本發(fā)明涉及一種新的化合物在制備保肝藥物或保健品中的應(yīng)用，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

小花清風(fēng)藤為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬藤本植物小花清風(fēng)藤Sabia parviflora Wall.ex Roxb.的干燥莖。貴州產(chǎn)小花清風(fēng)藤為布依族、苗族的民間藥，主要分布在貴州的興義市、安龍縣、冊(cè)亨縣、望謨縣等地，其根莖、葉均可入藥，有祛風(fēng)除濕、消炎止痛的作用，治療甲型和乙型病毒性肝炎療效顯著，且副作用小。其相關(guān)品種，臨床多用于肝臟部位的相關(guān)疾病，然而，目前小花清風(fēng)藤中主要活性成分不明，其肝部疾病的作用物質(zhì)仍不清楚。本發(fā)明對(duì)小花清風(fēng)藤化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)深入研究，篩選得到具有保肝作用的新化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是對(duì)小花清風(fēng)藤的化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，提供一種新的化合物在制備保肝藥物或保健品中的應(yīng)用。

一種新的化合物：2,2-二甲基-3-羥甲基-4,5-二羥基-6-(3-甲基-3-羥基-1-丁烯基)-1H-茚-1-酮，其結(jié)構(gòu)式如下：

一種新的化合物的提取分離方法，包括以下步驟：

(1)取干燥的小花清風(fēng)藤藥材，加入12倍重量的濃度70％乙醇提取三次，時(shí)間分別為5小時(shí)、3小時(shí)、3小時(shí)，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到提取物；

(2)取步驟(1)的提取物加入濃度為20-50％乙醇增溶，用離心機(jī)離心除去不溶物，得到上清液；

(3)取步驟(2)得到的上清液上大孔樹脂柱，先用30％乙醇-水洗脫5個(gè)柱體積，得到流份1，再用50％乙醇-水洗脫5個(gè)柱體積，濃縮，干燥，得到流份2，取流份2經(jīng)200-300目的硅膠柱層析，用二氯甲烷和甲醇的混合液依次按體積比20:1、10:1、5:1、2:1梯度洗脫，每個(gè)濃度梯度洗脫4個(gè)柱體積，每個(gè)柱體積接4個(gè)流份，每個(gè)流份500ml，共得到16個(gè)流份，取二氯甲烷和甲醇的混合液體積比為20:1洗脫的4個(gè)流分，合并，經(jīng)凝膠柱層析，用甲醇洗脫10次，依次得到10個(gè)流份，每個(gè)流份50ml，取流份3-8合并，再經(jīng)ODS中低壓柱層析，用甲醇和水的混合液依次按體積比1:9、3:7、1:1、7:3、1:0洗脫，取甲醇和水的混合液體積比為1:0洗脫得到的流份，最后用制備高效液相色譜，色譜條件為：ODS色譜柱，甲醇-水60：40為流動(dòng)相，保留時(shí)間29min，最后分離得到純的化合物。

其中，步驟(1)中所述的提取方法為冷浸法、滲漉法、微波提取法、超聲提取法、回流提取法或連續(xù)回流提取法。

本發(fā)明提供了一種新的化合物在制備保肝藥物或保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包括治療有效量的一種新化合物及其藥學(xué)上可接受的載體，制備成片劑、膠囊劑、注射劑、粉針劑、顆粒劑、脂肪乳劑、微囊、滴丸、軟膏劑或透皮控釋貼劑。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提供的一種新的化合物的結(jié)構(gòu)示意圖；

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好的理解本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種新的化合物的提取分離方法，包括以下步驟：

(1)取干燥的小花清風(fēng)藤藥材100kg，加入12倍重量的濃度70％乙醇提取三次，時(shí)間分別為5小時(shí)、3小時(shí)、3小時(shí)，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得到提取物；

(2)取步驟(1)的提取物加入濃度為20-50％乙醇增溶，用離心機(jī)離心除去不溶物，得到上清液；

(3)取步驟(2)得到的上清液上大孔樹脂柱，先用30％乙醇-水洗脫5個(gè)柱體積，得到流份1，再用50％乙醇-水洗脫5個(gè)柱體積，濃縮，干燥，得到流份2，取流份2經(jīng)200-300目的硅膠柱層析，用二氯甲烷和甲醇的混合液依次按體積比20:1、10:1、5:1、2:1梯度洗脫，每個(gè)濃度梯度洗脫4個(gè)柱體積，每個(gè)柱體積接4個(gè)流份，每個(gè)流份500ml，共得到16個(gè)流份，取二氯甲烷和甲醇的混合液體積比為20:1洗脫的4個(gè)流分，合并，經(jīng)凝膠柱層析，用甲醇洗脫10次，依次得到10個(gè)流份，每個(gè)流份50ml，取流份3-8合并，再經(jīng)ODS中低壓柱層析，用甲醇和水的混合液依次按體積比1:9、3:7、1:1、7:3、1:0洗脫，取甲醇和水的混合液體積比為1:0洗脫得到的流份，最后用制備高效液相色譜，色譜條件為：ODS色譜柱，甲醇-水60：40為流動(dòng)相，保留時(shí)間29min，最后分離得到純的化合物(收率：890mg，純度：99.3％)，結(jié)構(gòu)式圖如附圖1所示。

化合物的結(jié)構(gòu)解析：

主要利用光譜技術(shù)，包括紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁共振(¹H-NMR、¹³C-NMR、2D-NMR)鑒定其結(jié)構(gòu)，再經(jīng)TOF高分辨質(zhì)譜精確確定其分子量及分子式。

其波譜數(shù)據(jù)如下：

(1)白色無(wú)定形粉末，高分辨質(zhì)譜ESI-TOF-MS：305.1381[M-H]^-。確定分子式為C₁₇H₂₂O₅，NMR譜中δ_C:211.3(C-1)，表明結(jié)構(gòu)中存在羰基；δ_C：19.4,26.4,27.4,27.5(C-8,9,13,14)，與δ_H:1.20,1.18(each,3H,s,-CH₃),1.49,1.50(each,3H,s,-CH₃)為四個(gè)季碳上的甲基信號(hào)，δ_C：113.1(C-7),122.8(C-6),128.6(C-1a),147.2(C-5),143.3(C-4),140.7(C-3a)，δH:6.97(1H,s,H-7)，提示結(jié)構(gòu)中可能含有一個(gè)五取代的苯環(huán)，δ_C：122.0(C-12),131.9(C-11)與δ_H:5.79(1H,d,J＝9.6Hz H-11),6.42(1H,d,J＝9.6Hz,H-12)，表明結(jié)構(gòu)有一個(gè)順式雙鍵。δC：51.6(C-3),δH:3.21(1H,dd,J＝5.2,6.7Hz,H-3)和61.5(C-10),δH:3.94(1H,dd,J＝10.5,6.8Hz,H-10a),3.98(1H,dd,J＝5.2,10.6Hz,H-10b),提示結(jié)構(gòu)中可能含有-CH-CH₂-結(jié)構(gòu)片斷，以上結(jié)構(gòu)再通過(guò)HMBC,HSQC，最終確定化合物的結(jié)構(gòu)，如附圖1所示。¹H NMR(600MHz,CD3OD)δ:1.19,1.17(each,3H,s,-CH₃),1.48,1.49(each,3H,s,-CH₃),3.21(1H,dd,J＝5.2,6.7Hz,H-3),3.94(1H,dd,J＝10.5,6.8Hz,H-10a)，3.98(1H,dd,J＝5.2,10.6Hz,H-10b)，5.79(1H,d,J＝9.6Hz H-11),6.42(1H,d,J＝9.6Hz,H-12),6.97(1H,s,H-7)

¹³C NMR(600MHz,CD3OD):211.3(C-1),128.6(C-1a),48.5(C-2),51.6(C-3),140.7(C-3a),143.3(C-4),147.2(C-5),122.8(C-6),113.1(C-7),19.4,26.4(C-8,9),61.5(C-10),131.9(C-11),122.80(C-12),78.2(C-13),27.4,27.5(C-14,15).

實(shí)施例2藥效實(shí)驗(yàn)研究

一、實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物

1.藥物和試劑

谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒(R1、R2)(日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)、谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒(R1、R2)(日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)；四氯化碳(分析純)，臨用前用花生油配制成0.1％的花生油溶液；D-氨基半乳糖(上海潤(rùn)成生物科技有限公司)，臨用前用生理鹽水配成10％的水溶液；雙環(huán)醇片(北京協(xié)和藥廠)，臨用前磨成細(xì)粉用0.5％CMC-Na制成1.25mg/ml混懸液。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)ICR小鼠，體重18-22g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(湘)2013-0004。

3.實(shí)驗(yàn)儀器

日立7180型全自動(dòng)生化分析儀(日立公司)，AL204型電子分析天平(Mettler Toledo儀器(上海)有限公司)，HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，MTV—100型多管漩渦混合儀(杭州奧盛儀器有限公司),KQ-4000B型超聲清洗機(jī)(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

4.受試藥物及處理方法

取實(shí)施例1制備得到的化合物，加水稀釋成濃度為1.5mg/ml,陽(yáng)性藥為雙環(huán)醇，臨用前磨成細(xì)粉用0.5％CMC-Na制成所需濃度的混懸液。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.對(duì)CCl₄致小鼠急性肝損傷的影響

取ICR雄性小鼠48只，隨機(jī)分成4組：空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥雙環(huán)醇組(25mg·kg^-1·d^-1)、實(shí)施例1制備得到的化合物組(30mg·kg^-1·d^-1)。空白對(duì)照組和模型組給予等量蒸餾水，給藥組灌胃給藥，連續(xù)7d，于末次給藥后2h，除空白對(duì)照組外，其余各組腹腔注射0.1％CCl₄花生油溶液10mL·kg^-1；空白對(duì)照組腹腔注射同體積的生理鹽水，禁食不禁水，16h后眼眶取血。所取得血液，以3000r·min^-1離心10min，取上清液，按試劑盒操作方法測(cè)定CCl4致肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量。取血后處死小鼠，迅速取肝臟、將周圍結(jié)締組織剔除后放入冰冷的生理鹽水中清洗血污，取部分肝臟，制成10％肝勻漿，按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定MDA含量及SOD活力。

2.對(duì)D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的影響

取ICR雄性小鼠48只，隨機(jī)分成4組：空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥雙環(huán)醇組(25mg·kg^-1·d^-1)、實(shí)施例1制備得到的化合物組(30mg·kg^-1·d^-1)?？瞻讓?duì)照組和模型組給予等量蒸餾水，給藥組灌胃給藥，連續(xù)7d，于末次給藥后2h，除空白對(duì)照組外，其余各組腹腔注射10％D-氨基半乳糖溶液10mL·kg^-1；空白對(duì)照組腹腔注射同體積的生理鹽水，禁食不禁水，16h后眼眶取血。所取得血液，以3000r·min^-1離心10min，取上清液，按試劑盒操作方法測(cè)定D-氨基半乳糖致肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量。取血后處死小鼠，迅速取肝臟、將周圍結(jié)締組織剔除后放入冰冷的生理鹽水中清洗血污，取部分肝臟，制成10％肝勻漿，按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定MDA含量及SOD活力。

3.對(duì)乙醇致小鼠肝損傷的影響

取ICR雄性小鼠48只，隨機(jī)分成4組：空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥雙環(huán)醇組(25mg·kg^-1·d^-1)、實(shí)施例1制備得到的化合物組(30mg·kg^-1·d^-1)?？瞻讓?duì)照組小鼠給予生理鹽水10ml/kg，2次，間隔4h。模型組小鼠給予生理鹽水10ml/kg，間隔4h后，給予50％乙醇5ml/kg。陽(yáng)性藥組小鼠給予雙環(huán)醇藥物，間隔4h后，給予50％乙醇5ml/kg。實(shí)施例1制備得到的化合物組小鼠給予實(shí)施例1制備得到的化合物，間隔4h后，給予50％乙醇5ml/kg。按照以上分組方法，生理鹽水、酒精以及雙環(huán)醇、實(shí)施例1制備得到的化合物的給予方式均為經(jīng)口灌胃，每天一次，連續(xù)20d。末次灌胃24h后眼眶取血。所取得血液，以3 000r·min^-1離心10min，取上清液，按試劑盒操作方法測(cè)定酒精致肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量。取血后處死小鼠，迅速取肝臟、將周圍結(jié)締組織剔除后放入冰冷的生理鹽水中清洗血污，取部分肝臟，制成10％肝勻漿，按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定MDA含量及SOD活力。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以X±S表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0，肝損傷試驗(yàn)血清中各指標(biāo)測(cè)定的數(shù)據(jù)采用方差分析組間比較t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、本化合物對(duì)CCl₄致小鼠急性肝損傷的影響

CCl₄肝損傷模型組與正常組比較，小鼠血清ALT、AST和肝組織MDA水平明顯升高(P<0.01)，SOD活性明顯降低(P<0.01)；本發(fā)明的化合物、雙環(huán)醇組與模型組比較，均不同程度地使肝損傷小鼠血清ALT、AST降低(P<0.01)；本化合物具有降低肝組織MDA水平，升高肝組織SOD水平的功效；具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1本化合物對(duì)CCl₄致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝臟SOD、MDA的影響(mean±SD，n＝12)

注：^*代表與模型組相比較，差異顯著(^*P<0.05)，^**代表與模型組相比較，差異極顯著(^**P<0.01)。

2、本化合物對(duì)D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的影響

D-氨基半乳糖肝損傷模型組與正常組比較，小鼠血清ALT、AST和肝組織MDA水平明顯升高(P<0.01)，SOD活性明顯降低(P<0.01)；實(shí)施例1制備得到的化合物組組和雙環(huán)醇組與模型組比較均不同程度地使肝損傷小鼠血清ALT、AST降低(P<0.01)；實(shí)施例1制備得到的化合物組和雙環(huán)醇組與模型組比較均不同程度地使肝損傷小鼠組織MDA水平降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2本化合物對(duì)D-氨基半乳糖致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝臟SOD、MDA的影響(mean±SD，n＝12)

注：^*代表與模型組相比較，差異顯著(^*P<0.05)，^**代表與模型組相比較，差異極顯著(^**P<0.01)。

3、本化合物對(duì)乙醇致小鼠急性肝損傷的影響

乙醇致肝損傷模型組與正常組比較，小鼠血清ALT、AST和肝組織MDA水平明顯升高(P<0.01)，SOD活性明顯降低(P<0.01)；實(shí)施例1制備得到的化合物組、雙環(huán)醇組與模型組比較均不同程度地使肝損傷小鼠血清ALT、AST降低(P<0.05)；實(shí)施例1制備得到的化合物組和雙環(huán)醇組與模型組比較均不同程度地使肝損傷小鼠組織MDA水平降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3化合物對(duì)乙醇致肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝臟SOD、MDA的影響(mean±SD，n＝12)

注：^*代表與模型組相比較，差異顯著(^*P<0.05)，^**代表與模型組相比較，差異極顯著(^**P<0.01)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的化合物可顯著降低CCl₄、D-氨基半乳糖和乙醇所致肝損傷模型小鼠血清ALT、AST含量、肝組織MDA含量，增強(qiáng)肝臟SOD活性。

因此，本發(fā)明制備得到的新的化合物有望開發(fā)成為新一代安全有效，用于防治肝損傷的藥物或保健品。