沒有 一種被批準的有效、安全的疫苗問世。進入臨床研究的RSV疫苗有許多種類：（1)研制的是 滅活疫苗，可以產(chǎn)生抗病毒蛋白的抗體，但是中和抗體水平低并且在服苗者肺部產(chǎn)生了由 Th2和粒細胞介導的嚴重的炎性細胞浸潤，導致接種者在接觸病毒后產(chǎn)生嚴重疾病，甚至引 起死亡；（2)亞單位疫苗，RSV病毒外殼蛋白F和G是主要具有中和表位的蛋白，在動物模型 上發(fā)現(xiàn)選擇用純化后的F和G蛋白作為疫苗可以有效的產(chǎn)生中和抗體抑制病毒復制，并且 抑制Th2細胞的激活，但是在人免疫后出現(xiàn)了病毒感染加重的病例，安全性不能保證，僅基 于RSV F蛋白的亞單位疫苗，具有很好的抑制病理性免疫反應作用但是免疫原性不佳；（3) 通過滴鼻給藥能夠刺激局部和系統(tǒng)免疫應答的減毒活疫苗，大部分的減毒疫苗包括應用最 多的"cpts248/404"對大于6個月的嬰兒有很好效果，但是對6個月以下嬰兒肺部會產(chǎn)生 中度炎性反應，同樣安全性不能保證。除此之外，還有很多臨床研究的RSV疫苗，但至今為 止全球仍沒有一種被批準的有效、安全的RSV疫苗問世。針對RSV疫苗開發(fā)過程中所面對 兩個主要障礙：1)獲得高滴度中和抗體水平；2)降低炎性細胞在肺部產(chǎn)生炎癥損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種呼吸道合胞病毒疫苗。
[0005] 本發(fā)明提供的呼吸道合胞病毒疫苗的活性成分為呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫 抑制劑。
[0006] 上述呼吸道合胞病毒疫苗中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表 中序列2所示。
[0007] 上述呼吸道合胞病毒疫苗中，所述免疫抑制劑為環(huán)孢菌素 A、地塞米松、雷帕霉素 或環(huán)磷酰胺；所述免疫抑制劑具體為環(huán)孢菌素 A。
[0008] 上述呼吸道合胞病毒疫苗中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白和所述環(huán)孢菌素 A的質(zhì) 量比為 1:100-100:1。
[0009] 上述呼吸道合胞病毒疫苗中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白和所述環(huán)孢菌素 A的質(zhì) 量比為1:1、2:10、4:10、6:10或8:10。
[0010] 上述呼吸道合胞病毒疫苗中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白和所述環(huán)孢菌素 A的質(zhì) 量比進一步具體為1:1。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備呼吸道合胞病毒疫苗的方法。
[0012] 本發(fā)明提供的制備呼吸道合胞病毒疫苗的方法包括如下步驟：
[0013] 將環(huán)孢素 A溶液與呼吸道合胞病毒G蛋白混勻，得到呼吸道合胞病毒疫苗。
[0014] 上述方法中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0015] 上述方法中，所述環(huán)孢素 A溶液中的環(huán)孢素 A與所述呼吸道合胞病毒G蛋白質(zhì)量 比為 1:100-100:1。
[0016] 上述方法中，所述環(huán)孢素 A溶液中的環(huán)孢素 A與呼吸道合胞病毒G蛋白的質(zhì)量比 具體為1:1、2:10、4:10、6:10或8:10。
[0017] 上述方法中，所述環(huán)孢素 A溶液的制備方法：將環(huán)孢素 A溶于丙二醇中，得到混合 液；將所述混合液與PBS溶液等體積混勻，得到所述環(huán)孢素 A溶液。
[0018] 上述方法中，所述環(huán)孢素 A在所述丙二醇中的濃度為0. 2mg/ml。
[0019] 上述方法中，所述PBS溶液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水；溶質(zhì)及其在PBS溶液中 的濃度為：135mM NaCl、2. 7mM KC1、I. 5mM NaH2P04、8mM NaHPO4;所述 PBS 溶液的 pH 為 7. 4。
[0020] 上述呼吸道合胞病毒G蛋白在制備呼吸道合胞病毒的疫苗中的應用也屬于本發(fā) 明的保護范圍。
[0021] 上述呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫抑制劑在制備呼吸道合胞病毒的疫苗中的應 用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0022] 上述應用中，所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0023] 上述應用中，所述免疫抑制劑為環(huán)孢菌素 A。
[0024] 上述呼吸道合胞病毒疫苗在如下（1)-(12)中至少一種中的應用也屬于本發(fā)明的 保護范圍：
[0025] (1)制備提高哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性IgG抗體水平的產(chǎn)品；
[0026] (2)制備提高哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性中和抗體水的產(chǎn)品；
[0027] (3)制備抑制哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性T淋巴細胞增殖的產(chǎn)品；
[0028] (4)制備抑制哺乳動物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特異性T淋巴細胞增殖的 產(chǎn)品；
[0029] (5)制備誘導哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生的產(chǎn)品；
[0030] (6)制備誘導哺乳動物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特異性調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn) 生的廣品；
[0031] (7)制備促進哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性調(diào)節(jié)性T細胞分泌IL10、IL21和 /或⑶40L的產(chǎn)品；
[0032] (8)制備促進哺乳動物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特異性調(diào)節(jié)性T細胞分泌 IL10、IL21 和 / 或 CD40L 的產(chǎn)品；
[0033] (9)制備降低哺乳動物的呼吸道合胞病毒的病毒載量的產(chǎn)品；
[0034] (10)制備抑制哺乳動物的肺部炎性細胞的增殖的產(chǎn)品；
[0035] (11)制備降低呼吸道合胞病毒對哺乳動物肺部組織的損傷的產(chǎn)品；
[0036] (12)制備抑制哺乳動物的炎癥反應的產(chǎn)品。
[0037] 上述應用中，所述抑制哺乳動物的炎癥反應是通過降低肺指數(shù)實現(xiàn)的。
[0038] 本發(fā)明將呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫抑制劑（CSA) -起免疫動物，免疫后可以 誘導出一群抗原特異性Treg細胞，從而開發(fā)出誘發(fā)高水平的中和抗體和無病理性損傷的 呼吸道合胞病毒疫苗。通過試驗證明：本發(fā)明的呼吸道合胞病毒疫苗不但能增強免疫動物 后中和病毒抗體水平的體液免疫反應，同時還能抑制過強的細胞免疫反應，有效和特異性 的抑制炎癥相關(guān)病理反應，而且技術(shù)成熟，成本低，無副作用，易于推廣。
【附圖說明】
[0039] 圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測pET28a-N0G質(zhì)粒。其中1為DL15000 DNA Marker ; 2為DL2000 DNA Marker ;3為pET28a-noG質(zhì)粒；4為限制性內(nèi)切酶Nco I/Xho I消化后的 pET28a-noG 質(zhì)粒。
[0040] 圖2為SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白（G蛋白）在大腸桿菌中的表達。其中，1為 蛋白質(zhì)標準分子量；2為E. coli BL21 pET28a-noG未經(jīng)IPTG誘導破膜后上清；3為E. coli BL21 pET28a-noG 未經(jīng) IPTG 誘導破膜后包涵體；4 為 E.coli BL21 pET28a-noG 經(jīng) 0.5mM IPTG誘導破膜后上清；5為E. coli BL21 pET28a-noG經(jīng)0. 5mM IPTG誘導破膜后包涵體；6 為 E.coli BL21 pET28a-noG 經(jīng) ImM IPTG 誘導破膜后上清；7 為 E.coli BL21 pET28a-noG 經(jīng)ImM IPTG誘導破膜后包涵體；8為E. coli BL21 pET28a-noG經(jīng)2mM IPTG誘導破膜后 上清；9 為 E. coli BL21 pET28a-noG 經(jīng) 2mM IPTG 誘導破膜后包涵體；10 為 E. coli BL21 pET28a-noG經(jīng)3mM IPTG誘導破膜后上清；
[0041] 11 為 E. coli BL21 pET28a 經(jīng) 3mM IPTG 誘導破膜后包涵體；12 為 E. coli BL21 pET28a經(jīng)5mM IPTG誘導破膜后上清；13為E.coli BL21 pET28a經(jīng)5mM IPTG誘導破膜后 包涵體。
[0042] 圖3為Western Blot驗證原核表達NOG蛋白。圖3a為羊抗RSV抗體的驗證結(jié) 果；其中 1 為 E.coli BL21 pET28a-noG 經(jīng) 2mM IPTG 誘導破膜后上清；2 為 E.coli BL21 pET28a-noG經(jīng)2mM IPTG誘導破膜后包涵體；3為His-Tag G蛋白對照。圖3b為小鼠抗His Tag抗體的驗證結(jié)果；其中，1為E. coli BL21 pET28a-noG經(jīng)2mM IPTG誘導破膜后上清；2 為E. coli BL21 pET28a-noG經(jīng)2mM IPTG誘導破膜后包涵體；3為His-Tag G蛋白對照；4 為His-Tag IL-17蛋白對照。
[0043] 圖4為不同免疫劑量免疫后小鼠的中和抗體水平和T細胞增殖水平。
[0044] 圖5為肺部病毒載量檢測免疫后小鼠的肺部病毒載量。
[0045] 圖6為稱量肺重量檢測聯(lián)合免疫小鼠攻毒后肺指數(shù)。
[0046] 圖7為肺部病理切片檢測免疫后小鼠的肺部病理變化。
[0047] 圖8為ELISA檢測免疫后兔子的IgG抗體水平檢測結(jié)果和T細胞增殖實驗檢測免 疫后兔子的T細胞增殖水平檢測結(jié)果。圖8a為ELISA檢測免疫后兔子的IgG抗體水平檢 測結(jié)果；圖8b為T細胞增殖實驗檢測免疫后兔子的T細胞增殖水平檢測結(jié)果。
[0048] 圖9為流式檢測免疫攻毒后小鼠肺部灌洗液中Treg細胞絕對數(shù)量。
[0049] 圖10為流式檢測免疫攻毒后小鼠脾臟Treg細胞分泌IL-IO水平、IL-21水平、 ⑶40L水平。圖IOa為流式檢測免疫攻毒后小鼠脾臟Treg細胞分泌IL-IO水平；圖IOb為 流式檢測免疫攻毒后小鼠脾臟Treg細胞分泌IL-21水平；圖IOc為流式檢測免疫攻毒后小 鼠脾臟Treg細胞分泌⑶40L水平。
[0050] 圖11為流式檢測免疫攻毒后小鼠肺門淋巴結(jié)Treg細胞分泌IL-10水平和⑶40L 水平。圖Ila為流式檢測免疫攻毒后小鼠肺門淋巴結(jié)Treg細胞分泌IL-10水平；圖Ilb為 流式檢測免疫攻毒后小鼠肺門淋巴結(jié)Treg細胞分泌CD40L水平。
[0051] 圖12為ELISA方法檢測RSV疫苗在兔子上免疫后的不同時間點的IgG抗體水平 和流式檢測第123天血液中T細胞的增殖情況。圖12a為ELISA方法檢測RSV疫苗在兔子 上免疫后的不同時間點的IgG抗體水平；圖12b為流式檢測第123天血液中T細胞的增殖 情況。
[0052] 圖13為流式檢測T細胞增殖結(jié)果。
[0053] 圖14為ELISA檢測RSV疫苗與HBV疫苗免疫后小鼠的IgG抗體水平檢測。圖14a 為實驗分組及各組的免疫情況；圖14b為ELISA檢測RSV疫苗與HBV疫苗免疫后小鼠的IgG 抗體水平檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0054] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0055] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0056] ECL試劑是瑞典GE Healthcare Eurpoe公司的產(chǎn)品。
[0057] 滅活疫苗FI-RSV 的制備方法：IO7TCID5qRSV病毒（美國 ATCC，catalog no. VR-26?) 經(jīng)甲醛72h，37°C反應后，利用50000g高速離心Ih純化后制得。
[0058] 環(huán)孢素 A(CSA)是臺上市化學制藥有限公司公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號國藥準字 H10940111。
[0059] 載體pET28a (+)是Novagen公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號69864-3。
[0060] 大腸桿菌BL21(DE3)是天根生化科技（北京）有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號 CB105-02。
[0061] 1640培養(yǎng)基是邁晨科技有限公司的產(chǎn)品，貨號CM10040。
[0062] 山羊抗RSV多克隆抗血清是美國Meridian公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號B656860G。
[0063] HBV疫苗是華大制藥有限公司的產(chǎn)品。
[0064] 實施例1、呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗的制備 [0065] 一、G蛋白的獲得
[0066] 1、G蛋白的編碼基因的獲得
[0067] 本發(fā)明的呼吸道合胞病毒G蛋白的編碼基因序列如序列表中序列1所示，呼吸道 合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0068] 2、表達載體pET28a_noG的構(gòu)建
[0069] 通過全基因合成的方法合成步驟1的呼吸道合胞病毒G蛋白的編碼基因序列，用 限制性內(nèi)切酶NcoI與XhoI對呼吸道合胞病毒G蛋白的編碼基因序列和載體pET28a(+)進 行雙酶切，連接，得到重組載體，將重組載體命名為pET28a-noG。對pET28a-noG載體進行酶 切鑒定的結(jié)果如圖1所示。
[0070] 對pET28a-noG載體進行測序驗證，結(jié)果表明：pET28a-noG載體為將載體 pET28a(+)的NcoI與XhoI酶切位點間的DNA替換為序列表中序列1所示的呼吸道合胞病 毒G蛋白的編碼基因，保持載體pET-28a (+)的其他序列不變得到的重組載體，表達糖蛋白 G0
[0071] 3、重組菌的獲得
[0072] 將步驟2中的pET28a_n〇G載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化后的菌株命名為 BL21 (DE3)/pET28a-noG，同時設(shè)置轉(zhuǎn)化pET-28a(+)空載體的BL21 (DE3)作為對照，轉(zhuǎn)化后 的菌株命名為 BL21 (DE3)/pET-28a (+)。
[0073] 4、重組菌的誘導表達
[0074] 用不同濃度的異丙基巰基半乳糖苷（IPTG)誘導G蛋白的表達，具體步驟如下：挑 取過夜生長的BL21 (DE3)/pET28a-n〇G的單菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)至對數(shù) 生長期（〇D 6。。= CL 5)，加入終濃度分別為 CL 5mmol/L、lmmol/L、2mmol/L、3mmol/L、5mmol/L 的IPTG，于37°C誘導4小時。
[0075] 誘導結(jié)束后收集菌體，使用PBS溶液反復清洗3次菌體后，將菌體超聲破碎， 12000rpm離心，將上清液與重懸后的沉淀（包涵體）分別進行SDS-PAGE電泳，驗證蛋白表 達，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出：轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pET-28a-G的大腸桿菌BL21(DE3) 在37°C、0. 5mM IPTG誘導4h可以得到大量原核表達的呼吸道合胞病毒G蛋白（約35kDa)。
[0076] 二、G蛋白抗原性的驗證
[0077] 將步驟一中的得到的G蛋白在12%的SDS-PAGE膠上分離，然后使用Bio-Rad轉(zhuǎn)膜 系統(tǒng)將G蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。
[0078] 將膜浸泡在5%的脫脂奶粉（PBST)中，于37°C條件下封閉2h，PBST洗膜3次。將膜 浸泡在用3%的脫脂奶粉（PBST)稀釋2000倍的山羊抗RSV多克隆抗血清（美國Meridian 公司產(chǎn)品）或稀釋6000倍小鼠抗His-Tag(Abmart公司）中，于37°C條件下孵育1小時， PBST洗膜3次。
[0079] 將膜浸泡在用3%脫脂奶粉（PBST)稀釋1000倍的HRP?？股窖騃gG或HRP羊抗 小鼠 IgG(美國Santa Cruz公司產(chǎn)品）中，于37°C條件下孵育1小時，PBST洗膜3次。參 照使用說明，利用電化學發(fā)光（ECL)法檢測免疫復合物。誘導表達的目的蛋白經(jīng)過羊抗RSV 抗體和小鼠抗His Tag抗體進行Western Blot雜交驗證。
[0080] 羊抗RSV抗體的驗證結(jié)果如圖3a所示，小鼠抗His Tag抗體的驗證結(jié)果如圖3b 所示。結(jié)果表明：表達的目的蛋白確實為不含有His Tag的RSV G蛋白，重組G蛋白具有良 好抗原性，可以被抗RSV抗體識別。
[0081] 三、G蛋白的提取和純化
[0082] 1、一級種子液的獲得
[0083] 挑取BL21 (DE3)/pET28a-noG的單菌落于50ml加了適量抗生素的LB培養(yǎng)基中， 37°C，220轉(zhuǎn)振蕩8-10小時，得到一級種子液。
[0084] 2、二級種子液的獲得
[0085] 將步驟1得到的一級種子液以5 %的接種量接入500ml的LB培養(yǎng)基（含抗生素） 中，37°C，220轉(zhuǎn)振蕩8-10小時，得到二級種子液。
[0086] 3、G蛋白的獲得
[0087] 將步驟2得到的一級種子液以5% -10%的接種量接入發(fā)酵罐中，當OD = 3時，以 I. 2ml/min 加入補料；當 OD = 24 時，開始加入 IM IPTG 20ml，2h 加入 IM IPTG 10ml，4h 后 加入IM IPTG 10ml。誘導結(jié)束后收集菌液，所述菌液中含有呼吸道合胞病毒G蛋白。
[0088] 4、G蛋白的提取及純化
[0089] (1)將步驟3得到的含有G蛋白的菌液用IOOk超濾器（溫度：室溫；壓力：不超過 kg/cm2)進行清洗、濃縮，濃縮后用2-3倍體積PBS再清洗；
[0090] (2)經(jīng)高壓均質(zhì)機破碎兩次，壓力850-900kg/cm2,收集均衆(zhòng)物，將均衆(zhòng)物重懸于 PBS中，每Ig均衆(zhòng)物（濕重，16000rpm，15min測定）溶于IOml的PBS，標記、用50ml錐形離 心管分裝后，_20°C保存。
[0091] (3)將解凍后的均漿物16000rpm，15min離心收集沉淀即為包涵體，將收集到的包 涵體按照濕菌重的 1:20,用含有 1% TritonX-IOO 的 BufferA (BufferA 配方：50mM Tris -HCl、5mM EDTAUOOmM Nacl、PH8. 5)重懸清洗。
[0092] (4) 16000rpm，15min離心棄上清液，收集沉淀，上清液、沉淀分別留樣檢測SDS，沉 淀按照濕菌重的1:20用含有1 % TritonX-IOO的BufferA重懸清洗。
[0093] (5) 16000rpm，15min離心棄上清液，收集沉淀，上清液、沉淀分別留樣檢測SDS ;沉 淀按照濕菌重1:20用PBS重懸清洗。
[0094] (6) 16000rpm，15min離心棄上清液，收集沉淀，上清液、沉淀分別留樣檢測SDS。
[0095] (7)將2. 5g經(jīng)過（6)收集的沉淀（包涵體）重懸于BufferB中（BufferB配方：8M 尿素、20mM Tris-HCl、5mM EDTAUOOmM NaclUOmM DTT、PH8. 5)，待包涵體溶解于 BufferB 后，得到變性的蛋白溶液；在低速攪拌下，以5ml/min的速度將50ml變性的蛋白溶液加入到 950ml 的 BufferC(BufTer C 配方：700mM 尿素、20mM Tris-HCl、500mM 精氨酸、ImM 胱胺二 鹽酸鹽、5mM半胱胺酸、15%甘油、PH9.0)中，低溫（4°C )攪拌（彡100rmp)40h。
[0096] (8)取經(jīng)過上述（7)處理后的蛋白溶液，16000rpm/min，4°C離心收上清液，轉(zhuǎn)移至 (麗8000-14000)透析袋中進行透析，復性液：透析液（V:V) = 1:10,低溫（4°C )透析24h， 每12h更換1次透析液。
[0097] (9) 16000rpm，10min，4°C離心，收集透析袋中的復性溶液上清液，SDS-PAGE檢測， 可見明顯目的蛋白（35kDa)。
[0098] (10)取上述（9)處理后的復性溶液上清液，轉(zhuǎn)移至（MW8000-14000)透析袋，放 入30% PEG8000溶液中，4°C濃縮，5-8h，透析液體積濃縮至原體積1/3~1/5,12000rpm， lOmin，4°C離心，收集上清液，加入2%甘露醇，3%葡萄糖，5mmol精氨酸（W/V)，溶解后，經(jīng) 0. 22um濾膜過濾，IOml西林瓶分裝，5. Oml/瓶，-80°C冷凍，低溫真空干燥后密封保存（含 水量< 1. 0% )，得到純化后的G蛋白，即所述抗原。按凍干程序操作將G蛋白凍存，凍干程 序結(jié)束后干燥、壓蓋、鋁蓋封裝，得到G蛋白凍干品。
[0099] 四、呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗的制備
[0100] 將環(huán)孢素 A (CSA)溶于丙二醇（環(huán)孢素 A的濃度為0. 2mg/ml)中，加入等體積PBS 溶液（135禮恥(：1、2.711111((：1、1.51111恥氏?04、81111恥冊04卬!17.4)，混勻，得到疫苗溶劑 ； 將步驟三制備得到的G蛋白凍干品溶于疫苗溶劑中，得到呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗，其 中，環(huán)孢素 A與G蛋白的質(zhì)量比為I :100-100 :1 ;在下面的實施例中采用環(huán)孢素 A與G蛋白 的質(zhì)量比為1:1、2:10、4:10、6:10、8:10的呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗進行試驗。
[0101] 實施例2、呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗免疫小鼠后抗體水平檢測
[0102] -、各組疫苗免疫小鼠
[0103] 實驗材料：6_8周齡雌性BALB/c小鼠，購自復旦大學實驗動物部，為清潔級，分9 組，每組5只。實驗期間使用無菌水及食物喂養(yǎng)，光照周期為12小時。
[0104] 實驗用疫苗分成實施例1的四制備的呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組（G+CSA)、亞 單位疫苗組（G)、PBS組（陰性對照）、FI-RSV組（陽性對照）。呼吸道合胞體病毒（RSV)疫 苗組中根據(jù)CSA和G蛋白質(zhì)量不同又分成（lug CSA+lug G蛋白）組、（2ug CSA+10ug G蛋 白）組、（4ug CSA+10ug G 蛋白）組、（6ug CSA+10ug G 蛋白）組、（8ug CSA+10ug G 蛋白） 組、（IOug CSA+10ug G蛋白）組，如表1所示。
[0105] 表1、各組疫苗中G蛋白與CSA的質(zhì)量
[0107] 將上述各組疫苗分別于第0天、14天對6-8周齡雌性BALB/c小鼠進行背部皮 下免疫。PBS組中PBS溶液的劑量100 μ I、FI-RSV組中FI-RSV滅活疫苗的劑量50 μ 1 5 X IO7TCID 病毒量。
[0108] 二、各組疫苗免疫小鼠后抗體水平檢測
[0109] 分別于免疫0、14、28天后采血檢測血清中抗體水平。具體操作如下：
[0110] (1)血清分離
[0111] 將采集到的血液置于37°C溫箱放置2小時，待凝集后，置于離心機中，3000rpm離 心10分鐘，徹底分離血清后，將血清小心吸出，置于-80°C保存。
[0112] (2)病毒中和檢測
[0113] A、將血清置于56°C水浴放置30分鐘，使補體充分失活；用含2%的胎牛血清的 MEM培養(yǎng)基，按2倍梯度稀釋血清，將稀釋后的血清加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔75 μ 1。
[0114] Β、分別加入25 μ I 104TCID50的RSV病毒懸液，混合均勻，4°C孵育2小時；加入 100 μ 1含I. 5X IO4個細胞的!fep-2細胞懸液（MEM+5%胎牛血清），將細胞置于無菌培養(yǎng)箱 中，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)72h。
[0115] C、將孔內(nèi)的液體小心吸出，PBST洗板3次；加入80%丙酮-PBS溶液，置于4°C孵 育15min ;將孔內(nèi)的液體吸出，室溫干燥。
[0116] D、加入5%脫脂奶粉（PBST)，37°C放置Ih，PBST洗板3次。
[0117] E、使用3 %脫脂奶粉（PBST)，將山羊抗RSV多克隆抗血清稀釋5000倍，加入96孔 細胞培養(yǎng)板，每孔100 μ 1，37°c放置1小時，PBST洗板3次。
[0118] F、每孔加入100μ1用3%脫脂奶粉（PBST)稀釋2000倍的HRP?？股窖騃gG，37°C 放置1小時，PBST洗板3次。
[0119] G、每孔加入100 μ 1的TMB顯色液，于37°C避光顯色15分鐘。
[0120] H、每孔加入50 μ 1的0. 2mol/L硫酸終止反應。
[0121] I、測定出每孔的光密度值（0D450nm/620nm)。中和抗體滴度的判定以至少低于 50 %陽性對照的光密度值為依據(jù)。
[0122] 結(jié)果如圖4所示：PBS組小鼠血清中的IgG水平最低，表明基本上不具備免疫效 果；FI-RSV組產(chǎn)生了較高的IgG水平；G組以及（IOug G蛋白+IOug CSA)組均產(chǎn)生一定水 平的IgG，并且不同比例的呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗產(chǎn)生的IgG水平具有一定差異性。 (l〇ug G蛋白+IOug CSA)組混合免疫小鼠可產(chǎn)生較為理想的高中和抗體滴度。
[0123] 上述結(jié)果表明呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組能夠誘導機體產(chǎn)生很高的體液免 疫反應，并且提高哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性IgG抗體水平和哺乳動物的呼吸道合 胞病毒特異性中和抗體水平。
[0124] 實施例3、呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗免疫小鼠后T淋巴細胞擴增的檢測
[0125] -、各組疫苗免疫小鼠
[0126] 實驗材料：6_8周齡雌性BALB/c小鼠，購自復旦大學實驗動物部，為清潔級，分9 組，每組5只。實驗期間使用無菌水及食物喂養(yǎng)，光照周期為12小時。
[0127] 實驗用疫苗分組及劑量同實施例2中的步驟一。
[0128] 將上述各組疫苗分別于第0天、14天對6-8周齡雌性BALB/c小鼠進行背部皮下免 疫。
[0129] 二、T淋巴細胞擴增的檢測
[0130] 在上述步驟一末次免疫后的第7天處死小鼠，在無菌條件下，取小鼠脾臟，研碎， 用紅細胞裂解液除去紅細胞，并過尼龍柱除去B細胞制成單細胞懸液（T淋巴細胞），PBS液 洗3次，離心并進行細胞計數(shù)，用1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度到I X IO6個/ml，每組細胞懸液 分3份加入96孔培養(yǎng)板中，每孔細胞總數(shù)為4X IO5個。其中一份加實施例1制備的G抗原 (呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)至終濃度為5mg/ml (實驗組），一份加終濃度為0. lmg/ml PMA (佛波酯）和lmg/ml Ion (離子霉素）（陽性對照），一份加 BSA至終濃度為2mg/ml (陰 性對照），培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT (四甲基偶氮唑鹽），培養(yǎng)4h后，2000rpm離心5分鐘， 棄細胞上清，添加 IOOmL DMSO(二甲基亞砜），37°C溫箱放置15min后，酶標儀讀取490nm 處的OD值，計算刺激指數(shù)（stimulated index，SI)，SI =(實驗組OD-培養(yǎng)基0D) / (細胞 OD-培養(yǎng)基0D)。其中，實驗組OD是指G抗原刺激的細胞讀取的OD值；培養(yǎng)基OD是指培養(yǎng) 基讀取的OD值；細胞OD是指未經(jīng)G抗原刺激的細胞（陰性對照）讀取的OD值。
[0131] 結(jié)果如圖4所示：各組為5只實驗組內(nèi)小鼠的平均值土標準差；PBS組基本上 刺激T細胞的效應很低，表明如果不聯(lián)合抗原，幾乎不能對T細胞產(chǎn)生明顯的刺激；G組和 FI-RSV組均產(chǎn)生高水平的刺激T細胞的效應，這表明沒有CSA組分都具有較強的細胞免疫 效果。另外，呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗中不同比例的CSA和G蛋白具有不同的刺激T 細胞的效應作用：（6ug CSA+10ug G蛋白）組和（8ug CSA+10ug G蛋白）組刺激T細胞響應 最強，（lug CSA+lug G 蛋白）組、（2ug CSA+10ug G 蛋白）組、（4ug CSA+10ug G 蛋白）組 都表現(xiàn)出一定的刺激T細胞的效應，（IOug CSA+10ug G蛋白）組刺激T細胞的響應最弱， 說明這一配比抑制效應不完全。
[0132] 以上結(jié)果說明可以有效抑制抗原特異性的細胞免疫反應，且能達到中和抗體水平 較高的組是呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗中（IOug CSA+10ug G蛋白）組。（IOug CSA+10ug G蛋白）組疫苗可以抑制哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性T淋巴細胞增殖；可以抑制哺 乳動物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特異性T淋巴細胞增殖。
[0133] 實施例4、被RSV病毒攻擊后的免疫小鼠的肺病毒載量檢測
[0134] -、各組疫苗免疫小鼠
[0135] 實驗材料：6_8周齡雌性BALB/c小鼠，購自復旦大學實驗動物部，為清潔級，分9 組，每組5只。實驗期間使用無菌水及食物喂養(yǎng)，光照周期為12小時。
[0136] 實驗用疫苗分成呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組（G+CSA)、CSA組、亞單位疫苗組 (G)、PBS組（陰性對照）、FI-RSV組（陽性對照）。呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組中CSA 和G蛋白質(zhì)量均為10ug，如表2所示，同時以未感染病毒的小鼠（Non-infection)作對照。 Γηη7? 圭9義々Η選常cb t=; rcA的話縣
[0139] 將上述各組疫苗分別于第0天、14天對6-8周齡雌性BALB/c小鼠進行背部皮下 免疫。PBS組中PBS溶液的劑量為100 μ 1、FI-RSV組中FI-RSV滅活疫苗的劑量為50 μ 1 5 X IO7TCID 病毒量。
[0140] 二、被RSV病毒攻擊后的免疫小鼠的肺病毒載量
[0141] 在上述步驟一末次免疫后第7天，通過滴鼻使小鼠感染RSV病毒，RSV病毒量按照 6 X 105TCID50/每只小鼠，5天之后將小鼠處死，取肺組織，勻漿后，使用TCID50滴定法檢測 小鼠肺部病毒載量。
[0142] 具體操作如下：在離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10 1到10 '將稀釋 好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100 μ 1 ;在 每孔加入細胞懸液100 μ 1，使細胞量達到2 X IO5~3 X 10 5個/ml，設(shè)正常細胞對照，正常細 胞對照作兩縱排，即100 μ 1生長液+100 μ 1細胞懸液。逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀 察5-7天；按Karber法計算結(jié)果。
[0143] 小鼠肺部病毒載量如圖5所不：PBS組和CSA組小鼠肺部病毒載量最尚，說明在沒 有先前注射疫苗抗原的情況下，小鼠出現(xiàn)了比較嚴重的病毒感染；FI-RSV組和G組病毒載 量有所降低，說明起到了一定抑制病毒復制作用；(G+CSA)組病毒載量最低，與PBS組有顯 著性差異。
[0144] 以上結(jié)果表明疫苗誘發(fā)機體產(chǎn)生的中和抗體水平的強弱直接與病毒感染后的病 毒清除相關(guān)，疫苗可以降低哺乳動物的呼吸道合胞病毒的病毒載量。
[0145] 實施例5、被RSV病毒攻擊后的免疫小鼠的肺指數(shù)檢測
[0146] 一、各組疫苗免疫小鼠
[0147] 實驗材料：6-8周齡雌性BALB/c小鼠，購自復旦大學實驗動物部，為清潔級，分9 組，每組5只。實驗期間使用無菌水及食物喂養(yǎng)，光照周期為12小時。
[0148] 實驗用疫苗分成呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組（G+CSA)、CSA組、亞單位疫苗組 (G)、PBS組（陰性對照）、FI-RSV組（陽性對照）。呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組中G蛋 白和CSA質(zhì)量均為10ug，如表2所示，同時以未感染病毒的小鼠（Non-infection)作對照。
[0149] 將上述各組疫苗分別于第0天、14天對6-8周齡雌性BALB/c小鼠進行背部皮下 免疫。PBS組中PBS溶液的劑量為100 μ 1、FI-RSV組中FI-RSV滅活疫苗的劑量為50 μ 1 5 X IO7TCID 病毒量。
[0150] 二、被RSV病毒攻擊后的免疫小鼠的肺指數(shù)檢測
[0151] 在上述步驟一末次免疫后第7天，通過滴鼻使小鼠感染RSV病毒，RSV病毒量按照 6Χ 105TCID50/每只小鼠，5天之后將小鼠處死，稱量小鼠體重，而后去肺組織稱量重量。肺 指數(shù)計算公式=肺組織質(zhì)量/小鼠體重。
[0152] 結(jié)果如圖6所示：Non-inf ection組小鼠肺指數(shù)最低，說明肺部沒有明顯的 炎癥反應；PBS組和FI-RSV組最高，CSA組和G組相對較低，（G+CSA)組小鼠肺指數(shù)與 Non-infection組相比沒有顯著差異，說明發(fā)明的RSV疫苗可以有效抑制免疫疫苗引起的 炎癥相關(guān)反應的發(fā)生。
[0153] 三、RSV病毒攻擊免疫后小鼠組織切片
[0154] 在上述步驟一末次免疫后第7天，通過滴鼻使小鼠感染RSV病毒，RSV病毒量按 照6 X 105TCID50/每只小鼠，5天之后將小鼠處死，取肺組織切片，蘇木精-伊紅染色（H&E) 后，觀察小鼠肺部組織的病變情況（同時以沒有攻毒的naive小鼠作為對照）。具體操作如 下：將小鼠處死后，取肺組織，置于10%福爾馬林中固定3-7天，經(jīng)過脫水，石蠟包埋，切片， 蘇木精-伊紅染色，封片幾步后，在顯微鏡下觀察。另外，對小鼠肺部病理進行打分，打分 標準為：（1)細支氣管周圍和支氣管浸潤（2)細支氣管和細支氣管腔滲出液；(3)血管周圍 浸潤；（4)單核細胞數(shù)量；（5)薄壁組織肺炎。以上5種情況又各分為嚴重（4分），較重（3 分），一般（2 分），輕微（1 分），具體參見文獻 "Respiratory Syncytial Virus Induces Pneumonia, Cytokine Response, Airway Obstruction, and Chronic Inflammatory Infiltrates Associated with Long-Term Airway Hyperresponsiveness in Mice"〇
[0155] 結(jié)果如圖7所示：Non-inf ection組小鼠肺部在血管周圍和支氣管周圍沒有明顯 的淋巴細胞浸潤，支氣管腔未見明顯滲出液殘留，未見薄壁組織肺炎，說明肺部沒有病變的 發(fā)生；PBS組、FI-RSV組、CSA組和G組小鼠肺部均出現(xiàn)不同程度的病變。特別是FI-RSV組 和G組的病變情況最嚴重；說明注射這類疫苗后，當機體再次遇到病毒感染，肺部會出現(xiàn)較 嚴重的病理反應；與其他組相比，（G+CSA)組小鼠肺部沒有出現(xiàn)明顯的病理反應。
[0156] 以上結(jié)果說明呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組對小鼠產(chǎn)生了較好的保護效果，可 以抑制哺乳動物的肺部炎性細胞的增殖和侵潤，降低呼吸道合胞病毒對哺乳動物肺部組織 的損傷。
[0157] 實施例6、被RSV病毒攻擊后的免疫小鼠的脾臟，淋巴結(jié)，肺部灌洗液中的iTreg百 分率檢測
[0158] -、各組疫苗免疫小鼠
[0159] 實驗材料：6_8周齡雌性BALB/c小鼠，購自復旦大學實驗動物部，為清潔級，分9 組，每組5只。實驗期間使用無菌水及食物喂養(yǎng)，光照周期為12小時。
[0160] 實驗用疫苗分成呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組（G+CSA)、CSA組、亞單位疫苗組 (G)、PBS組（陰性對照）、FI-RSV組（陽性對照）。呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組中G蛋 白和CSA質(zhì)量均為10ug，如表2所示，同時以未感染病毒的小鼠（Non-infection)作對照。
[0161] 將上述各組疫苗分別于第0天、14天對6-8周齡雌性BALB/c小鼠進行背部皮下 免疫。PBS組中PBS溶液的劑量為100 μ 1、FI-RSV組中FI-RSV滅活疫苗的劑量為50 μ 1 5 X IO7TCID 病毒量。
[0162] 二、脾臟、淋巴結(jié)及肺部灌洗液中的iTreg百分率的檢測
[0163] 在上述步驟一末次免疫后第7天，通過滴鼻使小鼠感染RSV病毒，RSV病毒量按照 6 X 105TCID50/每只小鼠，對病毒感染4天后小鼠以60 μ g/kg的計量，腹腔注射1 %戊巴比 妥鈉將小鼠麻醉。小心切開氣管，用注射器將Iml含0. 2%胎牛血清的PBS溶液灌入肺內(nèi)， 反復輕柔推送沖洗，離心收集細胞；分離小鼠肺門淋巴結(jié)與脾臟，研磨后制成單細胞懸液； 按照Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set使用說明對單細胞懸液進行染 色，通過流式細胞儀檢測。
[0164] 1、小鼠脾臟的結(jié)果如圖8a所示：Non-infection組、PBS組、CSA組、G組以及 FI-RSV組的Treg百分率較低，而（G+CSA)組iTreg的百分率較高。說明呼吸道合胞體病毒 (RSV)疫苗組可以增加 Treg在脾臟中的比例。
[0165] 2、小鼠肺門淋巴結(jié)結(jié)果如圖8b所示：Non-infection、PBS組、CSA組、G組、FI-RSV 組和（G+CSA)組均沒有顯著性差異。
[0166] 3、肺部灌洗液中的結(jié)果如圖9所示：Non-infection組、PBS組、CSA組、G組以及 FI-RSV組Treg百分率較低，而（G+CSA)組iTreg的百分率較高。此結(jié)果與脾臟結(jié)果一致， 說明呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組可以增加 Treg在肺部灌洗液中的比例。
[0167] 實施例7、被RSV病毒攻擊后的免疫小鼠的脾臟和肺門淋巴結(jié)Treg細胞分泌 IL-10、IL-21以及CD40L情況的檢測
[0168] 一、各組疫苗免疫小鼠
[0169] 實驗材料：6_8周齡雌性BALB/c小鼠，購自復旦大學實驗動物部，為清潔級，分9 組，每組5只。實驗期間使用無菌水及食物喂養(yǎng)，光照周期為12小時。
[0170] 實驗用疫苗分成呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組（G+CSA)、CSA組、亞單位疫苗組 (G)、PBS組（陰性對照）、FI-RSV組（陽性對照）。呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組中G蛋 白和CSA質(zhì)量均為10ug，如表2所示，同時以未感染病毒的小鼠（Non-infection)作對照。
[0171] 將上述各組疫苗分別于第0天、14天對6-8周齡雌性BALB/c小鼠進行背部皮下 免疫。PBS組中PBS溶液的劑量為100 μ 1、FI-RSV組中FI-RSV滅活疫苗的劑量為50 μ 1 5 X IO7TCID 病毒量。
[0172] 二、流式檢測免疫攻毒小鼠后脾臟和肺門淋巴結(jié)Treg細胞分泌IL-10、IL_21以及 CD40L
[0173] 在上述步驟一末次免疫后第7天，通過滴鼻使小鼠感染RSV病毒，RSV病毒量按照 6 X 105TCID50/每只小鼠，對病毒感染4天后小鼠以60 μ g/kg的計量，腹腔注射1 %戊巴比 妥鈉將小鼠麻醉。小心切開氣管，用注射器將Iml含0. 2%胎牛血清的PBS溶液灌入肺內(nèi)， 反復輕柔推送沖洗，離心收集細胞；分離小鼠肺門淋巴結(jié)與脾臟，研磨后制成單細胞懸液； 按照Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set使用說明對單細胞懸液進行染 色，流式細胞儀檢測。
[0174] 在脾臟中iTreg細胞分泌IL-10, IL-21，CD40L的結(jié)果如圖10所示： Non-infection 組、PBS 組、CSA 組、G 組以及 FI-RSV 組 Treg 分泌 IL-10 較少，而僅有（G+CSA) 組Treg的較多。此外（G+CSA)組Treg細胞分泌IL-21，CD40L均比其他組高，并且具有顯 著性差異。
[0175] 在肺門淋巴結(jié)中Treg細胞分泌IL-10，Q)40L的結(jié)果如圖11所示：Non-infection 組、PBS組、CSA組、G組Treg分泌IL-10較少，F(xiàn)I-RSV組分泌較多IL-10,（G+CSA)組分泌 IL-10最多。CD40L與IL-10結(jié)果一致。
[0176] 以上結(jié)果說明呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組能夠分泌更多負調(diào)控因子抑制攻 毒后的細胞因子風暴。誘導哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生；誘導 哺乳動物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特異性調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生。
[0177] 實施例8、呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗在中型動物中免疫效果評價
[0178] -、呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗免疫兔子實驗
[0179] 實驗材料：3_4kg兔子，購自復旦大學實驗動物部，為清潔級，分9組，每組5只。實 驗期間使用無菌水及食物喂養(yǎng)，光照周期為12小時。
[0180] 免疫用疫苗及對照如下表所示，分別在第0天和第14天皮下免疫，在第28天通過 耳緣靜脈采血。免疫分組及劑量見表3,其中PBS組中PBS溶液的劑量為100 μ UFI-RSV組 中FI-RSV滅活疫苗的劑量為50 μ I 5Χ IO7TCID病毒量。
[0181] 表3、RSV疫苗在中型動物中免疫效果評價動物免疫分組
[0183] 二、ELISA檢測抗體水平
[0184] 方法同實施例2的二。
[0185] 抗體結(jié)果如圖12a所示：在第28天亞單位疫苗組，（G+CSA)組和（G+CSA) 10Χ組抗 體水平均有升高；在第64天（G+CSA)組IgG抗體滴度比其他對照組明顯升高；在第110天 各組均回到較低抗體滴度值，經(jīng)過攻毒后僅有（G+CSA)組和（G+CSA) 10X組抗體水平有所回 升，其他組沒有回升情況。
[0186] 三、T細胞增殖實驗檢測T細胞增殖情況。
[0187] 方法同實施例3的二。
[0188] T細胞增殖情況如圖12b所示：CSA組和（G+CSA)組T細胞增殖比例最低，PBS組、 FI-RSV組和（G+CSA) IOx組增殖比例相對增高，G組增殖比例最顯著。FI-RSV組和（G+CSA) 組間有顯著性差異。
[0189] 以上結(jié)果證明呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組是抗體水平相對較高，T細胞增殖 比例最低的一組，是最佳疫苗選擇。同時也說明呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組可以提高 哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性IgG抗體水平；抑制哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性 T淋巴細胞增殖。
[0190] 實施例9、呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗在靈長動物中免疫效果評價
[0191] -、呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗免疫恒河猴實驗
[0192] 實驗材料：成年恒河猴，用無菌水及食物喂養(yǎng)，光照周期為12小時。
[0193] 免疫用疫苗如下表4所示，分別在第0天和第14天皮下免疫，在第28天通過靜脈 采血。免疫分組見表。FI-RSV組中FI-RSV滅活疫苗的劑量為50 μ I 5X IO7TCID病毒量。
[0194] 表4、RSV疫苗在靈長動物中免疫效果評價動物免疫分組
[0196] 二、T細胞增殖實驗檢測T細胞增殖情況
[0197] 方法同實施例3的二。
[0198] T細胞增殖情況如圖13所示：(G+CSA)組T細胞增殖水平相比較于G組與FI-RSV 組明顯較低。說明（G+CSA)組是T細胞增殖比例最低的一組，是最佳疫苗。
[0199] 實施例10、不同種疫苗間相互干擾模擬實驗
[0200] -、呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗免疫小鼠的實驗
[0201] 實驗材料：6_8周齡雌性BALB/c小鼠，購自復旦大學實驗動物部，為清潔級，分9 組，每組5只。實驗期間使用無菌水及食物喂養(yǎng)，光照周期為12小時。
[0202] 免疫用疫苗及對照：PBS組、HBV疫苗（HBV)、呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗和 HBV疫苗同時免疫組（HBV+RSV)、呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗和HBV疫苗分別免疫組 (HBV(-7)+RSV)。實驗分組及各組的免疫情況如圖14a所示。PBS組中PBS溶液的劑量為 100 μ I ;HBV疫苗的劑量為Iug ;呼吸道合胞體病毒（RSV)疫苗組中G蛋白和CSA質(zhì)量均為 IOug0
[0203] 二、通過ELISA方法檢測兩種疫苗間的相互干擾作用
[0204] 將混合有經(jīng)高溫滅活處理的RSV的抗原或G蛋白（2ug/ml)包被液，按照每孔 100 μ 1加入96孔ELISA板，置于37°C溫箱中放置2小時。PBST洗板3次。加入5%脫脂奶 粉（PBST)，37°C放置1小時，PBST洗板3次。使用2%脫脂奶粉（PBST)，將免疫后小鼠或兔 血清按2倍梯度稀釋，加入96孔ELISA板，每孔100 μ 1，37°C放置1小時，PBST洗板3次。 每孔加入100 μ 1用2%脫脂奶粉（PBST)稀釋3000倍的HRP標記山羊抗小鼠 IgG，37°C放 置1小時，PBST洗板3次。每孔加入100 μ I TMB顯色液，于37°C避光顯色10分鐘。每孔 加入50μ1 0.2mol/L硫酸終止反應。于0D450nm/620nm測定出每孔的光密度值?？贵w滴 度的判定以至少大于2倍陰性血清的光密度值為依據(jù)。
[0205] 結(jié)果如圖14b所示：PBS組抗HBsAg IgG抗體水平幾乎為零，因為沒有免疫疫苗 所以不產(chǎn)生抗體，此組作為陰性對照；HBV組、（HBV+RSV)組及（HBV(-7)+RSV)組都具有抗 HBsAg IgG抗體，特別是（HBV+RSV)組抗體水平相對較高，但是這三組之間沒有顯著性差 異。
[0206] 以上結(jié)果說明RSV疫苗對HBV疫苗產(chǎn)生抗體沒有負影響。
【主權(quán)項】
1. 一種呼吸道合胞病毒疫苗，其活性成分為呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫抑制劑； 所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于：所述免疫抑制劑為環(huán)孢 菌素 A、地塞米松、雷帕霉素或環(huán)磷酰胺；所述免疫抑制劑具體為環(huán)孢菌素 A ; 所述呼吸道合胞病毒G蛋白和所述環(huán)孢菌素 A的質(zhì)量比為1:100-100:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于：所述呼吸道合胞病 毒G蛋白和所述環(huán)孢菌素 A的質(zhì)量比為1:1、2:10、4:10、6:10、8:10。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的呼吸道合胞病毒疫苗，其特征在于：所述呼吸道合 胞病毒G蛋白和所述環(huán)孢菌素 A的質(zhì)量比進一步具體為1: 1。5. -種制備呼吸道合胞病毒疫苗的方法，包括如下步驟： 將環(huán)孢素 A溶液與呼吸道合胞病毒G蛋白混勻，得到呼吸道合胞病毒疫苗； 所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述環(huán)孢素 A溶液中的環(huán)孢素 A與所述 呼吸道合胞病毒G蛋白質(zhì)量比為1:100-100:1。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述環(huán)孢素 A溶液中的環(huán)孢素 A與 呼吸道合胞病毒G蛋白的質(zhì)量比具體為1: 1、2:10、4:10、6:10、8:10。8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述方法，其特征在于：所述環(huán)孢素 A溶液的制備方法：將 環(huán)孢素 A溶于丙二醇中，得到混合液；將所述混合液與PBS溶液等體積混勻，得到所述環(huán)孢 素 A溶液； 所述環(huán)孢素 A溶液中環(huán)孢素 A的濃度為0. 2mg/ml。9. 呼吸道合胞病毒G蛋白在制備呼吸道合胞病毒的疫苗中的應用； 或呼吸道合胞病毒G蛋白和免疫抑制劑在制備呼吸道合胞病毒的疫苗中的應用； 所述呼吸道合胞病毒G蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示； 所述免疫抑制劑為環(huán)孢菌素 A。10. 權(quán)利要求1-4中任一所述的呼吸道合胞體病毒疫苗在如下（1)-(12)中至少一種中 的應用： (1) 制備提高哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性IgG抗體水平的產(chǎn)品； (2) 制備提高哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性中和抗體水的產(chǎn)品； (3) 制備抑制哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性T淋巴細胞增殖的產(chǎn)品； (4) 制備抑制哺乳動物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特異性T淋巴細胞增殖的產(chǎn) 品； (5) 制備誘導哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生的產(chǎn)品； (6) 制備誘導哺乳動物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特異性調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生的 產(chǎn)品； (7) 制備促進哺乳動物的呼吸道合胞病毒特異性調(diào)節(jié)性T細胞分泌IL10、IL21和/或 ⑶40L的產(chǎn)品； (8) 制備促進哺乳動物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特異性調(diào)節(jié)性T細胞分泌 IL10、IL21 和 / 或 CD40L 的產(chǎn)品； (9) 制備降低哺乳動物的呼吸道合胞病毒的病毒載量的產(chǎn)品； (10) 制備抑制哺乳動物的肺部炎性細胞的增殖的產(chǎn)品； (11) 制備降低呼吸道合胞病毒對哺乳動物肺部組織的損傷的產(chǎn)品； (12) 制備抑制哺乳動物的炎癥反應的產(chǎn)品。
【文檔編號】A61P31/14GK105983095SQ201510082407
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月15日
【發(fā)明人】俞慶齡, 鐘維, 鐘一維, 何忠淮, 王賓, 李超凡, 周嫻
【申請人】北京艾棣維欣生物技術(shù)有限公司