一種三萜類化合物在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三萜類化合物在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用。該應(yīng)用中的三萜類化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的三萜類化合物，可以從散沫花的干燥葉中提取、分離純化得到。本發(fā)明的應(yīng)用可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，隨著濃度的增大，對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制生長作用呈增強(qiáng)趨勢(shì)，本發(fā)明應(yīng)用中的化合物(Ⅰ)為非傳統(tǒng)意義的化療藥物，對(duì)機(jī)體的損害小，而且避免了腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性。
【專利說明】
-種Ξ瞄類化合物在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及從散沫花的干燥葉中分離得到的一種Ξ祗類 化合物在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌在我國各種惡性腫瘤中居首位，胃癌發(fā)病有明顯的地域性差別，在我國的西 北與東部沿海地區(qū)胃癌發(fā)病率比南方地區(qū)明顯為高。好發(fā)年齡在50歲W上，男女發(fā)病率之 比為2:1。胃癌的預(yù)后與胃癌的病理分期、部位、組織類型、生物學(xué)行為W及治療措施有關(guān)。
[0003] 早期胃癌多數(shù)病人無明顯癥狀，少數(shù)人有惡屯、、嘔吐或是類似潰瘍病的上消化道 癥狀。疼痛與體重減輕是進(jìn)展期胃癌最常見的臨床癥狀，病人常有較為明確的上消化道癥 狀，如上腹不適、進(jìn)食后飽脹，隨著病情進(jìn)展上腹疼痛加重，食欲下降、乏力。
[0004] 散沫花Lawsonia inermis，千屈菜科Lyth化ceae散沫花屬植物，又叫指甲花、指甲 葉、手甲木、指甲木、干甲樹，其葉、花、果實(shí)、種子都可W作為傳統(tǒng)中藥使用。散沫花葉對(duì)腹 瀉、頻疾、麻風(fēng)病、巧瘡有良好的療效;花可用來治療頭痛、發(fā)燒、過敏、貧血、失眠等;種子對(duì) 發(fā)燒、失眠、頻疾、腹瀉及智力缺陷有效;樹皮可W治療脾臟腫大和皮膚頑疾;根可W治療麻 風(fēng)病。散沫花主產(chǎn)于熱帶、亞熱帶，廣泛存在于中東、北非，在我國廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等 南部地區(qū)也有栽培。早在公元304年晉稽含在《南方草木狀》一書中稱其為散沫花，1964年版 《維吾爾醫(yī)用藥材》中稱其為化na或Mihid。
[0005] 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)散沫花含有釀、苯丙素、黃酬、Ξ祗、酪酸和脂肪酸等多種類型的化 合物。藥理研究表明散沫花具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗寄生蟲等廣泛的藥理活性，有很大 的開發(fā)利用價(jià)值，因此受到各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從散沫花的干燥葉中分離得到的一種Ξ祗類化合物在 制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得W實(shí)現(xiàn)的：
[000引一種Ξ祗類化合物在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用，具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物 (I)，
[0009]
[0010] 進(jìn)一步地，所述化合物(I)從散沫花中分離提取獲得，包含W下操作步驟：
[0011] (a)將散沫花的干燥葉粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無 醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋 萃取物和正下醇萃取物；
[0012] (b)步驟(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再 用75 %乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏；
[0013] (C)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、 20:1、10:1和1:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；
[0014] (d)步驟(C)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、20:1和10:1的 二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；
[0015] (e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物 (Do
[0016] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用80%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0017] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0018] -種藥物組合物在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用，該藥物組合物含有治療有效量 的權(quán)利要求1所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0019] 本發(fā)明應(yīng)用中的化合物（I)用作藥物時(shí)，可W直接使用，或者W藥物組合物的形式 使用。W藥物組合物形式使用時(shí)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì)人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥 用載體和/或賦形劑。
[0020] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 W及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物W單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0022] 本發(fā)明的應(yīng)用可W抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的調(diào)亡，隨著濃度的增大，對(duì)胃 癌細(xì)胞的抑制生長作用呈增強(qiáng)趨勢(shì)，本發(fā)明應(yīng)用中的化合物（I)為非傳統(tǒng)意義的化療藥物， 對(duì)機(jī)體的損害小，而且避免了腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性。
【附圖說明】
[0023] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0024] 圖2為化合物（I)理論ECD值與實(shí)驗(yàn)ECD值比較。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0026] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0027] 試劑來源：乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲燒為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[00%]制備方法：（a)將散沫花的干燥葉（10kg)粉碎，用80 %乙醇熱回流提?。?化X 3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋(化X3次)和水飽 和的正下醇(化X3次)萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物(398g)和正下醇萃取 物；（b)步驟(a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積， 再用75%乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏 (163g); (C)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用200-300目正相硅膠分離，依次用體積比為85:1 (10個(gè)柱體積）、45:1 (9個(gè)柱體積）、20:1 (8個(gè)柱體積）、10:1 (8個(gè)柱體積)和1:1 (5個(gè)柱體積） 的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(C)中組分3(49g)用200-300目正相硅膠 進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1(8個(gè)柱體積）、20:1(10個(gè)柱體積)和10:1(5個(gè)柱體積）的 二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2(31g)用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠0DS-C18分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積 洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I) (44mg)。
[00巧]結(jié)構(gòu)確證:HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z 523.3018，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C3訊44〇6，不飽和度為9。核磁共振氨譜數(shù)據(jù)δκ(卵m，DMSO-ds，500.13MHz): H-1 (1.95，d，J = 5.0)，H-l(1.59，d，J = 5.0)，H-5(1.36，m)，H-6(1.83，m)，H-6(1.79，m)，H-7(2.98，d，J = 6.4)，H-ll(1.86，m)，H-ll(1.98，m)，H-12(1.49，m)，H-12(1.94，m)，H-15(1.45，m)，H-15 (1.17，ddd J=12.5，12.5,5.3)，H-16(1.28，m)，H-16(2.06，m)，H-17(1.57，m)，H-18(0.94， s)，H-19a.ll，s)，H-20(1.33，m)，H-21(0.80，dJ = 6.6)，H-22(0.97，m)，H-22(1.32，m)，H- 23(1.76，m)，H-23(1.94，m)，H-24(4.98，tt，J=7.1，1.4)，H-26(1.51，s)，H-27(1.59，s)，H- 28(1.01，s)，H-29(0.97，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(卵m，DMSO-ds，176.04MHz): 37.1 (C此，l- C)，201.1(C，2-C)，204.8(C，3-C)，47.6(C，4-C)，41.8(CH，5-C)，20.2(C此，6-C)，53.0(CH， 7-C) ,64.1 (C，8-C)，84.9(C，9-C)，36.4(C，10-C) ,22.1 (C此，11-C)，33.4(C出，12-C) ,45.2 (C，13-C)，58.7(C，14-C)，19.8(CH2，15-C)，26.9(CH2，16-C)，51.6(CH，17-C)，13.3(CH3，18- C)，15.7(CH3，19-C)，33.8(CH，20-C)，17.6(CH3,21-C)，35.0(Ol2,22-C)，24.1(CH2,23-C)， 123.2(CH，24-C)，130.8(C，25-C)，17.2(CH3,26-C)，25.1(CH3,27-C)，25.2(CH3,28-C)，21.7 (C曲，29-〇，176.1((：，30-〇;碳原子標(biāo)記參見圖1。11?光譜顯示出酬基（1706(3111-1)和丫內(nèi)醋 (1769cm-i)吸收帶。1h NMR譜顯示含有六個(gè)叔甲基信號(hào)姐0.94(Me-18)，1.11 (Me-19)，1.51 (]^-26)，1.59(]^-27)，1.01(]^-28)和0.97(]^-29);^及一個(gè)雙峰信號(hào)地0.80(]^-21，1 = 6.6化），說明該化合物為Ξ祗類化合物。1化NMR和DEPT譜顯示30個(gè)碳信號(hào)，包括屯個(gè)甲基， 五個(gè)次甲基(一個(gè)締控碳，一個(gè)含氧次甲基），八個(gè)亞甲基W及十個(gè)季碳(Ξ個(gè)幾基碳，一個(gè) 締控碳，兩個(gè)含氧季碳）。側(cè)鏈具有24(25)-雙鍵（6(：130.8，123.2和如4.98，**，1 = 7.1， 1.4化），說明該化合物為羊毛醬醇型Ξ祗化合物，HMBC譜中Me-26和Me-27與C-24和C-25， Me-21 與C-17，C-20和C-22，W及H-24與C-22，C-23，Me-26，Me-27的相關(guān)性驗(yàn)證了上述推論。 HMBC譜中，出-1 與C-2，W及H-5，Me-28和Me-29與C-3 的交叉峰證明了 C-2 (SC201.1)和C-3 (δ C204.8)為酬幾基。此外，一個(gè)醋幾基信號(hào)[SC176.1(C-30)]和兩個(gè)碳信號(hào)[SC84.9(C-9)和 58.7(C-14)]說明該化合物存在一個(gè)丫內(nèi)醋結(jié)構(gòu)。HMBC譜中Me-18與C-14;出-15與C-30化- 11與C-9;H-Ua與C-8W及Me-19與C-9的相關(guān)性驗(yàn)證了 30,9-運(yùn)個(gè)官能團(tuán)的連接。綜合氨譜、 碳譜、麗BC譜和N0ESY譜，W及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所 示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過EC的式驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。
[0030] 實(shí)施例2:化合物(I)藥理作用試驗(yàn)
[0031] -、材料和儀器
[0032] 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購于賽爾試劑公司?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度大于 98 %。PDTC、膜蛋白酶、MTT、二甲基亞諷(DMS0)、瓊脂糖、冰醋酸購于美國Sigma公司。RPMI- 1640培養(yǎng)基、PBS憐酸鹽緩沖溶液購于美國GIBC0公司。胎牛血清購于山東銀香偉業(yè)公司。臺(tái) 吩藍(lán)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），TU肥L試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司），DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物公司），甲醒(美國Fisher公司），過氧化氨酶(天津市天新精 細(xì)化工開發(fā)中屯、）。
[0033] WD-9403C紫外分析儀（德國Biometra公司），梯度PCR儀(德國Biometra公司），凝膠 成像分析系統(tǒng)（上海天能公司），電泳儀(北京六一），電子天平（上海精密儀器儀表有限公 司），服1-1002型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本化emoto公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限 公司），超速離屯、機(jī)(北京醫(yī)療器械廠），低速離屯、機(jī)(北京醫(yī)療器械廠），Wiloved S型倒置 顯微鏡（日本Olympus公司），立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)板 (上海精密儀器公司），超純水純水器(英國PURELAB ulTRA GE肥TIC)。
[0034] 二、試驗(yàn)方法
[0035] 1、胃癌細(xì)胞SGC-7901的培養(yǎng)
[0036] 1.1細(xì)胞復(fù)蘇
[0037] (1)從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，迅速置于37°C~42°C ,75%酒精中，然后移至同 溫水浴鍋中；（2)輕輕晃動(dòng)1~3min凍存管，使凍存液融化，迅速移至超凈臺(tái)中；（3)將含有細(xì) 胞的凍存液吸入無菌離屯、管，加入適量RPIM-1640培養(yǎng)基；（4)吹打混勻后放入低速離屯、機(jī)， 800rpm/min離屯、3分鐘，去除上清液；（5)加入適量培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液依據(jù)濃度接種到 1 OmL培養(yǎng)皿中；（6)置于含5 %二氧化碳、37 °C飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[003引1.2細(xì)胞傳代
[0039] (1)待培養(yǎng)皿中的細(xì)胞貼壁約80 %時(shí)，在超凈臺(tái)中用移液管吸取舊的培養(yǎng)基吹打 數(shù)次培養(yǎng)皿中細(xì)胞，W吹掉死亡細(xì)胞；（2)用移液管吸去舊培養(yǎng)基，加入適量0.25 %膜酶消 化細(xì)胞，置于30°C培養(yǎng)箱中消化；（3)約3min后將培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞周 邊發(fā)亮、回縮變圓后則說明細(xì)胞已經(jīng)從壁上脫離；（4)迅速于超凈臺(tái)中吸去膜酶。加入適量 培養(yǎng)基反復(fù)吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離培養(yǎng)皿；（5)將細(xì)胞懸液按濃度分別接種至不同的培 養(yǎng)皿中，補(bǔ)足培養(yǎng)基；（6)重新置于含5%C02、37°C飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0040] 2、細(xì)胞計(jì)數(shù)
[0041 ] (1)準(zhǔn)備好細(xì)胞計(jì)數(shù)板及蓋玻片，二者均用酒精擦拭干凈，將蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板 上；（2)待酒精揮發(fā)后，吸出適量細(xì)胞懸液，滴加在蓋玻片邊緣，使懸液充滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板 之間，注意不要溢出蓋玻片及兩側(cè)的玻璃槽，靜置后計(jì)數(shù)；（3)在顯微鏡下找到4個(gè)大格，每 個(gè)大格又分為16個(gè)小格，分別計(jì)數(shù)4個(gè)大格中的細(xì)胞數(shù)，取平均值。壓線細(xì)胞計(jì)左側(cè)和上方 的，不計(jì)右側(cè)和下方的；（4)細(xì)胞濃度(個(gè)/mL)=每個(gè)方格的平均細(xì)胞數(shù)X 10000; (5)將細(xì)胞 懸液稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。
[00創(chuàng) 3、細(xì)胞活力測(cè)定
[0043] (1)取待測(cè)定的SGC-7901胃癌細(xì)胞懸液0.9ιΛ; (2)向細(xì)胞懸液中加入臺(tái)吩藍(lán)吹打 混勻；（3)采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板盲法計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察；（4)鏡下觀察細(xì)胞 染色情況，細(xì)胞內(nèi)染成淡藍(lán)色者為死細(xì)胞，未染色者為活細(xì)胞，W活細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百 分比反映細(xì)胞的活力（％)。
[0044] 4、ΜΤΤ檢測(cè)細(xì)胞生長抑制率
[0045] 實(shí)驗(yàn)分組:①陰性對(duì)照組;②化合物（I)組1，化合物（I)(50ymol/L);③化合物（I) 組2，化合物（I) (100皿01 /L);④PDTC組 1，PDTC (50皿01 /L);⑤PDTC組2，PDTC (100皿01 /L); ⑥聯(lián)合用藥組l，化合物（I)(25皿ol/L)+PDTC(25皿ol/L);⑦聯(lián)合用藥組2，化合物（I)(50μ mol/L)+PDTC(50ymol/L)。
[0046] (1)取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5 X 105/ ιΛ; (2)使用加樣器W每孔1(Κ)化接種于96孔板。注意接種時(shí)只接種到中間的60個(gè)孔，周邊36 孔WPBS填充，同時(shí)鋪3個(gè)96孔板；（3)將鋪好的96孔板置于37°C，5%C〇2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待 24h細(xì)胞貼壁后取出；（4)將96孔板分為化合物（I)組，（0、50、100皿ol/L)，PDTC組(0、50、100 ymol/L)，兩藥聯(lián)合組(0/0、25/25、50/504111〇1/1)，同時(shí)設(shè)立不含細(xì)胞的空白對(duì)照組（只加培 養(yǎng)基)分別予W不同處理；（5)各藥物每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48及72h; (6)分別在 特定的結(jié)束時(shí)間點(diǎn)取出96孔板，每孔加入MTT (5g/L)溶液20化，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，終 止培養(yǎng)。（7)小屯、吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入15化LDMS0，平板搖床振蕩1 Omin使結(jié)晶充分溶 解，顯微鏡下觀察顆粒消失。（8)于酶標(biāo)儀490nm波長處測(cè)定各孔的光密度(0D)值，計(jì)算各時(shí) 間點(diǎn)的細(xì)胞生長抑制率。抑制率=[1-(加藥組0D值-空白對(duì)照組0D值)/(陰性對(duì)照組0D值- 空白對(duì)照組0D值）]X100%。
[0047] 5、TU肥L法檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡指數(shù) [004引 5.1細(xì)胞爬片的制備
[0049] (1)蓋玻片的處理:將蓋玻片置于濃硫酸中浸泡過夜，次日先用自來水沖洗數(shù)次， 再置于無水乙醇中浸泡地，然后用去離子水沖洗干凈，放在供干箱中烘干后進(jìn)行高壓消毒， 取出直接放入超凈臺(tái)中備用。6孔板置于超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射30min; (2)放置蓋玻片:在六 孔板的每孔中準(zhǔn)備放蓋玻片的位置滴入少量培養(yǎng)基后再放置蓋玻片，使得蓋玻片與孔板考 培養(yǎng)基的張力粘合到一起，防止加細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片飄起，造成雙層細(xì)胞貼壁；（3)取對(duì)數(shù) 生長期的SGC-7901細(xì)胞，消化吹打成細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞濃度為iXloVmL。 (4)用加樣器在放有蓋玻片的每孔分別加入ImL細(xì)胞懸液，同時(shí)鋪3板，置于37°C，5%C02培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁；（5)24小時(shí)細(xì)胞貼壁后在超凈臺(tái)中將6孔板分為陰性對(duì)照組和 實(shí)驗(yàn)組分別予W不同處理，陰性對(duì)照組加 1血培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組再分為化合物（I)組、PDTC組及 聯(lián)合用藥組3個(gè)亞組，每孔加 ImL藥物?；衔铮↖)組終濃度為100皿ol/L，PDTC組終濃度為 100皿ol/L，兩藥聯(lián)合組終濃度為兩種藥物各為50皿ol/L。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。（6)置于37 °C， 5 % C〇2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0化日]5.2TUNEL法操作步驟
[0051 ] (1)細(xì)胞爬片加藥培養(yǎng)2地時(shí)取出6孔板，按照TU肥L說明書依次進(jìn)行如下步驟；（2) 小屯、吸棄每孔里的上清液；（3)每個(gè)孔加入PBS (4°C ) 2mL，平板搖床沖洗5min X 3次；（4)每孔 加入ImL預(yù)冷細(xì)胞固定液，4 °C冰箱固定30min。（ 5)吸棄固定液，每個(gè)孔加入PBS (4 °C) 2血，平 板搖床沖洗5minX3次。（6)浸入封閉液中，室溫（15°C~25°C)封閉10min"(7)每個(gè)孔加入 PBS(4°C)2mL，平板搖床沖洗5minX3次。樣品周圍用吸水紙吸干。（8)每個(gè)樣本滴加50化 TdT酶反應(yīng)液，37°C，避光濕潤反應(yīng)60min。（9)每個(gè)孔加入PBS(4°C) 2mL，平板搖床沖洗5min X 3次。樣品周圍用吸水紙吸干。（10)滴加50化S化ep化vidin-皿P工作液，37 °C，避光濕潤 反應(yīng)30min。（ 11)每個(gè)孔加入PBS(4°C)2血，平板搖床沖洗5minX3次。（12)滴加 100μΙ DAB工 作液，室溫顯色反應(yīng)lOmin。（ 13)每個(gè)孔加入PBS(4°C )2血，平板搖床沖洗5min X 3次。（14)光 學(xué)顯微鏡下觀察拍照:隨機(jī)選取10個(gè)高倍（X 100)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算調(diào)亡 指數(shù)的平均值。調(diào)亡指數(shù)(AI)=(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)X 100% )。陽性細(xì)胞的細(xì)胞核呈棟 褐色。
[0052] 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0053] 采用SPSS 11.5進(jìn)行分析，符合JH態(tài)分布的計(jì)量資料W表示，組間比較用化eway- AN0VA法進(jìn)行分析，兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0054] Ξ、結(jié)果及結(jié)論
[0化日]1、MTT檢測(cè)藥物對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞的生長抑制率
[0化6] 經(jīng)3次重復(fù)MTT，檢測(cè)結(jié)果顯示，單個(gè)藥物作用于胃癌細(xì)胞7化后，100ymol/L的藥物 組較50ymol/L的藥物組對(duì)胃癌細(xì)胞的生長抑制率均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5化 mol/L的化合物（I)對(duì)胃癌細(xì)胞的生長抑制作用與聯(lián)合用藥25/25皿ol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義?！?.05)。504111〇1/1的?01'(：對(duì)胃癌細(xì)胞的生長抑制作用與聯(lián)合用藥25/254111〇1/1組相比， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇.〇5)。聯(lián)合用藥50/50ymol/L組對(duì)胃癌細(xì)胞的生長抑制率高于各個(gè) 高濃度單藥組（100皿ol/L)對(duì)胃癌細(xì)胞的生長抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001 )，見表1 (沖 <0.05，*沖 <0.01)。
[0化7] 2、TUNEL法檢測(cè)各組調(diào)亡指數(shù)
[0058] 化合物（I)、PDTC及聯(lián)合用藥組均對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901有抑制生長的作用，各組與 陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇.001)，陰性對(duì)照組有少量細(xì)胞的胞核被染成棟 褐色，各個(gè)單藥組與聯(lián)合用藥組調(diào)亡細(xì)胞較陰性對(duì)照組相比均有增加，聯(lián)合用藥組細(xì)胞的 調(diào)亡指數(shù)最高，對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制效果更顯著。見表2(*沖<0.01)。
[0059] 結(jié)論，PDTC與化合物（I)兩藥單獨(dú)作用于胃癌細(xì)胞均可W抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn) 細(xì)胞的調(diào)亡，隨著濃度的增大，對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制生長作用呈增強(qiáng)趨勢(shì)，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用 后促進(jìn)胃癌細(xì)胞的調(diào)亡效果更顯著，細(xì)胞的生長抑制率及調(diào)亡指數(shù)均較單獨(dú)用藥組升高。 研究發(fā)現(xiàn)PDTC及化合物（I)兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用更顯著，且兩種藥物 均為非傳統(tǒng)意義的化療藥物，對(duì)機(jī)體的損害小，而且避免了腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的耐 藥性，可W為今后胃癌的臨床治療提供參考。
[0060]表1各藥物組不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)胃癌細(xì)胞的生長抑制率(n = 5，^±s) 「00611
[0064] 實(shí)施例3
[0065] 片劑的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或巧樣 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0066] 實(shí)施例4
[0067] 口服液制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或巧樣 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服 液。
[006引實(shí)施例5
[0069]膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒 石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0070] 實(shí)施例6
[0071] 注射液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或巧 樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0072] 實(shí)施例7
[0073] 無菌粉針的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攬拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安飯中，低溫冷凍干燥后無菌烙封 得粉針劑。
[0074] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種三萜類化合物在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，具有下述結(jié)構(gòu)式 的化合物(I)，2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述化合物（I)從散沫花中分離提取獲得， 包含以下操作步驟： (a) 將散沫花的干燥葉粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味， 依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物 和正丁醇萃取物； (b) 步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用 75%乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏； (c) 步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、20:1、 10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」5個(gè)組分； (d) 步驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、20:1和10:1的二氯 甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分； (e) 步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的 甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(a)中，用80%乙醇熱回流提取，合并 提取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：該藥物組合物含有 治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105998035SQ201610353423
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月25日
【發(fā)明人】董秋月
【申請(qǐng)人】杭州更藍(lán)生物科技有限公司