專利名稱：乳酸桿菌整合膜蛋白活性片段檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種整合膜蛋白活性片段的檢測(cè)方法，尤其涉及一種乳酸桿菌整合膜蛋白活性片段的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
益生菌是指改善宿主微生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達(dá)到提高宿主健康水平和健康狀態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物，其廣泛存在于地球上的各個(gè)角落，是一種對(duì)人和動(dòng)物有益的細(xì)菌，它們可直接作為食品添加劑服用，以維持腸道菌叢的平衡，在腸道內(nèi)的黏附和定植能抑制致病菌的損傷，對(duì)于保護(hù)腸道黏膜的完整性具有重要的意義；自90年代初以來(lái)，形形色色的“益生菌”類保健品風(fēng)靡了整個(gè)世界，與此同時(shí)，“益生菌”的研究業(yè)已成為國(guó)際上的熱門研究課題。乳酸桿菌是益生菌中及其重要的一種，可以與靶細(xì)胞黏附，競(jìng)爭(zhēng)抑制致病性大腸桿菌(EPEC)、出血性大腸桿菌(EHEC)和侵襲性大腸桿菌(EIEC)等致病菌對(duì)人體腸道屏障功能的損害；激發(fā)繼發(fā)于黏附的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，降低腸上皮細(xì)胞(IEC)的通透性；調(diào)節(jié)人體腸道黏膜免疫功能，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞(DC)分化成熟，以及誘導(dǎo)腸道T細(xì)胞分化成熟寸。近幾年來(lái)研究表明，乳酸桿菌的表面蛋白(surface layer protein, SLP)在乳酸桿菌益生作用中起著核心作用。有學(xué)者將SLP進(jìn)行分離和純化，發(fā)現(xiàn)表面蛋白P40和P70與乳酸桿菌類似，能增加IEC緊密連接(TJ)蛋白的表達(dá)，維持TJ的完整性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)機(jī)制可能與促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路有關(guān)。Bernet等研究益生菌與體外培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞的黏附，認(rèn)為其黏附成分可能是細(xì)菌表面的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。Fujiwara 等從益生菌液上清中分離出一種分子量為52kDa的蛋白質(zhì)，此種物質(zhì)能抑制EPEC對(duì)人腸道上皮細(xì)胞(HIEC)的黏附。Konstantinov等在研究嗜酸性乳酸桿菌與樹突狀細(xì)胞相互作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)其SLP能調(diào)節(jié)IL-10和IL-12的合成與分泌(Proc Natl Acad Sci U. S. A.，2008 ； 105 (49):19474-79)。我們的前期研究(BMC Microbiol，2008 ;9 :63)也發(fā)現(xiàn)經(jīng)植物乳酸桿菌(LP)分離純化的SLP具有生物學(xué)活性，能上調(diào)IEC表面TJ的表達(dá)，抑制EPEC對(duì)IEC的損傷作用，但其蛋白片段較大，結(jié)構(gòu)域不清，作用機(jī)制尚不明，抗病能力較弱。我們通過(guò)對(duì)乳酸桿菌SLP進(jìn)行篩選，質(zhì)譜分析，克隆表達(dá)和反復(fù)篩選驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其表層黏附蛋白為整合膜蛋白(integral membrane protein, IMP, GI :28378881 )，并且黏附區(qū)域?yàn)榕c表層蛋白的中間片段IMP455-755 (中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2009 ；26 (5):1626_1631)。但是對(duì)于乳酸桿菌整合膜蛋白活性片段的研究較少，而活性片段為具有黏附活性的微小片段(Micro Integral Membrane Protein，MIMP)，其分子較小，具有較高的效價(jià)和特異性，應(yīng)用價(jià)值較大；此外，因其特有的親疏水性結(jié)構(gòu)及其所發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)，可以彌補(bǔ)乳酸桿菌易位及不耐抗生素的缺陷，有著重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，對(duì)乳酸桿菌整合膜蛋白活性片段的確認(rèn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明提供了一種乳酸桿菌整合膜蛋白活性片段(MIMP)的檢測(cè)方法，通過(guò)構(gòu)建 N-末端或C-末端缺失的突變蛋白，得到6個(gè)突變蛋白；以HRP標(biāo)記的黏蛋白為指標(biāo)一抗， 通過(guò)Wfestern bolt (WB)檢測(cè)結(jié)果與拷馬斯亮藍(lán)(Coomassiebrilliant Blue)染檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)行確認(rèn)MIMP。本發(fā)明乳酸桿菌整合膜蛋白活性片段(MIMP)檢測(cè)方法，步驟如下
步驟1，以乳酸桿菌整合膜蛋白DNA作為模板，加入引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，構(gòu)建出7 種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包括IMP455-755，以及N-末端或C-末端缺失的 6 種突變蛋白 IMP455 515，IMP455^635, IMP455 575，IMP635^755, IMP575 755 和 IMP515 755 ；所述引物與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)關(guān)系如下
？1 alcAAGCTTAATACTAATTCTAATAGTAC 霍械 CrtC 識(shí) eC AA ACTTTCT C GT TGTTCCGSEOIO Wo 1 中 . 515 It究寶 ΜΡ455-5!δaKAAGC了磁 tactaa.ttcta atagtac Ii atccicoa gAACCT GCTGCGTAGTGACTGSEO10 No I申W序列4K 635^: IMP455-835d!DVV:K.:TTAATACTAATTCTAATA6TAC IB aiccicga o4GT TTTCATC T 了 A AC AAC C TSEOIO Mo； I申 5+7 5毅突變 & !MP455~5 53lcc!c.gag&AGATAGAGTTCCGTATTTC _ .越AGC! 1ΠΙ ICAGTTCAAAATGGTmSEOIO No 1 申 755 IMP515-755McctcgagAaj3ATAGAGTTCCGTATTTC fi 3ICAA G C TTACTiS G C GAA CC6AAGAT TTTSEOIO No； ι ψIIffIiI 575-755 突變-2+B; iyP57￡- 55atccicga^AGATAGAGTTCCGTATTTC Ii atcAAG C ITAG TG G 了 G.TO AGAC TGTCAASEQ ID No； 1 申_鮮_1 535 755 ？!MP63S- 55TACTA.ATTCTAATAGTA+C |C ale CIC ga g.4A GATAG A GTTCCGTATTTCSEOIO N ο 1 Ψ _刪 4 55 7S6IS擴(kuò)壜產(chǎn)物IM.P455J55
步驟
2，將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后以HRP標(biāo)記的黏蛋白為直標(biāo)一抗，進(jìn)行WB 和拷馬斯亮藍(lán)染檢測(cè)，將WB結(jié)果與拷馬斯亮藍(lán)染結(jié)果進(jìn)行對(duì)比；在WB檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性反應(yīng)的DNA片段中，找出與呈陰性反應(yīng)DNA片段沒(méi)有重復(fù)區(qū)域的DNA片段1，和完全包含呈陰性反應(yīng)DNA片段的DNA片段2 ；所述DNA片段1和2的重復(fù)區(qū)域?yàn)樗稣夏さ鞍谆钚云巍?
所述N-末端或C-末端缺失的突變蛋白構(gòu)建方法如下
步驟1，加入所述引物和質(zhì)粒模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；優(yōu)選地，反應(yīng)體系包括10X緩沖溶液，dNTP，引物，質(zhì)粒模板，rTag聚合酶和重蒸水；
步驟2，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，然后進(jìn)行凝膠回收得到所述6個(gè)突變DNA和 IMP455-755 ；步驟3，加入核酸內(nèi)切酶、IMP455-755分別對(duì)6個(gè)突變DNA進(jìn)行酶切；然后將酶切產(chǎn)物與載體BL21 (DE3)按10 1比例，在連接酶的作用下進(jìn)行連接；優(yōu)選地，酶切反應(yīng)體系包括 醋酸鹽緩沖溶液，酶切產(chǎn)物，載體BL21 (DE3)，BSA和兩種內(nèi)切酶，所述兩種內(nèi)切酶可以是 Xho I和Hind III ；連接反應(yīng)體系包括突變DNA酶切產(chǎn)物，IMP455-755酶切產(chǎn)物，DNA連接酶及其IOX緩沖溶液，所述DNA連接酶可以是T4 DNA連接酶；
步驟4，加熱至65°C將連接產(chǎn)物滅活，用T0P10感受態(tài)細(xì)胞、無(wú)抗LB培養(yǎng)基以及涂有 Amp抗性的平皿進(jìn)行轉(zhuǎn)化；
步驟5，取所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，用Rosetta (DE3) XplyE、無(wú)抗LB培養(yǎng)基以及涂有Chi、Amp 抗性的平皿進(jìn)一步培養(yǎng)；挑取菌落接種于TB培養(yǎng)基，IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；離心分離后懸浮， 95°C煮20分鐘，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳純化。所述HRP標(biāo)記黏蛋白方法如下
步驟1，取黏蛋白溶解于碳酸鹽緩沖液，配置成黏蛋白溶液；
步驟2，配置HRP溶液HRP溶于水中，加入過(guò)碘酸鹽溶液，進(jìn)行攪拌；然后于乙酸鹽緩沖液中，透析；向所述透析產(chǎn)物中加入碳酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)PH值至9. O 9. 5，制備出HRP溶液；優(yōu)選地，所述乙酸鹽緩沖溶液PH值為4. 4。步驟3，將所述黏蛋白溶液與所述HRP溶液混合，攪拌；
步驟4，向步驟3所得混合溶液中加入硼氫化鈉，然后置于硼酸緩沖溶液中透析；制備出HRP標(biāo)記的黏蛋白。根據(jù)所述HRP標(biāo)記黏蛋白的方法，優(yōu)選地，所述透析均在4°C下進(jìn)行。腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)數(shù)量龐大、組成復(fù)雜，其細(xì)菌數(shù)量大約10倍于人體體細(xì)胞， 與人類健康狀況的維持和疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。其中，益生菌在腸道內(nèi)的黏附和定植對(duì)抑制病菌的定植、移位和感染，維護(hù)腸道黏膜的完整性具有特別重要的意義。乳酸桿菌是益生菌中重要的一類，其在發(fā)揮益生作用時(shí)，表面蛋白(surface layer protein , SLP) 的黏附結(jié)構(gòu)起著核心作用。本發(fā)明乳酸桿菌整合膜蛋白活性片段(MIMP)的檢測(cè)方法，通過(guò) PCR擴(kuò)增反應(yīng)，構(gòu)建了 6種N-或C-末端缺失的突變蛋白，并根據(jù)WB結(jié)果和SDS-PAGE膠電泳后拷馬斯亮藍(lán)染結(jié)果的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，MIMP為IMP結(jié)構(gòu)區(qū)域片段，該黏附結(jié)構(gòu)區(qū)域位于菌體表面的整合膜蛋白中，為具有黏附活性的微小片段。我們研究發(fā)現(xiàn)=MIMP分子量為6. 95kDa, 分子式為C315H5tl2N86O87S2，等電點(diǎn)9. 90，共包含61個(gè)氨基酸，其中酸性氨基酸數(shù)量較多，占 13. 1%。MIMP分子小，具有較高的特異性，因其特有的親疏水性結(jié)構(gòu)及該結(jié)構(gòu)所發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)，由于蛋白不會(huì)發(fā)生易位，也不會(huì)與抗生素作用，故可以很好彌補(bǔ)乳酸桿菌易位和不耐抗生素的缺陷，因此臨床應(yīng)用價(jià)值較大，有著廣闊的醫(yī)藥應(yīng)用前景。


圖1為構(gòu)建的6個(gè)突變蛋白和IMP455 755序列示意圖； 圖2為WB檢測(cè)結(jié)果；
圖3為拷馬斯亮藍(lán)染的染色結(jié)果。
具體實(shí)施例方式發(fā)明人長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌的黏附結(jié)構(gòu)區(qū)域位于菌體表面的整合膜蛋白中，為具有黏附性的微小片段。原料采用植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum，簡(jiǎn)稱LP，CGMCC No. 1258)，對(duì)本發(fā)明乳酸桿菌整合膜蛋白活性片段MIMP的檢測(cè)方法具體介紹如下 乳酸桿菌(CGMCC No. 1258)表面整合膜蛋白序列(即SEQ ID No 1) 1 mktvrkiplv vwytamfvvi atitysglf1 agrtliwevd giaqhfpill efqrilqhhp 61 qqlfswswnl glgadqlttf syyvvgdpfn ylvafvsrah lewayqalil lrlyfvglaf
121Igfsrqfkfkrvsqligaltytftaytfyvgmhhpfflipmiwfpllcwaiervlrgrhw181Iplslitavvilsnfyfayllalgglvyalvrfwsrrrdhltmrsfgqlfwrllvavglg241vtmagillvptllamltatrasfnfangltsypinyyvnlpnrlltnggsvqywvtlgls301sisfiaiiytlrhfrrywvlnwvlvvmmlgillpqfaavfnvfstpsnrwllmatlvfay361atmafmdqvtaltaadlkwlagisggllviiwlingfylnirkhdiatylillaligvll421vkqslkltnrqfyvlllgivtlnlannglgwlsintnsnsteqlrqgaamkwvknyfdga481qksltttsqfyrtalapnyytmrsaesdvpmvlgthtvgsyfsvqngyvgafsqalgnse541yamnsplgsldgrttmynllgvkylfaredqlkkqalpagyevvkmktgepkifadkfiy601gmsnhtgtillksknalplvytqqhqisqrqfnrlnavdreqallqgavttqqvsgvktv661kptvtgknvaytvqadttnvldtldkviiyrnqhatgasnnaltklpadtitltpeqres721ltpatglttpsnrvlnliaanqklvqknqennadeltsmvsdvqghqipyqltiqhpkky781rntelylvldgisyrrssikhalttsqninvftarpytkvdylddvrdglkgnlsasgys841ltaqttdnltsfsqlgttnmsdyeprtsavinlgyskyarklitlnftsirslhfksakl901iavplgktyrqrtrqlqtsglkhqqvtnnqitgttltktatvlttsipystgwqlrvdgq961tvrtqvvnkgfvgakltagrhqirltyhtpglkigiwssiiggvisiliacwwglhkrvr1021 qs
1.構(gòu)建N-末端或C-末端缺失的6種突變蛋白 1. 1.克隆 1.1.1. PCR 擴(kuò)增
以乳酸桿菌整合膜蛋白DNA作為模板，加入引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，構(gòu)建出； IMP455-755、以及N-末端或C-末端缺失的6種突變蛋白IMP455 515，IMP455^635, IMP455 575，IMP635^755, IMP575 755 和 IMP515 755 共 7 種 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；所述引物與 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)關(guān)系如下
7PCR擴(kuò)_產(chǎn)_引物 1 atcAAGCTTAATACTAATTCTAATAGTAC 引物 2: atcctcgsgCAAACTTTCTCGTTGTTCCG酬遍引物 1 atCAAGCTTAATACTAATTCTAATAGTAC mm 2 atcctcgagAACCTGCTGCGTAGTGACTG1MP455~635引物 1 atcAAGCTTAATACTAATTCTAATAGTAC 引物 2: atcctcgagAGTTTTCATCTTAACAACCTIMP455-575引物 1 alectcgagAAGATAGAGTTCCGTATTTC 引物 2: atCAAGCt Ι IΙ CAGTTCAAAATGGTTA痛5引_ 1 atCCteeagMGATAGAGTTC CGTATTTC 引_ 2 atcAAOOTTACTOeCOAACCeAAOATTTTIWP575-755通 1 atcctcgagAAGATAGAGTTCCGTATTTC 引物 2: atcA AGCTTAGTGGTGTTAAGA CTGTCAA]Μρ 135- 55引物 1 atCAAGCTTAATACTAATTCTAATAGTAC 彌 2: atcCkgagAAGATAGAGTTCCGTATTTCIMP455-755
地，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下 IOX緩沖溶液10ul dNTP 2.5mM,8ul 引物 1 :10um，4ul 引物 2 :10um，4ul 質(zhì)粒:50ng/ul,0. 5ul rTag聚合酶(購(gòu)自TAKARA公司)2ul 加入重蒸水(ddH20)至反應(yīng)體系總體積為IOOul。將上述反應(yīng)體系加熱至94°C預(yù)變性3分鐘；然后進(jìn)行熱循環(huán)，熱循環(huán)條件為94°C 變性30秒，迅速冷卻至55°C使引物退火30秒，使引物結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至 720C (該溫度為rTag聚合酶最佳活性溫度)，使引物鏈沿模板延伸1分鐘，進(jìn)行30次熱循環(huán)；然后在72°C下恒溫反應(yīng)15分鐘。1. 1. 2. PCR產(chǎn)物電泳，回收
按照常規(guī)方法，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。應(yīng)注意的是，電泳檢測(cè)應(yīng)在PCR擴(kuò)增反應(yīng)當(dāng)日進(jìn)行，以免電泳檢測(cè)帶型不規(guī)則；可以選擇10g/L瓊脂糖電泳等方式進(jìn)行電泳檢測(cè)。經(jīng)電泳檢測(cè)，PCR反應(yīng)完全，然后進(jìn)行凝膠回收?？梢赃x用Qiagene凝膠回收試劑盒，回收方法如下將回收產(chǎn)物加入到5ul醋酸鈉(3M)和120ul冷的乙醇中，_20°C放置15 分鐘；然后在離心機(jī)上12000rmp離心10分鐘；去上清，用70%乙醇洗滌兩次；室外晾干，加30ul去離子水溶解，制成DNA片段溶液。1.1.3.將回收后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切
酶切反應(yīng)所用兩種內(nèi)切酶優(yōu)選為Hind III和Bio I。酶切反應(yīng)體系如下 緩沖溶液3M，5ul
DNA片段溶液(或載體):40ul 牛血清白蛋白(BSA) 0. 5ul Hind III :2. 5ul Xho I :2. 5ul
將上述體系在37°C下反應(yīng)34小時(shí)。然后在65°C下滅活10分鐘。1. 1.4.將雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接
將雙酶切后的DNA片段與載體進(jìn)行凝膠定量分析，然后進(jìn)行連接，優(yōu)選地，連接反應(yīng)體系如下
DNA 片段15ul 載體2ul
T4 DNA連接酶lul IOX連接酶緩沖溶液2ul 在16°C下，反應(yīng)過(guò)夜。1.1.5.轉(zhuǎn)化
將連接產(chǎn)物在65°C下滅活10分鐘。取IOul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞(如Rosetta (DE3) XplyE)，在冰上孵育30分鐘后，加熱至40°C熱激1分鐘；加入無(wú)抗的LB培養(yǎng)基400ul，在37°C溫度下保溫1小時(shí)。取IOOul涂有Amp抗性的平皿，在37°C培養(yǎng)16小時(shí)。1.1.6.蛋白的表達(dá)與純化
取5ul轉(zhuǎn)化的Rosetta (DE3) XplyE感受態(tài)細(xì)胞，在冰上孵育30分鐘，42°C熱激1小時(shí)，加無(wú)抗的LB培養(yǎng)基400ul，37°C下保溫1小時(shí)。取IOOul涂有Amp和Chl抗性的平皿， 在37°C培養(yǎng)16小時(shí)。挑取單菌接種于TB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)2小時(shí)，然后加入Iul的IPTG(IM)誘導(dǎo)2小時(shí)。12000prm下離心1分鐘以收集菌體，倒掉上清，用lOOulXSDS懸浮，然后95°C煮20分鐘。進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。通過(guò)上述過(guò)程構(gòu)建出N-末端或C-末端缺失的6種突變蛋白，按照模板序列分別命名為 IMP455 515、IMP455 575、IMP455 635、IMP635 755、IMP575 755 和 IMP515 755。2.辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記黏蛋白 2.1配制黏蛋白溶液
取黏蛋白溶解于緩沖溶液中，配制成細(xì)g/ml的黏蛋白溶液。其中，所述緩沖液優(yōu)選為碳酸鹽緩沖溶液，其PH值優(yōu)選為9. 5。2.2.配制 HRP 溶液辣根過(guò)氧化酶(HRP)8mg溶解于2ml蒸餾水中，加入新鮮配制的過(guò)碘酸鹽溶液至400ul， 室溫?cái)嚢?0min ；然后置于乙酸鹽緩沖溶液中，透析過(guò)夜。其中，所述過(guò)碘酸鹽優(yōu)選為過(guò)碘酸鈉，其溶液濃度優(yōu)選為0. IM ；所述乙酸鹽緩沖液濃度優(yōu)選為0. 001M，PH值為4. 4 ；透析溫度優(yōu)選為4°C。取出透析后的HRP，加入碳酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)PH值至9. (Γ9. 5。優(yōu)選的，碳酸鹽緩沖液濃度為0. 1M，PH值為9.5。2. 3進(jìn)行HRP標(biāo)記
將配制的HRP溶液和黏蛋白溶液按1 :1體積進(jìn)行混合，室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后加入新鮮配制的硼氫化鈉緩沖溶液Gmg/L) IOOul,以去除連接反應(yīng)。將混合溶液置于硼酸鹽緩沖溶液中透析過(guò)夜。優(yōu)選地，所述硼酸鹽緩沖溶液濃度 0. 1M，PH值為7. 4 ；透析溫度優(yōu)選為40C。然后將標(biāo)記好的黏蛋白等體積加入甘油(80%濃度)，在_20°C進(jìn)行保持待用。3. Western Bolt (WB)檢測(cè)和拷馬斯亮藍(lán)染檢測(cè)
Western Bolt (WB)檢測(cè)純化的蛋白經(jīng)^festern bolt 二抗孵育后，轉(zhuǎn)印至保鮮膜上， 按每IOcm2膜加Im的ECL工作液的比例，與HRP標(biāo)記的黏蛋白進(jìn)行雜交，然后去除ECL工作液，進(jìn)行壓片或熒光成像儀檢測(cè)目的蛋白?？今R斯亮藍(lán)染檢測(cè)電泳轉(zhuǎn)膜后，用TBS清洗膜2次，以去除轉(zhuǎn)移緩沖液和一些碎膠，拷馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，室溫振蕩3次，每次30分鐘。觀察結(jié)果。4.結(jié)果分析
圖1為構(gòu)建的6個(gè)突變蛋白和IMP455-755序列示意圖。圖2為WB檢測(cè)結(jié)果。以HRP標(biāo)記的黏蛋白作為直標(biāo)一抗，對(duì)6個(gè)突變蛋白作 Western bolt (WB)檢測(cè)，由圖中可以看出，片段 IMP455 575、IMP455 635、IMP455 695 以及IMP515 755均呈陽(yáng)性反應(yīng)，而IMP635 755和IMP575 755則呈陰性反應(yīng)。圖3為拷馬斯亮藍(lán)染的檢測(cè)結(jié)果。SDS-PAGE膠電泳后，進(jìn)行拷馬斯亮藍(lán)染檢測(cè)，經(jīng)過(guò)對(duì)比，可以看出片段IMP455-575和IMP515-755MIMP的重復(fù)區(qū)域IMP515 575 (即圖1陰影部分)為活性片段MIMP。測(cè)試結(jié)果顯示MIMP包含61個(gè)氨基酸，其中酸性氨基酸數(shù)量較多，占13. 1% ；MIMP 分子量為6. 95kDa，分子式為C315H5q2N86O8A2。由于MIMP為位于菌體表面的整合膜蛋白中、具有黏附活性的微小片段，分子較小，具有較高的效價(jià)和特異性；同時(shí)還可以彌補(bǔ)乳酸桿菌易位和不耐抗生素的缺陷，因此具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值和前景。上述內(nèi)容為本發(fā)明的具體實(shí)施例的例舉，對(duì)于其中未詳盡描述的試劑、設(shè)備、操作方法等，應(yīng)當(dāng)理解為采取本領(lǐng)域已有的普通及常規(guī)試劑、設(shè)備、操作方法等來(lái)予以實(shí)施。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種乳酸桿菌整合膜蛋白活性片段的檢測(cè)方法，其特征在于，以乳酸桿菌整合膜蛋白DNA作為模板，加入7組不同引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，構(gòu)建出IMP455 755、以及N-末端或 C-末端缺失的 6 種突變蛋白 IMP455 515，IMP455^635, IMP455 575，IMP635^755, IMP575 755和IMP515 755共7種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；具體步驟如下步驟1，加入所述引物，將所述膜蛋白進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；所述引物與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)關(guān)系如下·2，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，凝膠回收后得到所述6個(gè)突變DNA和IMP455-755 ；步驟3，加入核酸內(nèi)切酶、IMP455-755分別對(duì)6個(gè)突變DNA進(jìn)行酶切；然后將酶切產(chǎn)物與載體BL21 (DE3)按10 1比例，在連接酶的作用下分別進(jìn)行連接；步驟4，加熱至65°C將連接產(chǎn)物滅活，用T0P10感受態(tài)細(xì)胞、無(wú)抗LB培養(yǎng)基以及涂有 Amp抗性的平皿進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；步驟5，取所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，用Rosetta (DE3) XplyE、無(wú)抗LB培養(yǎng)基以及涂有Chi、Amp 抗性的平皿進(jìn)一步培養(yǎng)；挑取菌落接種于TB培養(yǎng)基，IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；離心分離后懸浮， 95°C煮20分鐘，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳純化；步驟6，將上述表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后以HRP標(biāo)記的黏蛋白為直標(biāo)一抗，進(jìn)行WB和拷馬斯亮藍(lán)染檢測(cè)，通過(guò)WB結(jié)果與拷馬斯亮藍(lán)染結(jié)果進(jìn)行對(duì)比；在WB檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性反應(yīng)的DNA片段中，找出與呈陰性反應(yīng)DNA片段沒(méi)有重復(fù)區(qū)域的DNA片段1，和完全包含呈陰性反應(yīng)DNA片段的DNA片段2 ；所述DNA片段1和2的重復(fù)區(qū)域?yàn)樗稣夏さ鞍谆钚云?，其中所述HRP標(biāo)記粘蛋白方法如下取黏蛋白溶解于碳酸鹽緩沖液，配置成黏蛋白溶液；配置HRP溶液HRP溶于水中，加入過(guò)碘酸鹽溶液，進(jìn)行攪拌；然后于乙酸鹽緩沖液中，透析；向所述透析產(chǎn)物中加入碳酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)PH值至9. 0 9. 5，制備出HRP溶液；將所述黏蛋白溶液與所述HRP溶液混合， 攪拌；向步驟3所得混合溶液中加入硼氫化鈉，然后置于硼酸緩沖溶液中透析；制備出HRP 標(biāo)記的黏蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括10X 緩沖溶液，dNTP，引物，DNA模板，rTag聚合酶和重蒸水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述酶切過(guò)程中，反應(yīng)體系包括醋酸鹽緩沖溶液，插入DNA目的片段，BSA和兩種內(nèi)切酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述兩種內(nèi)切酶為B10I和Hindlll。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述連接過(guò)程中，反應(yīng)體系包括載體，所插入的DNA片段，DNA連接酶及其IOX緩沖溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述DNA連接酶為T4DNA連接酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述乙酸鹽緩沖溶液PH值為4.4。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述透析均在4°C下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳酸桿菌整合膜蛋白活性片段的檢測(cè)方法，首先構(gòu)建出N-末端或C-末端缺失的6種突變蛋白，然后以HRP標(biāo)記的黏蛋白為指標(biāo)一抗，進(jìn)行WB和拷馬斯亮藍(lán)染檢測(cè)，將WB結(jié)果與拷馬斯亮藍(lán)染染色結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，從而確定活性片段在乳酸桿菌整合膜蛋白序列中的位置。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102375062SQ20101025687
公開(kāi)日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者劉志華, 秦環(huán)龍 申請(qǐng)人:上海市第六人民醫(yī)院