專利名稱：乳酸桿菌在減少齲齒和細菌引發(fā)齲齒中的用途的制作方法
乳酸桿菌在減少齲齒和細菌引發(fā)齲齒中的用途發(fā)明背景發(fā)明領域本發(fā)明涉 及一種用于篩選非致病性的抗_生齲齒菌株的方法，以及使用該菌株治療和預防因口腔細菌例如變異鏈球菌及其他可引發(fā)齲齒的病原體而引發(fā)齲齒的產品和方法。相關技術描述人和其他哺乳動物口腔中含有許多不同種類的細菌，包括大量不同種類的乳桿菌。齲齒是一種細菌引發(fā)的疾病。1890年，Miller在"Chemico-Parasitic Theory 〃提出了這樣的觀點齲齒是由從消化的碳水化合物產酸的口腔細菌引起的，這些酸溶解了牙齒的hydroxyh印atite。后來在悉生大鼠中得到證實，例如，正常的口腔細菌群落，主要包括變異鏈球菌群，另外乳桿菌群也包括在內。這些駐留于口腔中的"產酸"菌種與齲齒的產生及發(fā)病相關(Locsche WJ,Microbiolog Rev.，1986 50 :353_380)。在所述的變異鏈球菌菌群中共有7個菌種，其中變異鏈球菌(血清型c、e、f)占全部人分離株的90% (Linder L. , Oral Mikrobiologi 1996，ISBN91-7205-037-3)。大量證據表明齲齒的發(fā)生需要在牙斑內有相當高比例的變異鏈球菌。這些細菌可以很好地附著在牙齒表面，能夠從糖中產生比其他細菌類型更多量的酸，與其他細菌相比在酸性環(huán)境中更易存活，并能從蔗糖中生產出胞外多糖。當菌斑中變異鏈球菌的比例高(2-10%)時，患者處于患齲齒的高危險中。 當該比例低(小于0.1%)時，該患者的患病危險則較低。因為它們比其他細菌更耐酸，因此牙斑中的酸性條件有利于變異鏈球菌的存活和增殖。兩種其他的細菌還與齲齒發(fā)展深入至牙本質有關。有幾種乳桿菌，和粘放線菌。這些細菌也是高度產酸的，在酸性條件下存活的很好。乳桿菌在齲齒中所起作用已經得到證實(Smith et al.，Microbios 105 =77-85, 2001)。實際上，除測算變異鏈球菌的量之外，還使用不同的選擇培養(yǎng)基或其他技術測算唾液中乳桿菌的量，已經多年來用作“齲齒試驗”，試圖鑒定齲齒的高危險群體。因此，乳桿菌菌株，來自人牙斑的一些分離株，是高致齲齒原性的(Fitzgerald et al. ,J. Dent. Res. 60 919-926，1981。要將一種細菌定為是形成齲齒的主要病原體，需要同時具備下列必要特征中的幾種(Linder，1996)能夠在牙表面粘附并定居；能夠在牙齒的限定表面上大量蓄積；能夠從食物內的碳水化合物快速產酸；以及能夠在牙斑的低PH條件下繼續(xù)平穩(wěn)地產酸。飲食中的蔗糖改變噬斑的深度和化學性質。變異鏈球菌和其它的噬斑細菌使用單糖成分(葡萄糖和果糖)和蔗糖二糖鍵的能量，裝配胞外多糖。這些明顯增加了噬斑深度， 并且還改變了其從液體到凝體胞外間隙的化學性質。所述凝體限制了一些離子的運動。厚的凝體_噬斑得以發(fā)展了一種抗牙表面的酸性環(huán)境，避免其受到唾液的緩沖。未與蔗糖接觸過的噬斑較薄并且更緩沖。因此，蔗糖比例高的飲食能夠增加齲齒的危險。厚的噬斑發(fā)生于凹點和裂縫，以及在口腔衛(wèi)生差的住院病人中，牙齦緣附近部位。
考慮到該疾病原理，顯然預防和治療齲齒需要阻止變異鏈球菌發(fā)揮作用，例如通過將改變飲食作為減少細菌底物的方法，加強牙齒的表面結構或者減少變異鏈球菌的數目。因此，已經測試過的處理方法包括努力改變微生物群落，使用藥劑例如牙齒洗必泰和牙齒氟化物；通過飲食變化，減少飲食中蔗糖的含量，代之以變異鏈球菌更難代謝的甜味齊U，例如山梨糖醇、阿斯巴甜、木糖醇；降低吃的頻率，通過飲食選擇；增加氟化物，具體而言為每日刷牙過程中的應用；以及增加唾液流動，在為提高流動猛烈咀嚼過程中使用機械刺激，通過改變減少流動的藥物，或者通過使用增加流動的藥物。已經使用不同的方法評估預防齲齒，例如，一種組合物使用一種特異性針對變異鏈球菌的噬菌體生成的水解酶(Fischetti等人的美國專利No. 6，399，098)。另外，已經通過基因工程手段對一乳桿菌菌株進行修飾，使得其表面生成一種能夠中和有害鏈球菌的抗體，(Hammarstrom L.于 July 2002 出版 Nature Biotechnology)，但是這種基因工程修飾生物體的方法面臨未知的安全許可問題。此外，一株鼠李糖乳桿菌(菌株GG)已經被提升作為減少表兄鏈球菌 (Streptococcus sabrinus)和變異鏈球菌的常用方法(Nase 等人，Caries Res. 35 412-420, 2001) 0進一步的工作表明使用該細菌作為發(fā)酵牛奶引子不會影響牛奶中抗人生齲細菌抗體的滴度(Wei等人，Oral Microbio. & Immunol. 17 :9_15，2002)。鼠李糖乳桿菌GG在許多方面不同于路氏乳桿菌，包括發(fā)酵特征和分離來源。已經發(fā)現具 有抗牙斑形成抑制活性的其他微生物包括腸球菌、嗜酸性乳桿菌V20和乳酸乳桿菌1370(美國專利 No. 6，036，952)。為了抑制變異鏈球菌，已經開展了使用所謂"競爭性排斥"概念的其他工作。例如，路氏乳桿菌菌株ATCC55730已顯示能夠抑制變異鏈球菌(Nikawa H.等人，News release by Hiroshima University July 11，2002)。日本市場出售的一種名為 LS 1 的塊狀制品(日本Frente Ltd.生產)，其中含有唾液乳桿菌菌株(LSI)，據稱能夠抑制變異鏈球菌。多種乳桿菌菌株，包括路氏乳桿菌在內，已經用于益生素制劑。路氏乳桿菌是動物胃腸道天然生成習居菌中的一種，通常發(fā)現于腸道，偶爾發(fā)現于健康動物的生殖道、乳汁和口中，包括人在內。已知具有抗菌活性。參見，例如，美國專利Nos. 5，439，678，5，458，875， 5，534，253，5，837，238和5，849，289。當路氏乳桿菌細胞生長在有甘油存在的厭氧條件時， 他們產生被稱為無蛋白菌質(B-羥基一丙醛)的抗菌物質。除了常見有機酸外還報道了其他抗菌物質例如〃 reutericyclir^新品種的乳酸桿菌)“(Holtzel, Α.等人 Angewandte Chemie International Edition 39, 2766-2768, 2000)和"PCA(焦谷氨酸)〃 (Yang, Ζ. Dissertation, Univ. of Helsinki, March 2000)。 另外，眾所周知，乳桿菌，包括路氏乳桿菌在內，能夠通過局部競爭養(yǎng)分及其他新陳代謝相互作用抑制其他生物體。另外，免疫調節(jié)和抗炎的活性也與路氏乳桿菌有關。路氏乳桿菌的粘蛋白結合蛋白已經被分離并描述。參見，例如，美國專利No. 6，100, 388。報道稱乳桿菌菌株能夠附著于各種細胞系和宿主粘液。推測認為這一點對于益生素活性具有重要意義，源自于病原菌中毒力因子的原理，最近十年中已經發(fā)現了其中眾多系列的這類相互作用(Klemm，P. and Schembri，Μ. Α. (2000) Bacterial adhesins Junction and structure. Int. J. Med. Microbiol. 290, 27-35)。盡管此前已知路氏乳桿菌的有效抗菌活性，已知路氏乳桿菌的一些結合特性例如粘蛋白結合特性，，還已知路氏乳桿菌菌株ATCC 55730和乳桿菌GG ATCC 53103的變異鏈球菌抑制作用，但是此前并不知道乳桿菌菌株由于抑制作用和結合活性，相互間在減少口腔中變異鏈球菌數目從而減少齲齒能力上的差異，也不知道這類菌株可以篩選。因此，本發(fā)明的一個目的是提供較好的乳桿菌菌株，這些菌株能夠通過抗菌活性以及與口腔粘蛋白及牙斑的良好結合特性減少口腔中變異鏈球菌的數目，從而預防、減少或治療齲齒。本發(fā)明的另一目的是提供含有所述菌株的產品，包括用于向人施用預防或治療變異鏈球菌相關齲齒的藥劑。其他目的和優(yōu)點更明顯地體現于下列公開內容及所附權利要求。發(fā)明概述本發(fā)明包括乳桿菌菌株，這些菌株能夠通過抗菌活性以及與口腔粘蛋白及牙斑的良好結合特性減少口腔中變異鏈球菌的數目，從而預防、減少或治療齲齒；由所述菌株得到的產品，包括用于向人施用預防或治療齲齒的藥劑；以及制備這些產品的方法。其他目的和優(yōu)點更明顯地體現于下列公開內容及所附權利要求。發(fā)明及優(yōu)詵實施方案詳細說明本發(fā)明提供一種用于抑制齲齒細菌生長及活性的產品，其中含有至少一種乳桿菌菌株，該菌株具有良好的抗變異鏈球菌活性以及與口腔粘蛋白及牙斑的良好結合特性， 從而預防、減少或治療齲齒。所述菌株包括路氏乳桿菌CF2-7W2003年1月觀日保藏于 ATCC，指定時將保藏號加入本申請中)及路氏乳桿菌MF2-3(2003年1月28日保藏于ATCC， 指定時將保藏號加入本申請中)。除了能減少口腔中變異鏈球菌數目外，本發(fā)明中乳桿菌菌株選擇的其他標準是菌株結合宿主粘蛋白的能力。實際上，現已經查明乳桿菌確實粘附于粘膜表面及其成分。 乳桿菌與粘液粘附的試驗表明許多菌株顯然不具有體外結合粘液物質的能力。由于這些非一結合劑中的許多分離自粘膜表面，因此可以認定生長環(huán)境能夠影響細菌的粘附特性。在本申請使用的篩選方法中，現已查明所述粘附特性通過在細菌培養(yǎng)基中加入粘蛋白部分模擬了腸道環(huán)境。因此，如實施例中所述，本發(fā)明的方法包括1)評定鏈球菌菌株的變異鏈球菌抑制作用；以及2)評定乳桿菌的粘蛋白結合作用。本發(fā)明所述產品可以是置于口中預防或治療齲齒或者以營養(yǎng)和保健為目的的任意一種產品，例如食品，牙齒治療用品例如嗽口水或其他特定保健用品，口香糖，等。特別適用于本發(fā)明的食品包括例如酸奶酪，和漿汁，飲料等等?？捎糜诒景l(fā)明的牙齒治療用品包括牙膏、液體牙齒清潔劑、嗽口水、抗口臭制品，等。本發(fā)明產品發(fā)揮作用所需的乳桿菌細胞濃度取決于食物類型及攝入食物的量 (或者非食物牙齒治療用品在口中存放時間)，但是通常優(yōu)選每克產品中含約IO6 IO7個 CFU(集落形成單位)或更多。約101° IO11CFU的量是能夠實現的，可用于提高效力且不會影響產品的感官特性(它的味道或氣味)。當所述產品是酸奶酪或其他乳酸發(fā)酵制品時， 用于制備所述產品的乳酸發(fā)酵菌株優(yōu)選為這一特定目的的常規(guī)培養(yǎng)物，本發(fā)明所述的抗致齲細菌可以在所述產品發(fā)酵前或后加入，加入水平為每毫升酸奶酪中約IO6 IO7CFU或更多，如上所述。優(yōu)選本發(fā)明所述產品不含有其他抗菌成分，至少沒有任何抑制或殺死所選用乳桿菌菌株或干擾其抗生齲活性的物質。
所述乳桿菌菌株可以是混合入成分中，或捏合入所述產品內或包被于表面上的添加物，通過本領域制備該類型產品的已知技術。如果本發(fā)明選擇的食物或其他產品需要加熱，那么所述乳桿菌菌株應該在加熱后添加。一旦所述選擇乳桿菌細胞進入所述產品，那么就優(yōu)選該產品不要在60 70°C或更高溫度下加熱較長的時間。參照下列實 施例可以更加清楚地理解本發(fā)明，這些實施例不是對本發(fā)明的限制。實施例1 菌株的篩選方法本發(fā)明使用的乳桿菌菌株的篩選可以通過下列兩步法完成a)評估乳桿菌菌株對變異鏈球菌的抑制作用測量抑制作用使用的菌株的一個實例是變異鏈球菌ATCC25175(獲自American Type Culture Collection,Manassas, VA,USA) 將所述分離株培養(yǎng)于添加了 0. 5%酵母抽提物(Difco)(TSBY)的胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉湯(Difco，Detroit，USA)。指數生長期通過ΙΟΟΟχ g離心收集所述細胞，用PBS洗滌兩次，重懸于同種緩沖液。所述細胞懸液進行低強度超聲波處理分散細菌團塊。將測試乳桿菌菌株培養(yǎng)于腦-心臟浸出液肉湯(Difco)，指數生長期通過IOOOx g 離心收集，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 6.8)洗滌兩次，然后重懸于同種緩沖液。在一種檸檬色光程的1. Oml透明小容器中測量所述細菌懸液的光密度，調節(jié)懸液至終濃度為1. OxIO8CFU(菌落形成單位)/ml。所述抑制試驗操作如下，將變異鏈球菌懸液和乳桿菌懸液按100 0、75 25、 50 50和25 75的比例混合于滅菌離心管(總體積為100 μ 1)，補加BHI肉湯至10ml， 渦旋混合10秒，然后于37°c輕微振搖的條件下孵育90分鐘。作為對照，將變異鏈球菌懸液與等體積PBS混合于對照管(無乳桿菌)。然后每一懸液通過ΙΟΟΟχ g離心洗滌，用PBS洗滌兩次，鋪板于MS瓊脂測定變異鏈球菌的CFU量。用下列公式得出變異鏈球菌的存活％。
權利要求
1.一種路氏乳桿菌菌株(LactcAacillus reuteri)，其特征在于，該路氏乳桿菌菌株為路氏乳桿菌菌株MF2-3，保藏號為ATCC PTA-4964。
2.一種用于抑制齲齒細菌生長的產品，所述產品包括一種路氏乳桿菌菌株，該路氏乳桿菌菌株為路氏乳桿菌菌株MF2-3，保藏號為ATCC PTA-4964 ；其中，該路氏乳桿菌菌株具有能夠抑制變異鏈球菌(Sti^ptococcus mutans)的抑制活性且能與口腔粘蛋白很好地結口 O
3.根據權利要求2所述產品，其中，所述產品是食品。
4.根據權利要求3所述產品，其中，所述食品選自由酸奶酪、果凍、糖果、巧克力、餅干、 乳酪、果汁和茶葉組成的組。
5.根據權利要求4所述產品，其中，所述果凍為布丁。
6.根據權利要求4所述產品，其中，所述糖果為口香糖。
7.根據權利要求4所述產品，其中，所述餅干為曲奇餅。
8.根據權利要求3所述產品，其中，所述食品是含奶產品。
9.根據權利要求3所述產品，其中，所述食品是酸奶酪。
10.根據權利要求2所述產品，其中，所述產品是牙齒治療用品。
11.根據權利要求2所述產品，其中，所述產品是漱口劑。
12.一種用于制備抗生齲齒產品的方法，該方法包括向所述產品中添加一種路氏乳桿菌菌株，該路氏乳桿菌菌株為路氏乳桿菌菌株MF2-3，保藏號為ATCC PTA-4964 ；其中，該路氏乳桿菌菌株具有能夠抑制變異鏈球菌(Streptococcus mutans)的抑制活性且能與口腔粘蛋白很好地結合。
13.根據權利要求12所述方法，其中，所述產品是食品。
14.根據權利要求13所述方法，其中，所述食品選自由酸奶酪、果凍、糖果、巧克力、餅干、乳酪、果汁和茶葉組成的組。
15.根據權利要求14所述產品，其中，所述果凍為布丁。
16.根據權利要求14所述產品，其中，所述糖果為口香糖。
17.根據權利要求14所述方法，其中，所述餅干為曲奇餅。
18.根據權利要求13所述方法，其中，所述食品是含奶產品。
19.根據權利要求13所述方法，其中，所述食品是酸奶酪。
20.根據權利要求12所述方法，其中，所述產品是牙齒治療用品。
21.根據權利要求12所述方法，其中，所述產品是漱口劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了乳桿菌菌株，這些菌株能夠通過抑制活性以及與口腔粘蛋白及牙斑的良好結合特性減少口腔中變異鏈球菌的數目，從而預防、減少或治療齲齒，本發(fā)明還提供了含有所述菌株的產品，包括用于向人施用預防或治療齲齒的藥劑。
文檔編號A61Q11/00GK102352324SQ20111016046
公開日2012年2月15日 申請日期2004年1月27日 優(yōu)先權日2003年1月29日
發(fā)明者埃蒙·康諾利, 布·莫爾斯泰姆 申請人:生命大地女神有限公司