微藻油脂的提取方法和微藻中甘油三酯含量的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微藻油脂的提取方法和微藻中甘油三酯含量的檢測方法，進(jìn)行微藻油脂提取時，采用了混合溶劑，將混合溶劑與微藻粉混合后進(jìn)行超聲波破壁提??；微藻破壁率高達(dá)99%，且破壁時間很短，整個過程提取微藻胞內(nèi)甘油三酯的效率高。微藻中甘油三酯含量的檢測方法采用氣相法，氣相法能更有效、準(zhǔn)確的檢測出甘油三酯含量。
【專利說明】微藻油脂的提取方法和微藻中甘油三酯含量的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微藻細(xì)胞內(nèi)油脂的提取方法和微藻細(xì)胞內(nèi)所含的甘油三酯含量的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]世界原油產(chǎn)量持續(xù)減少，預(yù)計到2018年將下降至75億桶/年，僅相當(dāng)于1950年原油產(chǎn)量。隨著石油資源日漸枯竭、全球性能源短缺及環(huán)境污染等問題日益嚴(yán)重，開發(fā)綠色、清潔的生物燃料代替?zhèn)鹘y(tǒng)化石燃料，已成為國際研究熱點。
[0003]生物柴油是指由植物油、動物脂肪以及微生物胞內(nèi)油脂與短鏈醇經(jīng)酯交換反應(yīng)得到的有機(jī)脂肪酸酯類物質(zhì)，作為可再生替代能源，環(huán)境友好性和可再生性使其具有很強(qiáng)的競爭力。在生物柴油的眾多原料中，微藻具有光合作用效率高、含油量高、生長周期短、油脂面積產(chǎn)率高等特點，被認(rèn)為是最有潛力替代石油的生物質(zhì)資源。微藻直接利用陽光、二氧化碳及氮、磷等簡單營養(yǎng)物質(zhì)在胞內(nèi)合成大量油脂。大多數(shù)微藻胞內(nèi)的油脂組成主要為甘油三酯(含量> 80%)和C14-C22的長鏈脂肪酸，其中脂肪酸以C16和C18系脂肪酸為主。
[0004]由于微藻細(xì)胞外具有堅韌的細(xì)胞壁，因而對微藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯進(jìn)行提取前首先應(yīng)該對藻體進(jìn)行前破壁處理。微藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的提取率與細(xì)胞壁是否完全破碎密切相關(guān)。常見破壁方法有研磨、酸熱法、藻體自融法、蛋白質(zhì)溶劑變性法、反復(fù)凍融法、超聲波破碎等。其中超聲波法適合于大多數(shù)微藻細(xì)胞，超聲波對細(xì)胞破碎的效率與細(xì)胞種類、時間和濃度有關(guān)。
[0005]微藻細(xì)胞破碎后，對微藻細(xì)胞內(nèi)油脂進(jìn)行提取的方法也至關(guān)重要。目前，關(guān)于微藻胞內(nèi)油脂的直接提取方法主要有物理壓榨法、有機(jī)溶劑提取法、超臨界萃取法等。其中，有機(jī)溶劑提取法是目前國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的一種方法。
[0006]例如中國專利文獻(xiàn)CN 102816636 A (申請?zhí)?01210259778.5)公開了一種微藻
油脂的提取方法，首先離心收集微藻細(xì)胞，經(jīng)凍干得干藻粉；將干藻粉與酒精混合，經(jīng)超聲處理；將超聲處理后的物料加入索氏提取器中，于沸水浴中提取3至4小時，然后經(jīng)過濾分離、減壓濃縮獲得微藻油脂。
[0007]一般來說，所選用的有機(jī)溶劑應(yīng)該力求在提取過程中獲得高出油率，同時避免溶劑對人體的傷害，研究表明，單一溶劑很難將微藻胞內(nèi)油脂提取出來。
[0008]關(guān)于混合溶劑提取方法，中國專利文獻(xiàn)CN 102942991 A (申請?zhí)?01210511744.0)公開了一種微藻油脂提取方法，首先將微藻發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集分離之后的微藻細(xì)胞；將得到的微藻細(xì)胞用緩沖液沖洗，再制成待用藻液；將上述藻液進(jìn)行2至3次反復(fù)凍融，在融化的同時加超聲波場；對于凍融后得到的原液，用索氏提取裝置采用萃取劑丙三醇:乙醇:石油醚=0.5: 6.5: 3進(jìn)行提取；最后烘吹除去得到的含有油脂的萃取混合液中的萃取劑。
[0009]此外，如何準(zhǔn)確測定微藻細(xì)胞內(nèi)油脂尤其是甘油三酯含量，是衡量提取方法是否有效的關(guān)鍵。選擇快速、簡便、高效、靈敏的測定方法具有重要意義。[0010]目前最常用的測定方法是熒光測定法。例如中國專利文獻(xiàn)CN 103063631 A (申請?zhí)?01210560247.X)公開了一種溶劑提取-熒光測定微藻油脂含量的方法，首先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:取微藻，離心后收集沉淀，用PBS緩沖液清洗干凈后用PBS緩沖液稀釋成藻液，作為標(biāo)準(zhǔn)藻液；取5份19.SmL標(biāo)準(zhǔn)藻液，配置不同濃度的三油精溶液；分別往三油精溶液中依次加入二甲基亞砜和尼羅紅染色20分鐘，測定各三油精溶液的熒光強(qiáng)度，以吸光度為縱坐標(biāo)、三油精溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程；然后將微藻油脂提取出來；取0.2mL制備的待測溶液加入19.SmL標(biāo)準(zhǔn)藻液中得到樣品藻液，將0.2mL正己烷加入19.SmL標(biāo)準(zhǔn)藻液中得到空白樣品，分別網(wǎng)樣品藻液、空白樣品中依次加入二甲基亞砜和尼羅紅染色20分鐘，分別測定樣品藻液、空白樣品的熒光強(qiáng)度，樣品藻液的熒光強(qiáng)度減去空白樣品的熒光強(qiáng)度得到待測溶液的熒光強(qiáng)度，由回歸方程計算待測溶液中微藻油脂的濃度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種油脂提取效率高的微藻油脂的提取方法以及一種更有效、準(zhǔn)確檢測微藻細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的方法。
[0012]實現(xiàn)本發(fā)明第一目的的技術(shù)方案是一種微藻油脂的提取方法，包括以下步驟: ①取微藻培養(yǎng)液離心分離后，去除上清液并將獲取的微藻進(jìn)行冷凍干燥，取凍干藻粉
于試管中待提取。
[0013]②將四氫呋喃:氯仿:正己烷按體積比為1: 0.8~1.5: I~1.2配制混合溶液待用。
[0014]③用移液管移取步驟 ②配制的混合溶液，加入步驟①中盛有凍干后藻粉的試管中。
[0015]④將步驟③獲得的藻粉與混合溶液的混合物料在超聲波場中進(jìn)行第一破碎過程，第一破碎過程中混合物料在超聲波場中破碎3~5次，每一次持續(xù)時間為30~60s，每次間隔時間10~30s。
[0016]第一破碎過程完畢后離心分離，收集上清液后向離心分離得到的沉淀中加入新鮮的步驟②配制的混合溶液，進(jìn)行第二破碎過程；第二破碎過程中混合物料在超聲波場中破碎3~5次，每一次持續(xù)時間為30~60s，每次間隔時間10~30s。
[0017]第二破碎過程完畢后離心分離，收集上清液；重復(fù)第二破碎過程I~2次，將各破碎過程結(jié)束后離心分離得到的上清液合并待處理。
[0018]⑤將步驟④合并的上清液倒入事先準(zhǔn)備好的收集瓶中；對收集瓶進(jìn)行抽真空操作，混合有機(jī)溶劑與從微藻中提取出來的油脂分離，收集瓶中剩余的液體即為從微藻中提取的油脂，從而完成微藻油脂的提取。
[0019]上述步驟③中每Ig凍干后的藻粉加入步驟②配制的20~60mL混合溶液。
[0020]上述步驟⑤對收集瓶進(jìn)行抽真空操作時，混合有機(jī)溶劑從收集瓶中抽出后進(jìn)入抽真空裝置出氣端所連接的回收瓶中，混合有機(jī)溶劑收集后可重新用于步驟②至步驟④的破壁提取操作中。
[0021]上述步驟④中，超聲破碎時超聲波的頻率為20~30kHz。
[0022]實現(xiàn)本發(fā)明第二目的的技術(shù)方案是一種微藻中甘油三酯含量的檢測方法，包括以下步驟:
(I)準(zhǔn)備待測樣溶液，包括以下步驟:
①取微藻培養(yǎng)液離心分離后，去除上清液并將獲取的微藻進(jìn)行冷凍干燥，取凍干藻粉0.2g于試管中待提取。
[0023]②將四氫呋喃:氯仿:正己烷按體積比為1: 0.8~1.5: I~1.2配制混合溶液待用。
[0024]③用移液管移取5mL步驟②配制的混合溶液，加入步驟①中盛有凍干后藻粉的試管中。
[0025]④將步驟③獲得的藻粉與混合溶液的混合物料在超聲波場中進(jìn)行第一破碎過程，第一破碎過程中混合物料在超聲波場中破碎3~5次，每一次持續(xù)時間為30~60s，每次間隔時間10~30s。
[0026]第一破碎過程完畢后離心分離，收集上清液后向離心分離得到的沉淀中加入新鮮的步驟②配制的5mL混合溶液，進(jìn)行第二破碎過程，第二破碎過程的操作與第一破碎過程相同；第二破碎過程完畢后離心分離，收集上清液；重復(fù)第二破碎過程I次。
[0027]⑤將步驟④各破碎過程結(jié)束后離心收集的上清液合并后倒入事先準(zhǔn)備好的收集瓶中。
[0028]⑥如果各次上清液合并后體積小于15mL，則用步驟②配制的混合溶液定容至15mL0·[0029](2)配制內(nèi)標(biāo)溶液，稱取IOmg二十八烷溶于ImL混合溶液中，所述混合溶液為準(zhǔn)備待測樣溶液時的步驟②配制的混合溶液。
[0030](3)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,稱量50 μ L十七碳燒,50mg肉豆蘧酸,50mg棕櫚酸,20mg豆甾醇和250μ L植物油溶于4 mL混合溶劑中，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液；所述混合溶液為準(zhǔn)備待測樣溶液時的步驟②配制的混合溶液。
[0031](4)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別從步驟(3)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液中用移液管移取10yL，25 μ L，50 μ L，75 μ L，100 μ L標(biāo)準(zhǔn)溶液至GC管中，并用混合溶液定容至lmL，然后加入IOyL步驟(2)配制的內(nèi)標(biāo)溶液獲得五份標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；用氣相色譜儀分別測定五份標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中的甘油三酯的峰面積值后，以甘油三酯峰面積為X值，以甘油三酯含量為Y值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。
[0032](5)測定微藻中甘油三酯含量，取步驟(1)準(zhǔn)備的待測樣溶液ImL于GC管中，加入10微升內(nèi)標(biāo)二十八烷溶液，然后進(jìn)行GC檢測^fGC檢測得到的甘油三酯峰面積值作為X值代入回歸方程中，其所計算得到的Y值即為微藻中甘油三酯含量。
[0033]上述準(zhǔn)備待測樣溶液，取生長至對數(shù)末期的新鮮微藻培養(yǎng)液，于7000~8500r/min離心10~20分鐘后，去除上清液并將獲取的微藻進(jìn)行冷凍干燥,冷凍干燥過程中每12h測定微藻重量變化，恒重后稱取藻粉于試管內(nèi)。
[0034]上述準(zhǔn)備待測樣溶液的步驟④中，超聲破碎時超聲波的頻率為20~30kHz。
[0035]步驟(4)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，標(biāo)準(zhǔn)溶液中的甘油三酯含量即Y值是將標(biāo)準(zhǔn)溶液中植物油的含量X已知的植物油中的甘油三酯的含量Z得到。
[0036]本發(fā)明具有積極的效果:(I)本發(fā)明進(jìn)行微藻油脂提取時，采用了混合溶劑，將混合溶劑與微藻粉混合后進(jìn)行超聲波破壁提??；微藻破壁率高達(dá)99%，且破壁時間很短，整個過程提取微藻胞內(nèi)甘油三酯的效率高。
[0037](2)本發(fā)明提取微藻油脂的過程在常溫下進(jìn)行、動力消耗小、容易實現(xiàn)大規(guī)模和自動化生產(chǎn)；與索氏萃取法相比，本發(fā)明的油脂提取時間大大縮小，從而節(jié)省資源、節(jié)約能源。
[0038](3)本發(fā)明微藻油脂提取過程中使用的混合溶劑在抽真空干燥時被收集，可用于下一次微藻油脂提取時使用，既避免了有機(jī)溶劑對操作人員的傷害和對環(huán)境的污染，又節(jié)省了物料，降低提取成本。
[0039](4)本發(fā)明的微藻中甘油三酯含量的檢測方法采用氣相法，氣相法能更有效、準(zhǔn)確的檢測出甘油三酯含量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為實施例6待測樣溶液的氣相色譜圖。
【具體實施方式】
[0041](實施例1、微藻油脂的提取方法)
本實施例的微藻油脂的提取方法包括以下步驟:
①取生長至對數(shù)末期的新鮮微藻(本實施例中的微藻為娃藻角刺藻，Chaetocerosgracilis,由美國明尼蘇達(dá)大學(xué)提供)培養(yǎng)液1000mL,于8000r/min離心15分鐘后,去除上清液并將獲取的微藻進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥過程中每12h測定微藻重量變化，恒重后(本實施例中凍干72h后微藻粉恒重)稱取0.2g藻粉于15mL試管內(nèi)。
`[0042]②將四氫呋喃:氯仿:正己烷按體積比為1:1:1配制IOOmL混合溶液待用。
[0043]③用移液管移取5mL步驟②配制的混合溶液，加入步驟①中盛有0.2g藻粉的試管中。
[0044]④將步驟③獲得的藻粉與混合溶液的混合物料在超聲波場中進(jìn)行第一破碎過程，第一破碎過程中混合物料在超聲波場中破碎3~5次(本實施例中為5次)，每一次持續(xù)時間為30~60s (本實施例中為45s)，每次間隔時間10~30s (本實施例中為15s)。
[0045]第一破碎過程完畢后的物料于3000r/min離心I分鐘，收集上清液后向離心分離得到的沉淀中加入新鮮的步驟②配制的5mL混合溶液，進(jìn)行第二破碎過程；第二破碎過程中混合物料在超聲波場中破碎3~5次(本實施例中為5次)，每一次持續(xù)時間為30~60s(本實施例中為45s)，每次間隔時間10~30s (本實施例中為15s)。
[0046]第二破碎過程完畢后的物料于3000r/min離心I分鐘，收集上清液；重復(fù)第二破碎過程I~2次。
[0047]超聲破碎時超聲輸出功率為120w，超聲波的頻率為20~30kHz (本實施例中為23kHz)。
[0048]⑤將步驟④各破碎過程結(jié)束后離心收集的上清液均倒入事先準(zhǔn)備好的收集瓶中；對收集瓶進(jìn)行抽真空操作，混合有機(jī)溶劑與從微藻中提取出來的油脂分離，收集瓶中剩余的液體即為從微藻中提取的油脂，從而完成微藻油脂的提取；本實施例中提取的油脂的質(zhì)量為 0.083g。
[0049]其中混合有機(jī)溶劑從收集瓶中抽出后進(jìn)入抽真空裝置出氣端所連接的回收瓶中，混合有機(jī)溶劑收集后可重新用于步驟②至步驟④的破壁提取操作中。[0050](實施例2、微藻油脂的提取方法)
本實施例的微藻油脂的提取方法其余與實施例1相同，不同之處在于:
步驟②配制混合溶液時，四氫呋喃:氯仿:正己烷按體積比為1: 1.5:1。步驟⑤提取的油脂的質(zhì)量為0.076g。
[0051](實施例3、微藻油脂的提取方法)
本實施例的微藻油脂的提取方法其余與實施例1相同，不同之處在于:
步驟②配制混合溶液時，四氫呋喃:氯仿:正己烷按體積比為1: 0.8:1。步驟⑤提取的油脂的質(zhì)量為0.079g。
[0052](實施例4、微藻油脂的提取方法)
本實施例的微藻油脂的提取方法其余與實施例1相同，不同之處在于:
步驟①取生長至對數(shù)末期的紫球藻(中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，編號FACHB-744)培養(yǎng)液離心分離并凍干得到藻粉待提取油脂。步驟⑤提取的油脂的質(zhì)量為0.061g。
[0053](實施例5、微藻油脂的提取方法)
本實施例的微藻油脂的提取方法其余與實施例1相同，不同之處在于:
步驟①取生長至對數(shù)末期的念珠藻(中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，編號FACHB-133)培養(yǎng)液離心分離并`凍干得到藻粉待提取油脂。步驟⑤提取的油脂的質(zhì)量為
0.058g。
[0054]本發(fā)明采用超聲波破壁與混合溶劑提取相結(jié)合的提取方式，選用四氫呋喃、氯仿、正己烷這三種有機(jī)溶劑，最終微藻破壁率高達(dá)99%，且破壁時間很短，整個過程提取微藻胞內(nèi)甘油三酯的效率高。整個提取微藻油脂的過程在常溫下進(jìn)行、動力消耗小、容易實現(xiàn)大規(guī)模和自動化生產(chǎn)；與索氏萃取法幾個小時的提取時間相比，本發(fā)明的油脂提取時間大大縮小，從而節(jié)省資源、節(jié)約能源。另外，微藻油脂提取過程中使用的混合溶劑在抽真空干燥時被收集，可用于下一次微藻油脂提取時使用，既避免了有機(jī)溶劑對操作人員的傷害和對環(huán)境的污染，又節(jié)省了物料，降低提取成本。
[0055](實施例6、微藻中甘油三酯含量的檢測方法)
本實施例的微藻中甘油三酯含量的檢測方法包括以下步驟:
(I)準(zhǔn)備待測樣溶液，包括以下步驟:
①取生長至對數(shù)末期的新鮮微藻(本實施例中的微藻為娃藻角刺藻，Chaetocerosgracilis,由美國明尼蘇達(dá)大學(xué)提供)培養(yǎng)液1000mL,于8000r/min離心15分鐘后,去除上清液并將獲取的微藻進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥過程中每12h測定微藻重量變化，恒重后(本實施例中凍干72h后微藻粉恒重)稱取0.2g藻粉于15mL試管內(nèi)。
[0056]②將四氫呋喃:氯仿:正己烷按體積比為1:1:1配制IOOmL混合溶液待用。
[0057]③用移液管移取5mL步驟②配制的混合溶液，加入步驟①中盛有0.2g藻粉的試管中。
[0058]④將步驟③獲得的藻粉與混合溶液的混合物料在超聲波場中進(jìn)行第一破碎過程，第一破碎過程中混合物料在超聲波場中破碎3~5次，每一次持續(xù)時間為30~60s，后一次與前一次的間隔時間10~30s。
[0059]第一破碎過程完畢后的物料于3000r/min離心I分鐘，收集上清液后向離心分離得到的沉淀中加入新鮮的5mL混合溶液，進(jìn)行第二破碎過程，第二破碎過程的操作與第一破碎過程相同；第二破碎過程完畢后的物料于3000r/min離心I分鐘，收集上清液；重復(fù)第二破碎過程I次。超聲破碎時超聲波的頻率為20~30Hz (本實施例中為23Hz)。
[0060]⑤將步驟④各破碎過程結(jié)束后離心收集的上清液均倒入事先準(zhǔn)備好的帶有刻度的收集瓶中。
[0061]⑥如果三次上清液合并后體積小于15mL，則用步驟②配制的混合溶液定容至15mL0
[0062](2)配制內(nèi)標(biāo)溶液。稱取IOmg 二十八烷溶于ImL混合溶液中；所述混合溶液為準(zhǔn)備待測樣溶液時的步驟②配制的混合溶液。
[0063](3)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱量50 μ L十七碳燒,50mg肉豆蘧酸,50mg棕櫚酸,20mg豆甾醇和250yL植物油溶于4 mL混合溶劑中，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。所述植物油為玉米胚芽油；所述混合溶液為準(zhǔn)備待測樣溶液時的步驟②配制的混合溶液。
[0064](4)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別從步驟(3)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液中用移液管移取10 μ L，25μ?，50μ?，75μ UlOOyL標(biāo)準(zhǔn)溶液至GC管中，并用混合溶液定容至ImL;然后加入10 μ L步驟(2)配制的內(nèi)標(biāo)溶液獲得四份標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。
[0065]具體的曲線制作步驟是:用氣相色譜儀對五份標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液分別測定獲得其中甘油三酯的峰面積值后，以甘油三酯峰面積值為X值，以甘油三酯含量為Y值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，得到的回歸方程為Υ=5.8637Χ+0.1192 (R2=0.995)。
[0066]本實施例配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液所用的植物油中甘油三酯的含量為96%，因此上述五份標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中甘油三酯的含量即Y值是將標(biāo)準(zhǔn)溶液中植物油的含量Χ96%得到。
[0067]具體操作中，選用不同的植物油時，各植物油中的甘油三酯的含量ζ是已知的，因此標(biāo)準(zhǔn)溶液中甘油三酯的含量只需將標(biāo)準(zhǔn)溶液中植物油的含量Xz得到。
[0068](5)測定微藻中甘油三酯含量。取步驟(1)準(zhǔn)備的待測樣溶液ImL于GC管中，加入10微升內(nèi)標(biāo)二十八烷溶液，然后進(jìn)行GC檢測，GC圖譜見圖1。
[0069]將GC檢測得到的甘油三酯峰面積值值代入步驟(4)的回歸方程中，計算微藻胞內(nèi)甘油三酯含量為41.2%。
[0070](對比例1、微藻中甘油三酯含量的檢測方法)
為了檢測本發(fā)明的微藻中甘油三酯含量的檢測方法的準(zhǔn)確和有效性，我們同時稱量
0.2g實施例6中凍干的微藻粉末，常規(guī)研磨處理后，以95%乙醇為提取溶劑，采用索氏提取法提取微藻胞內(nèi)總油脂，提取時間為8h，通過提取前后重量變化來計算油脂含量，結(jié)果微藻胞內(nèi)總油脂含量為39.6%，說明本發(fā)明方法的有效、準(zhǔn)確性。
【權(quán)利要求】
1.一種微藻油脂的提取方法，其特征在于包括以下步驟: ①取微藻培養(yǎng)液離心分離后，去除上清液并將獲取的微藻進(jìn)行冷凍干燥，取凍干藻粉于試管中待提??； ②將四氫呋喃:氯仿:正己烷按體積比為1: 0.8~1.5: I~1.2配制混合溶液待用； ③用移液管移取步驟②配制的混合溶液，加入步驟①中盛有凍干后藻粉的試管中； ④將步驟③獲得的藻粉與混合溶液的混合物料在超聲波場中進(jìn)行第一破碎過程，第一破碎過程中混合物料在超聲波場中破碎3~5次，每一次持續(xù)時間為30~60s，每次間隔時間10~30s ； 第一破碎過程完畢后離心分離，收集上清液后向離心分離得到的沉淀中加入新鮮的步驟②配制的混合溶液，進(jìn)行第二破碎過程；第二破碎過程中混合物料在超聲波場中破碎3~5次，每一次持續(xù)時間為30~60s，每次間隔時間10~30s ； 第二破碎過程完畢后離心分離，收集上清液；重復(fù)第二破碎過程I~2次，將各破碎過程結(jié)束后離心分離得到的上清液合并待處理； ⑤將步驟④合并的上清液倒入事先準(zhǔn)備好的收集瓶中；對收集瓶進(jìn)行抽真空操作，混合有機(jī)溶劑與從微藻中提取出來的油脂分離，收集瓶中剩余的液體即為從微藻中提取的油月旨，從而完成微藻油脂的提取。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微藻油脂的提取方法，其特征在于:步驟③中每Ig凍干后的藻粉加入步驟②配制的20~60mL混合溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述·的微藻油脂的提取方法，其特征在于:步驟⑤對收集瓶進(jìn)行抽真空操作時，混合有機(jī)溶劑從收集瓶中抽出后進(jìn)入抽真空裝置出氣端所連接的回收瓶中，混合有機(jī)溶劑收集后可重新用于步驟②至步驟④的破壁提取操作中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微藻油脂的提取方法，其特征在于:步驟④中，超聲破碎時超聲波的頻率為20~30kHz。
5.一種微藻中甘油三酯含量的檢測方法，其特征在于包括以下步驟: (I)準(zhǔn)備待測樣溶液，包括以下步驟: ①取微藻培養(yǎng)液離心分離后，去除上清液并將獲取的微藻進(jìn)行冷凍干燥，取凍干藻粉·0.2g于試管中待提?。? ②將四氫呋喃:氯仿:正己烷按體積比為1: 0.8~1.5: I~1.2配制混合溶液待用； ③用移液管移取5mL步驟②配制的混合溶液，加入步驟①中盛有凍干后藻粉的試管中； ④將步驟③獲得的藻粉與混合溶液的混合物料在超聲波場中進(jìn)行第一破碎過程，第一破碎過程中混合物料在超聲波場中破碎3~5次，每一次持續(xù)時間為30~60s，每次間隔時間10~30s ； 第一破碎過程完畢后離心分離，收集上清液后向離心分離得到的沉淀中加入新鮮的步驟②配制的5mL混合溶液，進(jìn)行第二破碎過程，第二破碎過程的操作與第一破碎過程相同；第二破碎過程完畢后離心分離，收集上清液；重復(fù)第二破碎過程I次； ⑤將步驟④各破碎過程結(jié)束后離心收集的上清液合并后倒入事先準(zhǔn)備好的收集瓶中； ⑥如果各次上清液合并后體積小于15mL，則用步驟②配制的混合溶液定容至15mL ； (2)配制內(nèi)標(biāo)溶液，稱取IOmg二十八烷溶于ImL混合溶液中，所述混合溶液為準(zhǔn)備待測樣溶液時的步驟②配制的混合溶液； (3)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,稱量50μ L十七碳燒,50mg肉豆蘧酸,50mg棕櫚酸,20mg豆甾醇和250 μ L植物油溶于4 mL混合溶劑中，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液；所述混合溶液為準(zhǔn)備待測樣溶液時的步驟②配制的混合溶液； (4)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別從步驟(3)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液中用移液管移取10yL，25yL，50 μ L，75 μ L，100 μ L標(biāo)準(zhǔn)溶液至GC管中，并用混合溶液定容至lmL，然后加入10 μ L步驟(2)配制的內(nèi)標(biāo)溶液獲得五份標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；用氣相色譜儀分別測定五份標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中的甘油三酯的峰面積值后，以甘油三酯峰面積為X值，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中的甘油三酯含量為Y值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程； (5)測定微藻中甘油三酯含量，取步驟(1)準(zhǔn)備的待測樣溶液ImL于GC管中，加入10微升內(nèi)標(biāo)二十八烷溶液，然后進(jìn)行GC檢測；將GC檢測得到的甘油三酯峰面積值作為X值代入回歸方程中，其所計算得到的Y值即為微藻中甘油三酯含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微藻中甘油三酯含量的檢測方法，其特征在于:準(zhǔn)備待測樣溶液，取生長至對數(shù)末期的新鮮微藻培養(yǎng)液，于7000~8500r/min離心10~20分鐘后，去除上清液并將獲取的微藻進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥過程中每12h測定微藻重量變化，恒重后稱取藻粉于試管內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的 微藻中甘油三酯含量的檢測方法，其特征在于:準(zhǔn)備待測樣溶液的步驟④中，超聲破碎時 超聲波的頻率為20~30kHz。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微藻中甘油三酯含量的檢測方法，其特征在于:步驟(4)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，標(biāo)準(zhǔn)溶液中的甘油三酯含量即Y值是將標(biāo)準(zhǔn)溶液中植物油的含量X已知的植物油中的甘油三酯的含量z得到。
【文檔編號】C11B1/10GK103589501SQ201310585841
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】梁國斌, 劉維平, 朱政滔 申請人:江蘇理工學(xué)院