專利名稱：粒狀微生物生物量的制備及其有價(jià)值的化合物的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于處理微生物生物量(一般為由發(fā)酵產(chǎn)生的包含微生物的產(chǎn)物)的方法，該方法可以使有用的或者有價(jià)值的化合物與所產(chǎn)生的待改進(jìn)的生物量得到分離。本方法可以包括在化合物回收之前使生物量成為粒狀(例如通過(guò)擠壓)。
背景技術(shù)：
至今的一段時(shí)間以來(lái)人們已經(jīng)把微生物當(dāng)作各種產(chǎn)物的有價(jià)值來(lái)源。幾種這樣的微生物產(chǎn)物存在于微生物細(xì)胞的內(nèi)部，或者與微生物細(xì)胞有關(guān)。為了回收比較純的形式的這樣產(chǎn)物，把產(chǎn)物與微生物生物量分離是必要的。例如，為了把親脂化合物與微生物生物量分離，通常需要用有機(jī)溶劑或者超臨界流體(例如液態(tài)CO2)實(shí)施抽提(浸提)步驟。
生物量得自發(fā)酵并且可以用于產(chǎn)物抽提。它通常是濕細(xì)胞餅，而各種預(yù)處理造成了細(xì)胞的嚴(yán)重破裂。物理處理(例如干燥，如噴霧干燥或者凍干，和/或機(jī)械粉碎，如均化或者研磨)、化學(xué)處理(酸或者堿)或者酶促處理都可以使細(xì)胞發(fā)生破裂。需要進(jìn)行生物量的干燥以便減少溶劑含量，以及在親脂化合物的抽提的情況下需要防止麻煩的乳狀液產(chǎn)生。
噴霧干燥通常用來(lái)獲得準(zhǔn)備抽提的生物量。噴霧干燥器的干燥要求下列條件為了給干燥器供料，生物量應(yīng)該是(濃縮的)液體或者具有小微粒(使之能夠進(jìn)行圓盤或者噴嘴噴霧)的漿液。這意味著對(duì)于微生物生物量來(lái)說(shuō)漿液的最大干物質(zhì)含量是限于大約20-30％，爾后的干燥步驟將達(dá)到90-95％的干物質(zhì)含量，但這將是比較昂貴的。
就時(shí)間上來(lái)說(shuō)噴霧干燥方法是比較短的。然而，在大多數(shù)情況下產(chǎn)物溫度(相對(duì))較高。這意味著對(duì)于氧化敏感的化合物來(lái)說(shuō)有氧化和爾后的降解的高風(fēng)險(xiǎn)。在生物量含有高含量的胞內(nèi)脂質(zhì)物質(zhì)的情況下，由于在高溫下自生物量中產(chǎn)生的脂質(zhì)的“出汗”，干燥有時(shí)是麻煩的。在這種情況下，將發(fā)生干燥器的淤積。
噴霧干燥的另一個(gè)弊端是其限制了抽提方法的類型，抽提方法可以用來(lái)在其后分離所需的化合物。它通常不可能把例如滲濾抽提技術(shù)運(yùn)用于細(xì)磨成粉末的產(chǎn)物(如噴霧干燥的生物量)上。微生物生物量的機(jī)械破裂(如通過(guò)研磨)也有產(chǎn)生大量的細(xì)粉(或者粉末)的同樣弊端。
英國(guó)專利號(hào)GB 1 466 853涉及把油與噴霧干燥的酵母粉分離的方法。在炊具中用80℃的蒸汽濕潤(rùn)和加熱酵母粉。然后將濕粉加料于碼垛機(jī)中，使之轉(zhuǎn)化成為小球、成為片狀并再一次干燥以便減少5-10％(重量)的含水量。然后由篩過(guò)濾所產(chǎn)生的薄片并在碼垛機(jī)中再循環(huán)。這一物質(zhì)適合于滲濾抽提。然而，該方法有弊端，即粉末一旦得到噴霧干燥就需要再水合以及在高溫下處理然后再干燥。對(duì)于熱敏感和/或氧化敏感的化合物，這樣的不利處理步驟導(dǎo)致降解并因而使產(chǎn)量減少。
國(guó)際專利申請(qǐng)WO-A-93/25644(等同于US 5,539,133)涉及用于把具有高含量多不飽和脂肪酸(PUFAs)的類脂類與大型和/或微型藻類(一種海草)分離的方法，其中大型藻類可以反復(fù)是得自藻酸鹽或者角叉菜膠抽提物的殘?jiān)?。得自藻類的物質(zhì)具有少于50mm的顆粒大小以及大于50％的干物質(zhì)含量。當(dāng)藻類材料具有比所表明的值大的顆粒大小和/或比所表明的值小的干物質(zhì)含量時(shí)，就需要通過(guò)研磨和/或干燥預(yù)處理該材料。然而，正如以上所指出的，研磨對(duì)于有效的抽提和精煉方法是不利的。
DD-A-150627涉及制備包含生物量的酵母(或者細(xì)菌)，其中該生物量得到干燥，然后變成大顆粒(8-12mm，表面上為球形的)。這些顆粒有20％的含水量，然后得到研磨。利用石油醚進(jìn)行抽提以便回收不需要的柴油(或者烴)，該柴油可用作為微生物的碳源。余下的殘?jiān)米鳛閯?dòng)物飼料。
DE-A-1923529涉及在用流化床干燥以便產(chǎn)生顆粒之前使之蒸發(fā)的生物量。然后研磨或者粉碎這些材料。然后抽提剩余油(作為污染物)。與以前的文件相同，所提取的物質(zhì)是雜質(zhì)并且不能由包含在生物量中的微生物產(chǎn)生。
EP-A-0322227涉及用于通過(guò)以芝麻油喂養(yǎng)微生物來(lái)產(chǎn)生花生四烯酸(ARA)和γ-亞油酸(GLA)的方法。
美國(guó)專利5,340,594涉及從真菌產(chǎn)生高度不飽和脂肪酸。可以將生物量與磨過(guò)的玉米混合，所產(chǎn)生的產(chǎn)物用作為動(dòng)物飼料。
WO-A-92/12711涉及微生物油的混和，特別是作為嬰兒配方的添加物時(shí)，其中生物量在濾器上得到過(guò)濾和擠壓從而產(chǎn)生濾餅，然后凍干該濾餅。
本發(fā)明尋求提供從生物量中抽提所需化合物的方法，該方法可以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的一些或者所有問(wèn)題。
發(fā)明描述按照本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了把一種或多種化合物與包含微生物(已產(chǎn)生所需的化合物之一)的微生物生物量分離的方法，該方法包括a)提供或者獲得干物質(zhì)含量為25％至80％的生物量；b)使生物量粒化成為具有25％至80％的平均干物質(zhì)含量的粒狀顆粒；c)干燥粒狀顆粒以便產(chǎn)生具有至少80％的平均干物質(zhì)含量的干燥顆粒；d)從得自c)的干燥顆粒中純化、提取或者分離上述或者每一種化合物。
驚人的是曾有人發(fā)現(xiàn)通過(guò)利用生物量的干燥顆粒，可以達(dá)到比將要分離的化合物的預(yù)期產(chǎn)率高的高產(chǎn)率。一般認(rèn)為這是因?yàn)轭w粒的結(jié)構(gòu)可以使用于抽提的溶劑最大量地進(jìn)入。當(dāng)然，如果微粒太大，那么表面積可能是低的，從而產(chǎn)生相應(yīng)較低的產(chǎn)率。然而，微粒不應(yīng)該太小否則它們可能阻塞在抽提期間使用的濾器。因?yàn)檫@一原因，本發(fā)明方法不包括研磨、成片或者粉碎步驟或者階段。
各階段的含水量也可以影響產(chǎn)量。干物質(zhì)含量太高，生物量將破碎并且可能形成細(xì)粉或者粉末，如果使用過(guò)濾提取方法這是不利的。然而，含水量太高，就可能獲得太濕以致不能形成顆粒的漿液。
使物質(zhì)成為粒狀的方法是本領(lǐng)域已知的。然而，它們?cè)谝恍╇A段經(jīng)常與研磨或者成片結(jié)合在一起，這產(chǎn)生了如上所討論的不利之處。在本發(fā)明中，正是干燥的顆粒用于化合物的抽提，并且無(wú)研磨的或者成片的形式。此外，通過(guò)成粒，可以使對(duì)生物量中的細(xì)胞的損害得到最大限度地減少，這可以再一次有助于增加化合物的產(chǎn)量。在美國(guó)專利5,340,594中沒(méi)有揭示生物量的擠壓，但是在這里擠壓形式用作為動(dòng)物飼料而對(duì)于自該粒狀形式中抽提具體化合物將產(chǎn)生高產(chǎn)率的方面，則無(wú)任何正確評(píng)價(jià)。
通過(guò)把生物量加工成粒狀顆粒，可以有助于干燥過(guò)程。在生物量已經(jīng)處理成粒狀形式之后，干燥可以是相當(dāng)容易和有效的。
此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)干燥顆粒是特別穩(wěn)定的，尤其是在環(huán)境溫度或者室溫下。生物量可以這種形式存儲(chǔ)相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間而沒(méi)有降解。雖然不希望為理論所束縛，但是人們懷疑這種情況發(fā)生是因?yàn)榛衔镂挥陬w粒內(nèi)部，因此至少部分保護(hù)該化合物免受環(huán)境影響，對(duì)于某些化合物，這種環(huán)境影響可以造成因氧化而降解。
按照本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了包含生物量的粒狀顆粒的組合物，該顆粒具有至少30％的平均干物質(zhì)含量，但是少于70％，并且通過(guò)使生物量成為粒狀而獲得。這樣的粒狀顆粒可以通過(guò)利用第一個(gè)方面的方法而獲得，并且從成粒階段(b)產(chǎn)生。
按照本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了包含干燥顆粒的組合物，該顆粒得自微生物生物量，并且具有至少80％的干物質(zhì)含量(平均值)。這些顆?？梢酝ㄟ^(guò)利用第一個(gè)方面的方法而獲得，并且在于燥階段(c)之后產(chǎn)生。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣的組合物是生物量的特別穩(wěn)定型。它可以存儲(chǔ)數(shù)周，要不然數(shù)年(例如在室溫下)，而極少甚至沒(méi)有降解或者其性質(zhì)方面的變化。這意味著它所含有的化合物也可以穩(wěn)定地存儲(chǔ)(乃至輸送)。此外，它可以存儲(chǔ)在室溫下，這避免了凍結(jié)的需要，或者存儲(chǔ)在特別低的溫度下，這是現(xiàn)有技術(shù)的生物量材料的存儲(chǔ)方式。明顯地，這樣的穩(wěn)定性是有利的，因?yàn)榇鎯?chǔ)條件相當(dāng)便宜。
優(yōu)選的生物量成粒方法是通過(guò)擠壓。這可以最大限度地減少細(xì)胞的破裂。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)具有最小程度的細(xì)胞破裂時(shí)生物量的穩(wěn)定性將更好，換句話說(shuō)本發(fā)明的方法可以適應(yīng)于最大化仍然完整的細(xì)胞的數(shù)量。這是與許多現(xiàn)有技術(shù)的提取相反的，其中現(xiàn)有技術(shù)是使細(xì)胞破裂以便分離化合物。
本發(fā)明的第四方面涉及用于把一種或多種化合物與生物量的顆粒分離的方法，該方法包括a)提供具有至少80％的干物質(zhì)含量的干燥顆粒，該顆粒得自包含微生物(產(chǎn)生一種這樣的化合物)的微生物生物量；b)通過(guò)溶劑抽提從干燥顆粒中提取或者分離上述或者每種化合物。
優(yōu)選的提取方法是使用溶劑，其中合適地化合物是可溶性的。優(yōu)選的提取方法是利用滲濾在這里，溶劑可以漫過(guò)顆粒的床。對(duì)于這一技術(shù)，需要明白的是顆粒不應(yīng)該太小(例如不應(yīng)該研磨或者粉碎它們)，否則將獲得太多的將阻塞濾器的“粉末”(或者細(xì)粉)。大顆粒也要避免，但是在這兩個(gè)極端之間，人們可以獲得最適的表面積，因此優(yōu)選地顆粒比濾器的孔隙大。優(yōu)選地，顆粒是高度多孔的以便使得溶劑易于接近所要提取的化合物。
在本發(fā)明中，使微生物生物量餅形成粒狀顆粒的預(yù)處理可以極大地改善爾后的干燥方法。所產(chǎn)生的干燥的粒狀生物量可以特別適合于任何種浸泡式或者滲濾式抽提。可以具體地調(diào)整顆粒的大小以適于最適的干燥和抽提條件。通過(guò)利用按照本發(fā)明預(yù)處理的生物量，可有利地提取所需的化合物而無(wú)需在抽提之前破裂細(xì)胞。
本發(fā)明的方法可以用來(lái)由幾乎任何類型的微生物制備粒狀顆?；蛘吒稍镱w粒。微生物可以是絲狀形式的，如同真菌或者某些細(xì)菌一樣，或者作為單細(xì)胞，如同酵母、藻類和細(xì)菌一樣。因此，生物量可以包含微生物，該微生物是酵母、真菌(fungae)、細(xì)菌或者藻類。優(yōu)選的真菌是毛霉目。例如，真菌可以是被孢霉屬、須霉屬、布拉霉屬或者曲霉屬。優(yōu)選的真菌是高山被孢霉種、三孢布拉霉種和土曲霉種。
就酵母而論，優(yōu)選的是畢赤酵母屬，如Pichia ciferrii種。
細(xì)菌可以是丙酸桿菌屬。
如果生物量包含藻類，那么這優(yōu)選地是甲藻和/或?qū)儆贑rypthecodinium屬。優(yōu)選的藻類是Crypthecodinium cohnii種。
要從微生物生物量(按照本發(fā)明制備的)中分離出來(lái)的化合物可以定位于細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞膜或者細(xì)胞壁相聯(lián)系，或者細(xì)胞外產(chǎn)生(然后它可以是不溶于水的)。
要分離的化合物可以是親水的或者疏水的(例如親脂的)。這樣的化合物的例子是胞內(nèi)蛋白質(zhì)或者酶、類脂類、如維生素(例如維生素B12)一樣的次生代謝物、大環(huán)內(nèi)酯或者多烯抗菌素、提供香料的物質(zhì)或者類胡蘿卜素。優(yōu)選地，要從微生物生物量分離的化合物是親脂化合物。
從按照本發(fā)明處理的生物量中提取的化合物可以具有高質(zhì)量，這是由于它只有因用于處理方法中的溫和條件而致的少量變質(zhì)(如果有的話)。因此，本發(fā)明特別適合于微生物生物量(對(duì)熱和/或氧化敏感的化合物需要從其中分離)的制備。
本發(fā)明適合于制備微生物生物量以便具有高度不飽和度的化合物(如包含多不飽和脂肪酸(PUFA)的類脂類)的分離。優(yōu)選地PUFA是C18、C20或者C22ω-3或者ω-6多不飽和脂肪酸。例如，所說(shuō)化合物可以是二十二碳六烯酸(DHA)(得自藻類或者真菌，如Crypthecodinium甲藻或者破囊壺菌屬真菌)、γ-亞麻酸(GLA)、二高(dihomo)-γ-亞麻酸或者花生四烯酸(ARA)(得自真菌，如被孢霉屬、腐霉屬或者蟲霉屬)，或者二十碳五烯酸(EPA)(得自藻類，如紫球藻屬或者菱形藻屬)。這些PUFAs之任一都可以獨(dú)立地分離或者(更通常)以脂質(zhì)形式分離。
按照本發(fā)明可以得到分離的化合物的另外例子包括如得自霉菌屬的β-胡蘿卜素(例如得自毛霉目(例如須霉屬或者布拉霉屬))、得自酵母Phaffiarhodozyma的蝦青素、得自酵母Pichia ciferrii的四乙酰植物鞘氨醇(TAPs)和/或得自丙酸桿菌的維生素B12。
可以提取的其它化合物包括親脂性化合物/非極性化合物如洛伐他汀、環(huán)孢菌素和菜特洛霉素。這些化合物中，頭兩種化合物在胞外產(chǎn)生或者與細(xì)胞壁結(jié)合。因此，合適的溶劑包括庚烷、己烷、丙酮、甲醇和甲苯以及乙醇。然而，對(duì)于后兩種化合物，對(duì)于環(huán)孢菌素可以利用異丙醇或者乙酸丁酯，對(duì)于萊特洛霉素可以利用乙醇或者甲醇。一般地說(shuō)，己烷適合于非極性抗菌素，如那些由鏈霉菌屬的有機(jī)體產(chǎn)生的抗菌素。
其它化合物包括聚酮化合物或者得自聚酮化合物的代謝物，該聚酮化合物包括許多抗菌素。優(yōu)選的聚酮化合物是那些不含有氮并且可以是芳香族(優(yōu)選地，包含至少6個(gè)成員環(huán))的聚酮化合物。優(yōu)選的聚酮化合物是抑制素，該抑制素包括洛伐他汀、西伐他停、普伐他汀和compactin。其它優(yōu)選的化合物是HMG-CoA還原酶抑制劑。這些化合物可以在血液中減少膽固醇水平。
可以提取的另一類化合物包括如麥角固醇的類固醇。這些都是由酵母和霉菌產(chǎn)生的。
本發(fā)明的方法特別適合于親脂化合物(如包含多不飽和脂肪酸(PUFA)的類脂類和/或類胡蘿卜素)的分離。
按照本發(fā)明方法分離的化合物(組合物)適合用于人或者動(dòng)物食品中(例如嬰兒配方)或者其它可食用的組合物中以及化妝品中、保健組合物或者添加物中、或者藥物組合物中。
在本發(fā)明的方法中，可以首先將所選擇的微生物發(fā)酵以便為爾后的化合物抽提獲得足夠量的生物量。發(fā)酵條件取決于所利用的有機(jī)體，并且可以在所產(chǎn)生的生物量中產(chǎn)生最高含量的化合物。
在比較實(shí)施例26中提出了合適的發(fā)酵條件。
在發(fā)酵過(guò)程完成之后，可以對(duì)發(fā)酵肉湯(取決于要分離的化合物的類型)進(jìn)行巴氏消毒以便殺死生產(chǎn)性有機(jī)體并滅活任何不需要的酶。如果需要的話，可以在肉湯中加入絮凝劑和/或其它加工輔助劑以便提高它的過(guò)濾本領(lǐng)。
合適的絮凝劑包括CaCl2、AL2(SO4)3以及極性陽(yáng)離子聚酰胺。這些絮凝劑可以以0.1至2％的重量百分含量出現(xiàn)。
優(yōu)選地，要對(duì)生物量(或者肉湯)進(jìn)行巴氏消毒。在發(fā)酵之后，可能必須進(jìn)行巴氏消毒以便獲得漿液，該漿液可以用衛(wèi)生方法處理。在發(fā)酵罐中對(duì)生物量進(jìn)行巴氏消毒可以具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，生產(chǎn)性有機(jī)體沒(méi)有暴露在環(huán)境中。其次，還可以滅活不需要的酶促活性(影響靶化合物的質(zhì)量)。
巴氏消毒在60至100℃的溫度下進(jìn)行，溫度的高低取決于生產(chǎn)性有機(jī)體的種類。可以通過(guò)用通入發(fā)酵罐的蒸汽(直接)加熱或者利用通過(guò)換熱器的介質(zhì)(間接)加熱來(lái)進(jìn)行巴氏消毒，該換熱器通過(guò)器壁或者用冷卻盤管或者外部換熱器(如已知的平板換熱器或者其它合適的換熱器)換熱。
可以使用下列的優(yōu)選巴氏消毒條件，尤其是對(duì)于被孢霉屬有機(jī)體。
對(duì)發(fā)酵肉湯(或者生物量)進(jìn)行巴氏消毒以便殺死微生物，并且滅活酶的活性。這可以在主發(fā)酵罐接種之后的大約144小時(shí)進(jìn)行。生物量(或者肉湯)適于在50至95℃下進(jìn)行巴氏消毒，優(yōu)選地為60至75℃，最適為63至68℃。這一過(guò)程可以進(jìn)行30至90分鐘，優(yōu)選地為50至75分鐘，最適為55至65分鐘。這一過(guò)程可以使用任何合適的加熱方法，但是優(yōu)選的是直接蒸汽注入，如注入主發(fā)酵容器中。
在巴氏消毒之后，使肉湯冷卻，或者變涼。這一過(guò)程可以花費(fèi)大約4小時(shí)，合適的是冷卻至大約25℃。
如果包括得自不同生物量或者發(fā)酵肉湯的兩種或者多種有機(jī)體，那么可以逐個(gè)地對(duì)每個(gè)生物量(或者肉湯)進(jìn)行巴氏消毒，或者在混合之后對(duì)它們進(jìn)行巴氏消毒。然而，前者是優(yōu)選的，因?yàn)椴煌陌褪舷緱l件可以用于不同的有機(jī)體。
通常，巴氏消毒將發(fā)生于發(fā)酵已經(jīng)完成的發(fā)酵罐之中。然而，對(duì)于某些有機(jī)體(如細(xì)菌)，通常優(yōu)選的是首先從發(fā)酵容器中除去微生物，然后進(jìn)行巴氏消毒(例如，在附聚成粒過(guò)程的噴霧干燥之前)。
一般地說(shuō)，巴氏消毒是有利的，因?yàn)樗粌H可以殺死微生物而且更重要的是它可以滅活一種或多種對(duì)化合物產(chǎn)生不利影響的酶。例如，巴氏消毒可以滅活各種脂酶，這些脂酶可以從甘油三酯主鏈上切下脂肪酸。這對(duì)于PUFAs(其中甘油三酯含量是優(yōu)選的)是不利的。
正如所知道的，巴氏消毒通常將殺死大多數(shù)微生物，即使不是所有。因此，在干燥顆粒中，殺死(即不是活著的)至少95％(如至少98％，即使不是99％)微生物。
對(duì)于某些有機(jī)體(例如畢赤酵母屬)，優(yōu)選的是不實(shí)施巴氏消毒。
為了阻止巴氏消毒過(guò)的生物量在爾后的加工處理步驟期間再受到污染，可以設(shè)計(jì)條件以減少生長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)。一種可能性是用合適的酸酸化肉湯。為了阻止許多微生物物種的過(guò)度生長(zhǎng)，3至4的pH范圍結(jié)合低處理溫度是足夠的。
如乙醇、山梨酸酯等等的其它生物機(jī)能結(jié)構(gòu)劑(biostatic agent)也可以用于這一目的。
對(duì)于熱穩(wěn)定產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，可以采用高溫(60-100℃)處理。
優(yōu)選的酸化條件(例如對(duì)于被孢霉屬的有機(jī)體)如下。
將巴氏消毒過(guò)的肉湯的pH調(diào)整為2至5以便提高微生物的穩(wěn)定性，優(yōu)選的pH范圍為3至4，最適的pH為大約3.5。
肉湯的酸化作用(在巴氏消毒之前或者之后)可以具有附加的優(yōu)點(diǎn)。如果化合物是聚酮化合物(例如抑制素)，那么酸化作用可以使化合物產(chǎn)生沉淀。對(duì)于許多化合物，尤其是水溶性化合物，在進(jìn)一步的處理步驟之前的沉淀是需要的，以免當(dāng)過(guò)濾肉湯以便除去水時(shí)失去化合物。因此，在巴氏消毒之前或者之后，可以沉淀化合物(例如，通過(guò)酸化作用，雖然可以使用任何其它為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法)。
可以由任何合適的方法調(diào)整pH，例如用85％磷酸，優(yōu)選為稀釋的55％磷酸，最適為稀釋的33％磷酸。
在這一階段人們可以得到已巴氏消毒過(guò)的肉湯。下一階段是通過(guò)把微生物與周圍介質(zhì)分離來(lái)獲得生物量。
可以進(jìn)行固液態(tài)分離技術(shù)以便把生物量與發(fā)酵肉湯分離。這一(收獲的)生物量通常具有變化于20至35％的干物質(zhì)含量，含量的多少取決于微生物的類型。然而，對(duì)于擠壓(和爾后的干燥)，生物量典型地應(yīng)該具有范圍為25％至80％的干物質(zhì)含量。
如果生物量的含水量太高(例如對(duì)于擠壓和/或爾后的干燥)，那么可以使它脫水和/或使其干物質(zhì)含量增加。用一些方法可以達(dá)到這一目的。首先，可以使生物量受于(附加的)脫水?？梢岳萌魏伪绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知的脫水方法；所需的干物質(zhì)含量可以是25或者30至80％。
優(yōu)選的是利用機(jī)械脫水方法。然而，機(jī)械脫水方法所能達(dá)到的最大干物質(zhì)含量將是變化的，變化的范圍取決于微生物的類型。對(duì)于某些微生物(例如酵母)，生物量在機(jī)械脫水之后的干物質(zhì)含量不會(huì)超過(guò)35至40％的水平，而對(duì)某些富含脂質(zhì)的微生物的生物量實(shí)施相同的方法可以產(chǎn)生45至60％的高干物質(zhì)含量。
一種優(yōu)選的方法是利用薄膜壓濾機(jī)(帶有擠壓薄膜的板式和框式壓濾機(jī))，該方法可以把固液分離與機(jī)械脫水相結(jié)合，尤其是適于獲得所需的干物質(zhì)含量。
另外或者此外，通過(guò)加入增稠(或者干燥)劑可以增加微生物生物量的所需的干物質(zhì)含量。這些增稠劑是適當(dāng)?shù)馗稍锏?，?yōu)選的是不負(fù)面干擾化合物的抽提過(guò)程和/或沉淀。例如，增稠劑可以包含淀粉和/或植物纖維，如燕麥或者小麥的糠或者纖維素。甚至可以利用另一種生物量(具有更低的含水量)?？梢杂萌魏畏椒尤脒@些物質(zhì)，只要它能改進(jìn)可擠出性。
有時(shí)，例如在固液分離和/或機(jī)械脫水之后，可以形成大餅形式的生物量。這可能不適合于成粒(例如擠壓)。為了將生物量的大小減少至能夠成粒(例如有效的擠出機(jī)加料)的程度，可以將生物量進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆鬯?、揉捏?或混合。通過(guò)在高剪切混合器中(短時(shí)的)處理可以實(shí)現(xiàn)粉碎和/或揉捏。可有可無(wú)地，可以在這部分過(guò)程期間加入上述或者每一種增稠劑。
然后使處理(可選擇粉碎或者揉捏)后的生物量經(jīng)過(guò)成粒過(guò)程以產(chǎn)生粒狀顆粒?？梢砸砸恍┎煌姆椒ㄟM(jìn)行成粒。
減少含水量(或者增加干物質(zhì)含量)的另一種方法是利用鹽(例如鹽水)洗液洗滌生物量，或者(優(yōu)選地)在生物量與肉湯分離之后進(jìn)行處理，如利用洗滌過(guò)濾。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所需的顆粒結(jié)構(gòu)和大小由擠壓方法獲得。為了優(yōu)化干燥和/或抽提過(guò)程，顆粒特征(如結(jié)構(gòu)和大小)是重要的。在干燥步驟期間，如果顆粒太小那么它們可以產(chǎn)生問(wèn)題，因?yàn)樗鼈兛梢援a(chǎn)生粉末和細(xì)粉；而太大的顆粒是不流化的，并可以產(chǎn)生不良的干燥效率。在抽提期間，一個(gè)太小的粒度可以使得滲濾方法不能利用，因?yàn)榧佑谏锪看驳膲航堤?。太多的?xì)粉在爾后的純化步驟中可以產(chǎn)生問(wèn)題。太大的粒度可以在抽提期間阻止溶劑有效的進(jìn)入。此外，顆粒結(jié)構(gòu)應(yīng)該是足夠緊密的，以便在干燥和抽提期間阻止顆粒破碎，但是顆粒(干燥顆粒)優(yōu)選地具有一定的孔隙率，該孔隙率使得溶劑在抽提期間可以(有效的)進(jìn)入。
技術(shù)人員可以調(diào)整擠壓條件以便獲得具有所需結(jié)構(gòu)與大小的粒狀(生物量)顆粒。
可以調(diào)整擠壓條件以便使細(xì)胞的破裂最大限度地減少。最小限度的細(xì)胞破裂可以確保最適地保護(hù)不穩(wěn)定的、氧化敏感的化合物免受氧化誘導(dǎo)的降解。因此，優(yōu)選的是在低溫和沒(méi)有任何加熱手段的條件下實(shí)施擠壓。優(yōu)選的溫度范圍為大約20-30℃，如大約室溫下。在擠壓期間，粒狀顆?？梢蕴烊恍纬?，“擠出物”通過(guò)重力作用在自身重量下離開(kāi)壓出板，由此形成顆粒。然而，如果在由壓出板擠壓之后形成的生物量是如意大利面條一樣的自然長(zhǎng)條形式，那么可以將該面條切成所需大小的顆粒。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生物量的溫度影響擠壓產(chǎn)生的粒狀顆粒的性質(zhì)。優(yōu)選地，生物量在擠壓之前具有6-15℃的溫度。然而，當(dāng)在擠出機(jī)中時(shí)生物量的溫度可以升至10-60℃，雖然優(yōu)選的是15-30℃。溫度的上升將取決于施加在生物量上的壓力及其干物質(zhì)含量。
在擠壓期間，通常迫使生物量通過(guò)桶壓向壓出板，經(jīng)常以螺桿方式壓入。優(yōu)選的是不加熱該桶。事實(shí)上，冷卻該桶是有利的。合適地，冷卻劑(例如諸如水之類的水溶液)的溫度為1-4℃，如大約2℃。
一般地說(shuō)，擠壓不改變含水量。這是為什么在階段(b)的干物質(zhì)含量與在階段(a)的相同。然而，正如所將知道的，其它成粒技術(shù)(如稍后所描述的)確實(shí)改變含水量，并可以減少含水量(即增加干物質(zhì)含量)。對(duì)于包含如毛霉目(特別是產(chǎn)生PUFA的)的真菌的生物量，在階段(a)的生物量干物質(zhì)含量(通常將與在成粒(在擠壓成粒的情況下)產(chǎn)生的粒狀顆粒中的相同)合適地是在35-60％之間，優(yōu)選為50-60％。在干燥之后，干燥顆粒優(yōu)選地具有至少90％(如至少95％)的干物質(zhì)含量。
優(yōu)選的成粒技術(shù)是利用擠出機(jī)。W.Pietsch(“Size Enlargementby Agglomeration”:Wiley and Sons,1991，第385頁(yè))給出了關(guān)于擠出機(jī)的高質(zhì)量綜述。這類擠出機(jī)可以是分批或者連續(xù)擠出機(jī)。對(duì)于連續(xù)擠出機(jī)，可以是指簡(jiǎn)單的單螺桿擠出機(jī)(軸向和徑向輸送)。也有同向或者逆向旋轉(zhuǎn)的雙螺桿擠出機(jī)。輸送將要擠壓的生物量，使之部分地變得緊密，并將其壓過(guò)孔板(壓出板)。另一類擠出機(jī)包括造粒機(jī)。此時(shí)，一個(gè)圓柱狀的壓制工具滾動(dòng)在一層堆積在孔板上的材料上。
如果通過(guò)擠壓獲得顆粒，那么需要生物量具有可擠壓的形式。如果需要的話，可以調(diào)整含水量，這取決于生物量的條件、所使用的微生物以及擠壓條件。可以除去水，或者通過(guò)加入固體(例如淀粉)增加干物質(zhì)含量。以這種方法調(diào)整生物量至正確的稠度(這通常是糊狀物)。
雖然顆?？梢杂糜诨衔锏某樘?，但是它們也表示可以存儲(chǔ)的穩(wěn)定型生物量。顆?？梢跃哂衅渌猛纠纾鼈兛梢杂糜趮雰号浞降闹苽?，其中該生物量包含一種或多種多不飽和脂肪酸(PUFAs)。
本發(fā)明也正視其它能夠使(粒狀的)顆粒形成的成粒方法。例如，多級(jí)干燥方法可以包含噴霧干燥和流化床的結(jié)合并且也可以產(chǎn)生粒狀顆粒。
可以使用其它類型的成粒技術(shù)。一般地，成粒是通過(guò)增加或者減少粒度獲得粒狀形式的固體的方法。一般是使粒度增加。一篇關(guān)于可供使用的成粒方法的類型的高質(zhì)量綜述被描述在W.Pietsch,“SizeEnlargement by Agglomeration”(Wiley and Sons,1991，第385頁(yè))中。在這篇綜述中有許多不同的可供使用的成粒技術(shù)，這包括幾個(gè)將要描述的附聚方法。在這里，附聚產(chǎn)生相互粘附(附聚)的小顆粒以便形成較大顆粒(在這種情況下為粒狀顆粒)。因此，如果第一種技術(shù)產(chǎn)生太小的顆粒，那么可以使用附聚技術(shù)產(chǎn)生較大的(粒狀的)顆粒。
通常利用轉(zhuǎn)動(dòng)和/或旋轉(zhuǎn)鼓或者錐干燥器實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)動(dòng)附聚，該干燥器含有具粘合性質(zhì)(因此使顆粒粘合在一起)的粉。在某些情況下，可以混合額外加入的粘合劑?？梢杂蛇@一機(jī)理形成球形顆粒。
壓力附聚通常具有在大量顆粒狀物質(zhì)上施加高壓的特征。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)細(xì)粉或者“可塑性的”(無(wú)彈性的)材料使用這一方法。正常情況下，這一方法用于磨成粉末的材料。(然而它也用于干燥的酵母中產(chǎn)生一定稠度的捏塑體)?？梢园殉尚蔚念w粒干燥至便于最適存儲(chǔ)的合適干物質(zhì)含量。由活塞、滾轉(zhuǎn)機(jī)、均衡的和/或擠出機(jī)壓力可以實(shí)現(xiàn)壓力附聚。在以上所提及的Pietsch書中給出了關(guān)于這類設(shè)備的充分的描述。
擠壓壓力通常利用壁摩擦，這種摩擦對(duì)可塑性材料通過(guò)孔或者開(kāi)口端的壓出板的流動(dòng)產(chǎn)生了阻力。尤其是在其中發(fā)生廣泛的混合并應(yīng)用高剪切力的螺桿擠出機(jī)中。
一般來(lái)說(shuō)，可以直接附聚具有低熔點(diǎn)或者增塑溫度的材料。
其它附聚技術(shù)是可能的。例如，與流化床附聚機(jī)結(jié)合起來(lái)的噴霧干燥。首先可以在噴霧干燥器中通過(guò)噴管或者利用旋轉(zhuǎn)輪由霧化干燥生物量。使細(xì)的顆粒再循環(huán)至噴射部分。在流化床部分中進(jìn)一步附聚所產(chǎn)生的粘性粉。在某些情況下，粉的再潤(rùn)濕可以改善附聚方法。這里所描述的技術(shù)稱為多級(jí)干燥。
為了更詳細(xì)地描述多級(jí)干燥，首先噴霧干燥生物量。這可以產(chǎn)生細(xì)粉。噴霧干燥的溫度(進(jìn)氣溫度)通常為160-260℃和/或出氣溫度為75-90℃。此時(shí)，通過(guò)快速旋轉(zhuǎn)的輪盤或者產(chǎn)生小顆粒的噴管干燥生物量。然后在重力作用下，顆?？梢月湎驀婌F干燥塔的底部。在這里，可以提供可利用熱空氣進(jìn)行干燥(合適的為90-95℃)的流化床。這里，附聚可以發(fā)生，并且顆粒可以粘結(jié)在一起。隨后，使附聚的(粒狀的)顆粒受到干燥，例如在帶式干燥床或者輔助流化床上。在該過(guò)程開(kāi)始時(shí)，生物量可以具有低于30％的干物質(zhì)含量。在噴霧干燥之后，其干物質(zhì)含量可以增至75-90％，在附聚之后干物質(zhì)含量可以是90-95％。在干燥之后，干物質(zhì)含量可以增加為至少95％。
另一個(gè)技術(shù)是利用流化床附聚機(jī)。這里，可以用氣流流化粉末。在顆粒床中用水噴霧流體以便濕潤(rùn)粉和提高附聚能力。
一般來(lái)說(shuō)，所描述的附聚方法用于干燥的可以塑化的粉。一個(gè)例外是在多級(jí)干燥器上干燥。在干燥器之后與流化床結(jié)合起來(lái)的噴霧干燥適合于許多不同類型的生物量的附聚。然而，該方法并非總是適合于熱不穩(wěn)定產(chǎn)物或者對(duì)(熱)空氣氧化敏感的產(chǎn)物。一種產(chǎn)生粒狀的干燥生物量的好方法是擠壓機(jī)械脫水過(guò)的濾餅，而后進(jìn)行如流化床或者輔助流化床干燥一樣的合適干燥步驟。
通過(guò)再濕潤(rùn)(噴霧)干燥的產(chǎn)物而后進(jìn)行擠壓步驟和在如流化床干燥器中再干燥，可以實(shí)施(干燥的)生物量附聚的另一種方法?？梢詳D壓具有低熔點(diǎn)或者低增塑溫度(或者在具有高含量胞內(nèi)油的某些干燥生物量的情況下，其部分地熔化是由于擠出機(jī)中的力所致)的粉。在壓出板中形成合適的小球。
正如在以上的(c)中一樣，可以干燥(擠壓的或者以其它方式形成的)粒狀生物量，合適的是在使得顆粒仍然是完整的條件下。在成粒過(guò)程之后，一般認(rèn)為生物量的顆粒結(jié)構(gòu)和大小能夠使生物量得到有效的干燥?？梢岳酶鞣N干燥器(如帶式干燥器、真空或者真空帶式干燥器，流化或者輔助流化床干燥器)進(jìn)行干燥。技術(shù)人員可以在分批或者連續(xù)方法之間選擇。
在本發(fā)明的方法中，流化或者輔助流化床干燥器的利用是特別優(yōu)選的。用流化和輔助流化床干燥，床中的溫度可以調(diào)整至現(xiàn)值。這些值可以具有廣泛的范圍，例如35-120℃，如50-90℃，可以是也可以不是60-80℃。如果需要把不穩(wěn)定的化合物與生物量分離，那么容易把干燥過(guò)程的溫度調(diào)整為低溫范圍以減少氧化或者降解的風(fēng)險(xiǎn)。
二者擇一地，或者還可以使用真空干燥方法，例如進(jìn)行1至2小時(shí)。
干燥步驟可以顯示出幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，生物量顆粒(將要形成微粒)的干燥可以產(chǎn)生中間物質(zhì)，該中間物質(zhì)可以穩(wěn)定地存儲(chǔ)延長(zhǎng)的一段時(shí)間。這里，(比較)高的生物量干物質(zhì)含量可以阻止化合物的降解以便分離化合物與生物量。用這一方法，可以認(rèn)為干燥顆粒是化合物的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，該化合物存在于生物量之內(nèi)或者與生物量相聯(lián)系。
例如，該顆?？梢云鹱鳛槊傅妮d體的作用，由此通過(guò)在擠壓之前把適量的交聯(lián)劑(例如戊二醛)混入生物量來(lái)將酶固定在顆粒之內(nèi)。
此外，按照本發(fā)明制備的干燥顆粒實(shí)際上可以得到有利的利用，例如作為食品或者飼料組合物或者添加劑。
顆粒和/或微粒(例如通過(guò)擠壓產(chǎn)生的)可以具有下列的性質(zhì)。
顆粒可以具有巧克力糖果的形狀。(擠壓的)顆粒的直徑可以變化于0.1-12mm，如0.3至10mm。更優(yōu)選的是1.5-6mm，最適的(對(duì)于干燥時(shí)的抽提物)直徑為2至3mm。顆粒的長(zhǎng)度大約可以是直徑的2至5或者6倍。然后可以容易包裝它們，并用市售的提取器利用它們(以保證床的通透性)。通常地，大多數(shù)(即使不是所有)顆粒將具有相同的大小，事實(shí)上，人們可以獲得高度一致的或者均勻的顆粒，其中至少80％(如至少90％)的顆粒具有在所說(shuō)明的范圍之內(nèi)的特殊性質(zhì)。
第二個(gè)方面的組合物(顆粒)優(yōu)選地是自由流動(dòng)的。它們?cè)谛螤钌弦苍S是大致圓柱形的。通過(guò)利用擠壓可以得到這一形狀。然后顆?？梢跃哂信c用于擠壓的壓出板的孔差不多一樣大小(雖然顆粒直徑可以稍大一點(diǎn))的直徑。在這一過(guò)程期間，當(dāng)組合物從壓出板出來(lái)時(shí)可以自動(dòng)形成顆粒。在這種情況下，顆粒的長(zhǎng)度是變化的。然而，可以影響顆粒長(zhǎng)度，例如，如果人們利用一種如刀(例如一個(gè)或多個(gè)鄰近壓出板的旋轉(zhuǎn)刀片)的切割方法，那么大多數(shù)(即使不是所有)顆粒將具有基本一樣的長(zhǎng)度。這樣的顆粒的優(yōu)選長(zhǎng)度是至少2mm，如至少3mm。合適地，顆粒具有使它們可以“傾瀉而下”(使得它們可更容易地存儲(chǔ)和輸送)的大小與含水量。一般地說(shuō)，雖然大多數(shù)顆粒本質(zhì)上是細(xì)長(zhǎng)的，但是一些數(shù)顆可以是近似的球形。顆粒的優(yōu)選的脂質(zhì)含量是30-50％的重量百分比。
顆粒的堆積密度通常為400-1100kg/m3。
正如所討論的，顆粒優(yōu)選地是多孔的，以便使溶劑可以進(jìn)入要提取的化合物中。優(yōu)選地，顆粒具有空洞通道，并且這些通道可以伸展至和伸展入顆粒的中心。通道的數(shù)量可以使得以體積計(jì)40-60％(如45-55％，最適為大約50％)的顆粒是空洞(空氣)。就所涉及的通道來(lái)說(shuō)，它們的長(zhǎng)度可以是其平均直徑的10至20倍。一般地說(shuō)，在它們的組合物中顆粒是均勻的，其中本質(zhì)上顆粒外部和中心是相同的材料。這是與現(xiàn)有技術(shù)的酵母組合物相比而言，這些酵母組合物在外部可能是實(shí)的而在中間是空的。
可以將顆粒穩(wěn)定地存儲(chǔ)在最適于最終要提取的化合物的溫度下。
干燥顆粒的優(yōu)選的干物質(zhì)含量是大于80％，更優(yōu)選為至少85％，最優(yōu)選為至少90％，最適的范圍是93-97％。如果把可與水混溶的溶劑用于抽提，那么可以利用具有低干物質(zhì)含量的顆粒。
因此(干燥的)顆粒通常是多孔的以便用于抽提的溶劑易于進(jìn)入顆粒(的內(nèi)部)。因此，在擠壓和干燥期間可以減少粉末的含量(增加產(chǎn)率)，并且可以在抽提物蒸發(fā)之前避免(溶劑)抽提物的額外過(guò)濾。
顆粒的孔隙率取決于粒狀顆粒的(水或者)干物質(zhì)含量。在干燥時(shí)粒狀顆粒中的水分常常蒸發(fā)掉而留下(空洞)孔隙。干燥顆粒的孔隙率優(yōu)選為15至50％，如20至40％，最適為25至35％。稍后將描述孔隙率的測(cè)量方法(實(shí)施例25)。
優(yōu)選地，顆粒中的大多數(shù)(即使不是所有)細(xì)胞是完整的(也就是說(shuō)沒(méi)有破裂)。尤其是得自霉菌生物量的顆粒可以全部是生物量顆粒，這些顆粒具有0.3至10mm的直徑，優(yōu)選為0.7至5mm，可選擇地是1至3mm。一般地，顆粒將以所需的長(zhǎng)度自動(dòng)形成。否則可以將顆粒切成所需的長(zhǎng)度。如果通過(guò)擠壓成粒，那么擠出機(jī)的壓出板的孔的大小一般與顆粒的直徑相當(dāng)。
可有可無(wú)地，可以在成粒過(guò)程之前或者期間加入抗氧化劑。這些抗氧化劑可以包括生育酚和抗壞血酸棕櫚酸酯，例如以高達(dá)0.1％(重量百分比)的含量存在。
因此本發(fā)明可以提供生物量材料，該材料具有使化合物能夠得到有效成本的和有效的抽提的特征。然后純化、分離或者(優(yōu)選地)提取所存在的化合物。本發(fā)明的方法可以使?jié)B濾抽提方法得到利用。這一抽提方法所具有的優(yōu)點(diǎn)似乎是由于結(jié)構(gòu)和大小以及高干物質(zhì)含量所致。干燥的壓出物要求減少的溶劑量以便于由此產(chǎn)生的有價(jià)值的化合物的抽提。此外，對(duì)于壓出物形式的生物量，可以更好地和更有效地實(shí)施脫溶劑烘烤方法(即，使所利用的溶劑從生物量中釋放出來(lái))。
在脫溶劑烘烤過(guò)程之后獲得的壓出物殘?jiān)梢杂欣赜米鳛轱暳辖M分。
超過(guò)90至95％的壓出物干物質(zhì)含量使壓出物的穩(wěn)定存儲(chǔ)能夠進(jìn)行，而高于85％的干物質(zhì)含量可以在爾后的抽提過(guò)程中給出一種重要的優(yōu)點(diǎn)。
優(yōu)選地利用溶劑實(shí)施抽提。所使用的溶劑將取決于要提取的化合物，但是尤其是人們可能提及C1-10烷基酯(例如乙酸乙酯或者乙酸丁酯)、甲苯、C1-6乙醇(例如甲醇、丙醇)和C3-8烷烴(例如己烷)和/或超臨界流體(例如液態(tài)CO2或者超臨界丙烷)。按現(xiàn)有技術(shù)，溶劑直接使用在肉湯中的微生物上。然而，通過(guò)在顆粒上進(jìn)行抽提，人們可以極大地減少所需溶劑的量。在本申請(qǐng)人的一些實(shí)驗(yàn)中，只需要少20至30倍的溶劑就可以進(jìn)行抽提。這不僅節(jié)省大量費(fèi)用，因?yàn)橹焕煤苌俚娜軇?，而且它也最大限度地減少了排放問(wèn)題。通過(guò)利用顆粒，可供溶劑使用的表面積可以是極高的，因此人們可以獲得好的產(chǎn)量。
如果要提取的化合物是疏水的，那么優(yōu)選利用非極性溶劑。對(duì)于親水化合物，適合使用極性溶劑(如醇)。
可以利用各種技術(shù)進(jìn)行抽提。優(yōu)選的方法是利用濾器的滲濾抽提。這里，可以用干燥顆粒填滿柱子。然后加入溶劑(己烷)以便覆蓋顆粒。雖然溶劑可以一次穿過(guò)柱子和遍及干燥顆粒，但是優(yōu)選的是使溶劑循環(huán)(作為閉合或者開(kāi)放體系)。合適的是使溶劑循環(huán)三至七次，如大約五次，合適的是半小時(shí)至一個(gè)半小時(shí)的時(shí)間，如大約一小時(shí)。圖3顯示了合適的滲濾抽提器。在溶劑加入至包含干燥顆粒的濾過(guò)式浸出器之前，將溶劑保存在容器中。利用泵使溶劑循環(huán)。精濾器旨在于除去細(xì)粉。
可以使用其它濾過(guò)式浸出器。這些提取器可以具有逆流或者錯(cuò)流設(shè)計(jì)。在前者中，可以將干燥顆粒保存在分成各種扇形區(qū)的旋轉(zhuǎn)圓筒(如旋轉(zhuǎn)式行李輸送帶)中。沿一個(gè)方向使溶劑通過(guò)一個(gè)扇形區(qū)的顆粒，然后通過(guò)(優(yōu)選為沿相同的方向)另一個(gè)(如相鄰的)扇形區(qū)的顆粒。經(jīng)常將這些機(jī)器稱作旋轉(zhuǎn)式抽提器，其可由德國(guó)的Krupp提供。
用另一種技術(shù)，可以將顆粒放置在例如移動(dòng)的(如多孔的)帶或者運(yùn)輸器上，這些帶或者運(yùn)輸器沿大體上與溶劑傳送方向相反的方向移動(dòng)。這意味著用通過(guò)其它顆粒的溶劑提取新鮮的顆粒，以及把新鮮的溶劑運(yùn)用于已用溶劑提取過(guò)的顆粒。這一安排可以最大限度地提高效率。
在錯(cuò)流技術(shù)中以新鮮的溶劑部分抽提分批的顆粒。
通過(guò)把粒狀的顆?；蛘呶⒘Ｅc兩種或者多種微生物的混合物分離，本發(fā)明的方法也可以用來(lái)從不同的微生物中獲得兩種或者多種化合物的混合物。通過(guò)在發(fā)酵完成之后直接混合兩種或者多種不同微生物的發(fā)酵肉湯，或者通過(guò)在成粒(例如擠壓方法)之前立即混合得自兩種或者多種微生物的生物量，可以獲得微生物的混合物。在抽提方法之前混合兩種或者多種不同的微生物壓出物也是可能的。
因此按照本發(fā)明的優(yōu)選方法可以描述如下a)在使得微生物可以產(chǎn)生所需的化合物的條件下，在合適的培養(yǎng)基中發(fā)酵一種或多種微生物，該發(fā)酵過(guò)程可以產(chǎn)生(在周圍培養(yǎng)基中的微生物的)肉湯；b)如果必要，則沉淀或者固化化合物，如通過(guò)酸化作用；c)把肉湯中的微生物與培養(yǎng)基分離(通過(guò)如過(guò)濾的固/液分離可以達(dá)到這一目的)以便獲得生物量；d)對(duì)得自(a)的肉湯或者得自(c)的生物量進(jìn)行巴氏消毒；e)如果必要，增加生物量的干物質(zhì)含量，例如通過(guò)加入干物質(zhì)或者材料，或者通過(guò)減少含水量(例如用脫水或者干燥技術(shù))；f)粉碎和/或揉捏所產(chǎn)生的生物量(以及，可有可無(wú)地，通過(guò)加入一種或多種干燥物質(zhì)增加干物質(zhì)含量)；g)使生物量成粒以便產(chǎn)生粒狀顆粒，如通過(guò)擠壓；h)干燥粒狀顆粒以便產(chǎn)生干燥顆粒；以及i)提取一種或多種化合物，如通過(guò)利用合適的溶劑。
按照本發(fā)明分離的化合物可以具有高質(zhì)量，并且可以適合用于人或者動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)中。按照本發(fā)明分離的包含類脂類的多不飽和脂肪酸(PUFA)尤其適合于營(yíng)養(yǎng)目的，特別是適合于在嬰兒配方中摻入。
現(xiàn)在將通過(guò)例子(關(guān)于通過(guò)說(shuō)明提供的下列例子)描述本發(fā)明。這些例子伴隨著下列附圖，其中

圖1是溫度和干物質(zhì)(％)隨時(shí)間變化的圖，該圖顯示不同量的擠壓過(guò)的生物量在不同溫度下的干燥特性；圖2是油產(chǎn)率隨溫度變化的圖，該圖顯示在不同溫度下得自擠壓產(chǎn)生的生物量的油的產(chǎn)率；圖3是(已知的)滲濾抽提方法的流程圖；圖4是油產(chǎn)率隨時(shí)間變化的圖，該圖顯示提取的油量和提取時(shí)間之間的關(guān)系；以及圖5和6分別是按照本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)成粒的干燥顆粒的大小分布圖。
實(shí)施例1至6被孢霉屬的發(fā)酵肉湯的加工用標(biāo)準(zhǔn)Dieffenbach板式和框式壓濾機(jī)(布型nycot 2794)過(guò)濾160l已巴氏消毒(68℃下1小時(shí))(碼垛堆積生長(zhǎng))的高山被孢霉發(fā)酵肉湯。用1.0bar的最大施加壓力過(guò)濾肉湯。在20分鐘之內(nèi)在4.35m2的總過(guò)濾面積(其產(chǎn)生平均流速大約為110l/m2h的流動(dòng))上過(guò)濾160l肉湯。以大約3個(gè)濾餅的體積(≈150l)的生產(chǎn)用水洗滌濾餅。
回收大約30kg的大約25％干物質(zhì)含量的濕餅。使用三種類型的干燥方法。
真空干燥在24小時(shí)期間在真空(大約50mbar)盤架干燥器(大約1m2干燥表面)中在真空下在35℃下干燥10kg濾餅，產(chǎn)生大約2.5kg的大約94％干物質(zhì)含量的干燥生物量。干燥生物量由粉碎的生物量和一些大塊組成。真空干燥是消耗時(shí)間的，這可能是由于大塊的存在。
通風(fēng)盤架干燥器在通風(fēng)盤架干燥器(大約1m2干燥表面)中在35℃下在24小時(shí)期間在氮?dú)庀赂稍?0kg濾餅。回收總共為大約2.5kg的大約93％干物質(zhì)含量的干燥生物量。干燥生物量由粉碎的生物量和一些大塊組成。通風(fēng)盤架干燥是消耗時(shí)間的，這可能是由于大塊的存在。
流化床干燥器在大約200℃的進(jìn)氣溫度下在AEROMATIC(MP-1類型)的實(shí)驗(yàn)室型流化床干燥器中干燥5kg濾餅。出氣溫度為大約40℃。在大約45分鐘內(nèi)，使?jié)竦纳锪康玫礁稍锒a(chǎn)生大約1kg的大約81％干物質(zhì)含量的干燥生物量。
將由該最后方法回收的干燥材料用于在六個(gè)不同的溫度(此處的實(shí)施例1至6)下利用己烷提取油。在氮?dú)飧采w下用1500ml己烷(加熱至回流)抽提150g的干燥生物量90分鐘。過(guò)濾細(xì)胞群，并在真空下在rotavapor(循環(huán)蒸汽)中蒸發(fā)在產(chǎn)生的微膠粒中的溶劑。這產(chǎn)生了粗糙的PUFA油。結(jié)果顯示在表1中。在室溫下的抽提產(chǎn)生了較低的產(chǎn)量；在升高的溫度下可獲得更好的產(chǎn)量。
表1生物量中油的抽提
富含甘油三酯的油是一種淺黃色的油，并且包含一些固體物質(zhì)。
實(shí)施例7和比較實(shí)施例8被孢霉屬發(fā)酵肉湯的加工在大約0.5bar的壓差下在薄膜壓濾器(SCHULE)中過(guò)濾500l肉湯(已巴氏消毒過(guò)的，如上述例子所描述的)。以10個(gè)餅的體積的生產(chǎn)用水洗滌濾餅，而后在30分鐘期間在5.5bar下擠壓濾餅。所產(chǎn)生的餅具有大約46％的干物質(zhì)含量。在中試(pilot)擠出機(jī)(ODEKERKE,50mm的直徑桶，壓型桶)中擠壓以這一方法回收的餅。壓出板有10個(gè)孔，每個(gè)孔的直徑為1.6mm。在大約45分鐘內(nèi)擠壓出總計(jì)為19kg的濾餅。
在中試工廠流化床干燥器(T4 AEROMATIC 0.26m2干燥表面)中干燥以這一方法回收的壓出物。在65℃下在大約45分鐘內(nèi)干燥壓出物，產(chǎn)生大約85％的干物質(zhì)含量(實(shí)施例7)。
在相同實(shí)驗(yàn)期間，一些濾餅沒(méi)有得到擠壓(比較實(shí)施例8)，并使之在40℃下在真空盤架干燥器中干燥。干燥十分消耗時(shí)間的，因?yàn)榇髩K的存在。
利用己烷抽提上述兩種材料。發(fā)現(xiàn)這些材料具有下列特征干燥壓出物 主要是小球(實(shí)施例7) 相當(dāng)容易的抽提方法真空干燥的生物量小球和塊，許多細(xì)粉(比較實(shí)施例8)困難的抽提方法；不良的過(guò)濾性質(zhì)實(shí)施例9和10利用下列擠出機(jī)進(jìn)行利用與實(shí)施例7相同的肉湯的擠壓實(shí)驗(yàn)LALESSE(Arnhem，荷蘭)在實(shí)施例9中利用LALESSE單螺桿通用擠出機(jī)。這種類型的擠出機(jī)通常用于小吃食品的生產(chǎn)。首先將磨過(guò)的玉米(干物質(zhì)含量為大約95％)作為試驗(yàn)材料來(lái)供料，并在一定壓力和加熱條件下擠壓玉米；一次性從壓出板膨脹壓出壓出物。
這類擠出機(jī)的桶是一種壓型桶以便轉(zhuǎn)運(yùn)處理過(guò)的玉米。用于擠壓的螺桿的類型取決于所處理的材料的類型。螺桿是通用的直徑為48mm的轉(zhuǎn)運(yùn)螺桿或者壓縮螺桿。LALESSE機(jī)器是7.5Kw中試機(jī)器(以額定功率驅(qū)動(dòng))。所需的機(jī)器總功率是12.1Kw?？梢约訜峄蛘咚鋮s擠出機(jī)的桶。在生物量的擠壓期間利用具有1至多達(dá)4個(gè)孔的和1.8、2.0和2.2mm直徑的壓出板。
產(chǎn)生被孢霉屬生物量(冷卻的桶)的能力是大約40kg/h。在擠壓過(guò)程中，壓出板中的孔的長(zhǎng)/直徑(L/D)比是變化的。
ALMEX(Zutphen，荷蘭)在實(shí)施例10中，利用實(shí)施例7的被孢霉屬生物量，利用ALMEX公司的膨脹擠出機(jī)。這類擠出機(jī)用于生產(chǎn)寵物食品。它具有平滑的帶栓的桶，這些栓使得生物量的轉(zhuǎn)運(yùn)能夠進(jìn)行。這些栓具有與在LALESSE擠出機(jī)的桶中的側(cè)面相同的作用。膨脹擠出機(jī)的螺桿是一個(gè)調(diào)制螺桿。技術(shù)數(shù)據(jù)ALMEX Contivar 150L/D為10(螺桿的長(zhǎng)度和直徑的比)最大螺桿速度為180rpm22Kw(以額定功率驅(qū)動(dòng))螺桿直徑為150mm用自來(lái)水冷卻壓出板3個(gè)圓環(huán)形孔，每孔直徑為1.8mm在加工期間將生物量的溫度升至大約25℃。機(jī)器的生產(chǎn)能力是每小時(shí)大約250kg被孢霉屬壓出物。
比較實(shí)施例11以不同方法實(shí)現(xiàn)的固/液分離的比較潷析器在‘FLOTTWEG’潷析器(Z 23-3/441型)中潷析得自高山被孢霉的發(fā)酵的350l肉湯。速度設(shè)置為大約4000rpm。在操作期間差速度范圍變化于7.5-20rpm。
進(jìn)料速度設(shè)置為400l/h。不洗滌生物量。潷析總計(jì)為350l的肉湯。進(jìn)料的溫度是8℃，上清液的溫度為15℃。所回收的生物量的干物質(zhì)含量是大約25％。
潷析器+真空鼓式過(guò)濾機(jī)在5001生產(chǎn)用水(其中溶解有10kg NaCl)中懸浮20kg的干物質(zhì)含量為25％的生物量(得自上述潷析實(shí)驗(yàn))。在具有帶式卸料的真空鼓式過(guò)濾機(jī)(PAXMAN，布型865.912K/5 polyprop)上過(guò)濾所產(chǎn)生的漿液，而無(wú)需進(jìn)一步洗滌。轉(zhuǎn)鼓的速度設(shè)置為1rpm，并且壓差設(shè)置為600mbar的最大值。在15分鐘之內(nèi)過(guò)濾出總計(jì)400l的肉湯。濾面凈面積是大約0.3m2，這產(chǎn)生了5000l/m2h(濾面)的平均流速。過(guò)濾速度是很好的，但是“餅的成型”是相當(dāng)差的。所回收的過(guò)濾過(guò)的生物量的干物質(zhì)含量是大約35％。
板式和框式壓濾機(jī)在板式和框式壓濾機(jī)(標(biāo)準(zhǔn)的R&B，布型nycot 2794)中過(guò)濾5001肉湯。以0.3bar的壓差過(guò)濾肉湯。在5m2的總過(guò)濾面積上在35分鐘之內(nèi)過(guò)濾出5001肉湯，這產(chǎn)生了+175l/m2h的平均流速。以大約2.5個(gè)濾餅的體積的生產(chǎn)用水洗滌濾餅30分鐘，這產(chǎn)生了400l/m2h的平均流速。
用30分鐘以空氣吹干濾餅，這產(chǎn)生了大約25％的所回收的生物量的干物質(zhì)含量。
薄膜壓濾機(jī)在薄膜壓濾機(jī)(SCHULE，布型propex 46K2)中過(guò)濾7001肉湯。以0.3bar的壓差過(guò)濾肉湯。在6.8m2的總過(guò)濾面積上在30分鐘之內(nèi)過(guò)濾出7001肉湯，這產(chǎn)生了大約205l/m2h的平均流速。
以3個(gè)濾餅的體積(≈300l)的生產(chǎn)用水洗滌濾餅7分鐘，這產(chǎn)生了375l/m2h的平均流速。
相比于板式和框式壓濾機(jī)，薄膜壓濾機(jī)的優(yōu)點(diǎn)是過(guò)濾之后的餅可以在高壓下擠壓，因此餅的干物質(zhì)含量將增加。在30分鐘期間以5.5bar擠壓濾餅，這產(chǎn)生了大約45％的所回收的生物量的干物質(zhì)含量。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在薄膜壓濾機(jī)(SCHULE，布型propex 46K2)中過(guò)濾11001肉湯。以0.3bar的壓差過(guò)濾肉湯。在12.3m2的總過(guò)濾面積上在45分鐘之內(nèi)過(guò)濾出1100 1肉湯，這產(chǎn)生了大約120l/m2h的平均流速。以3個(gè)濾餅的體積(≈600l)的1％NaCl溶液洗滌濾餅18分鐘，這產(chǎn)生了162l/m2h的平均流速。
在30分鐘期問(wèn)在6bar下擠壓濾餅，這產(chǎn)生了大約55％的所回收的濾餅的干物質(zhì)含量。
濾餅的擠壓以及洗滌(用1％鹽溶液)對(duì)濾餅的干物質(zhì)含量有極大的影響。
實(shí)施例12不同干物質(zhì)含量的生物量的擠壓對(duì)不同干物質(zhì)含量的生物量進(jìn)行擠壓，該生物量由實(shí)施例7中提出的方法獲得(參見(jiàn)表2)。利用具有壓型桶和通用螺桿的單螺桿擠出機(jī)實(shí)現(xiàn)擠壓。用于擠壓的壓出板具有不同數(shù)量的孔，并且孔的直徑在2mm的范圍內(nèi)。
在擠壓之后獲得的顆粒的直徑是大約2mm。
效率和壓出物的質(zhì)量取決于用于擠壓的生物量的干物質(zhì)百分含量。雖然25％的干物質(zhì)產(chǎn)生最差的結(jié)果，但是對(duì)于其它微生物來(lái)說(shuō)，這樣一種低干物質(zhì)含量是可以接受的。
表2不同干物質(zhì)含量的生物量的擠壓實(shí)驗(yàn)的結(jié)果<
>實(shí)施例13和14以及比較實(shí)施例15常規(guī)的以及擠壓的高山被孢霉的生物量的干燥真空干燥在真空盤架干燥器中干燥以常規(guī)方法回收的生物量(比較實(shí)施例15，不擠壓)，但是在40℃下用了大約50小時(shí)。這一干燥過(guò)程是十分緩慢的，因?yàn)榇髩K的存在。用這一方法干燥的生物量的干物質(zhì)含量是大約92.5％。
為了比較，在循環(huán)蒸汽中在實(shí)驗(yàn)室型干燥器上干燥大約20g具有55％干物質(zhì)含量的壓出物(得自實(shí)施例11，顆粒直徑為2mm)。水浴的溫度是68℃，施加的壓力為40mbar。除干燥生物量粘貼到壁上和滲出少量油以外，干燥的效率是合理的。干燥之后的干物質(zhì)含量是92.3％。
流化床干燥在實(shí)施例13中在不同溫度下對(duì)生物量(實(shí)施例1)進(jìn)行干燥。當(dāng)沒(méi)有對(duì)生物量進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，不能完全干燥大塊的生物量。在這種情況下，就顆粒大小來(lái)說(shuō)干燥生物量是十分不均勻的。
如果在干燥之前由擠壓來(lái)預(yù)處理生物量，那么將極大地提高干燥效率。在這種情況下，干燥生物量的顆粒大小是更一致的。
這些結(jié)果的結(jié)論是可以對(duì)以不同形式分離得到的生物量進(jìn)行流化床干燥，但是利用壓出物可以改善干燥。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例14)中，用空氣(8000Nm3/m2h)在流化床干燥器中對(duì)不同數(shù)量(15和30kg)的壓出物進(jìn)行干燥。在干燥期間，取樣并計(jì)算干物質(zhì)含量。在圖1中顯示了(兩個(gè))不同數(shù)量的干物質(zhì)含量和溫度之間的關(guān)系。
床溫設(shè)置為80℃。擠壓所得的生物量的直徑是1.3mm。擠壓的生物量在干燥之后的干物質(zhì)含量是大約96％。
實(shí)施例16高山被孢霉的干燥壓出物的脂質(zhì)的抽提在不同溫度下的干燥壓出物的攪拌抽提以500ml己烷或者500ml丙醇-2，(對(duì)于己烷)在20℃、35℃和50℃溫度下，(對(duì)于丙醇-2)在20℃、40℃和70℃溫度下，在3小時(shí)期間提取100g干燥壓出物(干物質(zhì)含量分別為93.4％和97.8％)的樣品。在“四頸”圓底燒瓶中用兩葉片攪拌器攪拌漿液，并用加熱罩加熱該漿液。最后借助于回流冷卻器再循環(huán)蒸發(fā)的己烷或者丙醇-2。
在抽提期間，在攪拌器停止以及顆粒已經(jīng)沉降之后每30分鐘從燒瓶中取15ml上清液樣品。用移液管吸移1ml樣品至預(yù)稱重的2ml的微量離心管中。在40℃下在真空下干燥一夜之后稱重微量離心管，并計(jì)算總油量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。
已烷抽提的結(jié)論-溫度對(duì)可以提取的脂質(zhì)的總量沒(méi)有影響，即相對(duì)較低的提取溫度產(chǎn)生好的脂質(zhì)產(chǎn)量，-溫度只對(duì)提取全部脂質(zhì)所花費(fèi)的時(shí)間有小的影響，-在20℃以上的溫度下在30分鐘內(nèi)可用5體積己烷從生物量中提取全部脂質(zhì)。
丙醇-2抽提的結(jié)論-溫度對(duì)可以提取的脂質(zhì)的總量有極大的影響，-溫度對(duì)提取全部脂質(zhì)所花費(fèi)的時(shí)間有極大影響，-在73℃下在2小時(shí)內(nèi)可用5體積丙醇-2從生物量中提取全部脂質(zhì)。
油的組成取決于用于抽提的溶劑(參見(jiàn)表3)。提取溶劑的極性越強(qiáng)，就能抽提越多的磷脂。可以選擇溶劑的極性以便優(yōu)化油的組成。
表3利用兩種不同的溶劑在室溫下對(duì)干燥的被孢霉屬生物量的抽提
通過(guò)微膠粒的過(guò)濾大規(guī)模地觀察到問(wèn)題，這是由于壓出物因抽提過(guò)程期間的高攪拌器速度而破碎成為小顆粒所致。
利用滲濾抽提替代攪拌抽提可避免這些問(wèn)題。
利用己烷的干燥壓出物的滲濾抽提在中試規(guī)模上實(shí)現(xiàn)幾個(gè)滲濾抽提過(guò)程(參見(jiàn)該方法的流程3)。在20℃下以己烷(初始的己烷/生物量比率為4.4l/kg)提取大約40-45kg的干燥的擠壓的生物量。齒輪泵的流速設(shè)置為1.5m3/h。在大約0.1bar的存儲(chǔ)容器上有少量氮清洗。
在4小時(shí)期間實(shí)現(xiàn)抽提(在抽提期間溫度從18℃升至25℃)。每30分鐘從微膠粒中取一次樣品。在真空(大約50mbar)下在20分鐘期間在循環(huán)蒸汽中在實(shí)驗(yàn)室型儀器中使每種樣品蒸發(fā)100ml(水浴溫度為64℃)。估算油量。結(jié)果顯示在圖4中?？梢宰⒁獾皆?小時(shí)之后達(dá)到一種“平衡”。然后，以大約0.6床體積的己烷洗滌所提取的生物量。在抽提期間床的高度不發(fā)生變化。
在蒸發(fā)之前精過(guò)濾微膠粒。在抽提期間我們注意到微膠粒變得越來(lái)越清晰，這是由于在顆粒的床上的深度過(guò)濾所致。
實(shí)施例17和比較實(shí)施例18三孢布拉霉的β-胡蘿卜素油的回收利用實(shí)驗(yàn)室過(guò)濾設(shè)備收獲10l預(yù)先巴氏消毒(15分鐘，75℃)的三孢布拉霉菌的發(fā)酵肉湯。為了提高肉湯的過(guò)濾本領(lǐng)，加入CaCl2(5g/l的終濃度)。利用典型的水果榨汁機(jī)(柑橘榨汁機(jī)，HAFICO D.G.M)，在實(shí)驗(yàn)室中使以這一方法回收的生物量機(jī)械脫水(擠壓)至45％的干物質(zhì)含量。借助于裝備有壓出板(有4個(gè)孔，每孔直徑為1.8mm)的不銹鋼注射器擠壓以這一方法回收的餅。在實(shí)驗(yàn)室流化床干燥器中干燥產(chǎn)生的壓出物(空氣溫度為40℃，干燥時(shí)間為90分鐘，氣流速度為150Nm3/h,AEROMATIC MP-1)。以這一方法干燥的生物量的干物質(zhì)含量是大約95％。
以乙酸乙酯(初始體積/生物量的比率為30l/kg)利用滲濾抽提提取大約50g的干燥壓出物的樣品。在50℃下的2小時(shí)抽提之后，借助于真空抽濾收獲抽提物。以1個(gè)床體積的乙酸乙酯洗滌生物量。在蒸發(fā)之前用軟化水(抽提物/水的比率為5v/v)將以這一方法回收的抽提物洗滌兩次。在50℃(水浴溫度)下蒸發(fā)乙酸乙酯直到達(dá)到8gβ-胡蘿卜素/l的濃度。
借助于可控制的結(jié)晶和爾后的過(guò)濾，從濃縮液中回收β-胡蘿卜素晶體。
用得到混和和干燥的以及沒(méi)有擠壓過(guò)(實(shí)施例18)的生物量實(shí)現(xiàn)相同的實(shí)驗(yàn)。在混合的干燥生物量的抽提之后，與干燥壓出物相比其過(guò)濾本領(lǐng)較差。
實(shí)施例19和比較實(shí)施例20TAPS與畢赤酵母屬酵母的干燥壓出物的分離10分鐘期間用5000rpm的離心收獲來(lái)源于2l的沒(méi)有巴氏消毒過(guò)的Pichia ciferrii酵母發(fā)酵肉湯的生物量。用包含5％NaCl的鹽溶液洗滌固相濾餅。在實(shí)驗(yàn)室中利用典型的水果榨汁機(jī)(HAFICO,D.G.M)使以這一方法回收的具有33％干物質(zhì)含量的生物量機(jī)械脫水。在一分鐘期間以200kg/cm2使餅脫水。
干物質(zhì)含量已增加至47％。借助于單螺桿實(shí)驗(yàn)室擠出機(jī)(利用通用螺桿和壓型桶)擠壓脫水的餅(實(shí)施例19)。壓出板中的孔的直徑是2mm。在40℃下在40小時(shí)期間在真空下干燥所產(chǎn)生的壓出物，結(jié)果產(chǎn)生大約92％的干物質(zhì)含量。在50℃下在6.5小時(shí)期間用乙酸乙酯(生物量/溶劑的比率為1∶5(w/v))提取25克干燥的壓出物。
在真空(250mbar)下在50℃下蒸發(fā)以這一方法回收的抽提物，結(jié)果產(chǎn)生TABS油(大約60％四乙?；参锴拾贝?l油)。
包含TABS的Pichia ciferrii的噴霧干燥(比較實(shí)施例20)在180℃(進(jìn)氣溫度)和110℃(出氣溫度)的空氣溫度下，在Buchi190實(shí)驗(yàn)室噴霧干燥器中噴霧干燥大約1kg的Pichia ciferrii肉湯。在噴霧干燥的加料期間連續(xù)不斷地?cái)嚢枞鉁Ｒ?.2l/h將肉湯加料于干燥器中。在噴霧干燥產(chǎn)物中分析初始量TAPS的TAPS濃度。在噴霧干燥產(chǎn)物中僅有13％的TAPS得到回收。由于高溫使TAPS降解。由于其高的處理溫度所以不能選擇這一方法用于TAPS的分離。
實(shí)施例21從Crypthecodinium的DHA油的回收利用BECKMAMN JM/6E型的實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)收獲來(lái)源于7l的藻類Crypthecodinium cohnii發(fā)酵肉湯(預(yù)先在65℃下巴氏消毒過(guò)1小時(shí))的生物量。在2分鐘期間以800ml的份量以5000rpm離心肉湯，結(jié)果產(chǎn)生清晰的上清液。
回收總計(jì)為224g的干物質(zhì)含量為13％的生物量。這意味著在發(fā)酵肉湯的收獲物中的生物量濃度為大約4g/kg。為了回收這一生物量，加入300g淀粉(ROQUETTE，批號(hào)10EV0024)的)以便增加干物質(zhì)含量。借助于單螺桿實(shí)驗(yàn)室擠出機(jī)(利用通用螺桿和壓型桶)擠壓以這一方法回收的餅。壓出板中的孔的直徑是2mm，壓出板的厚度是6mm，結(jié)果使壓出板的L/D為3。在50℃下在真空下使所產(chǎn)生的光滑的壓出物干燥一夜，結(jié)果產(chǎn)生有小裂縫的干燥壓出物。以這一方法干燥的生物量的干物質(zhì)含量是大約94％。
以己烷(初始的體積/生物量比率為5l/kg)提取大約180g的干燥壓出物的樣品。在3小時(shí)的抽提之后在60℃下在Whatman濾器上過(guò)濾微膠粒。以1000ml新鮮己烷一次性洗滌所提取的生物量。在68℃(水浴溫度)下蒸發(fā)以這一方法回收的過(guò)濾微膠粒。用這一方法回收粗糙的包含DHA的油。油中的DHA的濃度是32.6％(由GC分析得到)。以這一方法回收的油包含大約67％的甘油三酯、12％的甘油二酯、3.7％的甾醇以及大約0.2％的消泡劑(NMR)。該油的另一特征是類胡蘿卜素的水平(0.15mg/mlβ-胡蘿卜素以及5mg/mlγ-胡蘿卜素)。
實(shí)施例22丙酸桿菌種(Propionibacterium sp.)的維生素B12的回收借助于BRPX-213-SGV型(ALFA LAVAL,3-7噸/小時(shí))的澄清器在大約5000的G-因子下，收獲來(lái)源于丙酸桿菌種(28噸)的大量發(fā)酵的肉湯。借助于超濾利用ABCOR KOCH模塊利用具有5kD截?cái)嘀?HFK131-VSV型)的150m2螺旋形聚乙烯砜薄膜，使以這一方法澄清的肉湯濃縮2.5倍。用生產(chǎn)用水將所產(chǎn)生的超濾濾液滲濾為500％(按照濃縮體積)。借助于真空蒸發(fā)使所產(chǎn)生的滲濾濾液濃縮3倍，使所產(chǎn)生的濃縮液在90℃下熱震蕩2分鐘。
使所產(chǎn)生的濃縮物成粒并在NIRO250多級(jí)干燥器(流化床噴霧干燥器/附聚機(jī))中使之干燥。干燥器的進(jìn)氣溫度為大約250℃，出氣溫度為大約70℃。所施加的空氣流速為大約3000m3/h。這產(chǎn)生了大約70-80℃的產(chǎn)物溫度。供給干燥器的濃縮物的密度是大約1050kg/m3。
將大約2g的干燥顆粒的樣品用于抽提，該抽提利用125ml的大約75％的乙醇(該含水量產(chǎn)生最適的抽提/技術(shù)性能)在錐形瓶中借助于攪拌在60分鐘期間在環(huán)境溫度(清晰的抽提物)下進(jìn)行。在抽提之后，利用Whatman紙濾器過(guò)濾所提取的生物量(容易的過(guò)濾)。分析發(fā)現(xiàn)以這一方法回收的清晰的粉紅濾液是維生素B12。以25ml的大約75％的乙醇洗滌所產(chǎn)生的生物量。用這一方法可從粒狀的生物量中提取大約90％的維生素B12(表4)。
表4與來(lái)源于多級(jí)附聚的丙酸桿菌的維生素B12的抽提有關(guān)的數(shù)據(jù)
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實(shí)施例23Crypthecodinium cohnii和高山被孢霉的共擠壓把101高山被孢霉菌的發(fā)酵肉湯與10 I Crypthecodinium cohnuii的發(fā)酵肉湯混合在一起。為了提高混合的肉湯的過(guò)濾本領(lǐng)，加入CaCl，(5g/l的終濃度)。過(guò)濾混合的肉湯，并利用典型的水果榨汁機(jī)(柑橘榨汁機(jī)，HAFICO)使所產(chǎn)生的餅機(jī)械脫水。
借助于單螺桿實(shí)驗(yàn)室擠出機(jī)利用在壓型桶中的通用傳輸螺桿和一個(gè)2mm孔的壓出板擠壓以這一方法回收的餅。壓出物的直徑是大約2mm。在實(shí)驗(yàn)室流化床干燥器(氣溫為40℃，干燥時(shí)間為大約一小時(shí)，氣流速度為150Nm3/h,AEROMATIC MP-1)中干燥以這一方法回收的壓出物。以這一方法干燥的生物量的干物質(zhì)含量是大約92％。
將大約100g的干燥壓出物的樣品用于利用己烷(初始的體積/生物量比為4l/kg)的抽提。在環(huán)境溫度下抽提2小時(shí)之后，借助于真空抽濾回收微膠粒。以4體積新鮮的己烷(初始的體積/生物量比為4l/kg)洗滌余下的提取過(guò)的壓出物。將洗滌過(guò)的己烷與微膠?；旌?，并在50℃(水浴溫度)下蒸發(fā)所產(chǎn)生的微膠粒。用這一方法回收粗糙的PUFA油，該油包含ARA(C20:4ω6)和DHA(C22:6ω3)。
可以通常用于精煉食用油/植物油的方法精煉粗糙的油。
實(shí)施例24土曲霉的粗糙的洛伐他汀的回收用硫酸將7.5l土曲霉的(沒(méi)有巴氏消毒過(guò)的)發(fā)酵肉湯(每千克肉湯包含2g洛伐他汀)的pH調(diào)整為pH2.1，以便沉淀洛伐他汀，并在這一pH下攪拌該肉湯15分鐘。其后過(guò)濾肉湯，并丟棄濾液(僅僅包含存在在肉湯中的洛伐他汀總量的3.5％)。
利用典型的水果榨汁機(jī)(柑橘榨汁機(jī)，HAFICO)使?jié)駷V餅(230g,18.5％干物質(zhì))機(jī)械脫水至干物質(zhì)含量為45％，其后借助于裝備有壓出板(包含四個(gè)孔，每孔直徑為1.8mm)的不銹鋼注射器擠壓該濾餅。在真空烘箱中在40℃下歷時(shí)一夜使所產(chǎn)生的壓出物干燥至大約95％的干物質(zhì)含量。在環(huán)境溫度下在15分鐘期間用1l甲苯(0.85L)和丙酮(0.15L)混合物提取10g干燥壓出物。在壓出物由過(guò)濾分離之后，獲得洛伐他汀含量為1.5g/l的包含洛伐他汀的抽提物。
實(shí)施例25市售的FERMIPAN的麥角固醇的回收FERMIPAN是由Gist brocades生產(chǎn)的市售的干燥酵母。在環(huán)境溫度下在30分鐘期間借助于100ml的70％的乙醇提取大約2克的FERMIPAN樣品(批號(hào)9510702)。借助于過(guò)濾把所產(chǎn)生的清晰的抽提物與提取出來(lái)的FERMIPAN分離。借助于NMR分析以這一方法回收的清晰濾液。在大約22g的抽提物中發(fā)現(xiàn)0.09mg麥角固醇。在麥角固醇的抽提中重要的是乙醇中的含水量。這一濃度并不是最適的。上述實(shí)驗(yàn)是一個(gè)指示性實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)顯示了有價(jià)值的化合物麥角固醇從粒狀的(擠壓過(guò)的干燥酵母)酵母中的抽提。
實(shí)施例25粒狀的/擠壓的生物量的優(yōu)點(diǎn)按照在實(shí)施例1中所描述的方法(過(guò)濾、擠壓和干燥)處理PUFA生物量。
用2000孔度計(jì)(Pharmitalia Carlo Erba，意大利)和一個(gè)(CarloErba)大孔(macroporse)單位120測(cè)量干燥的擠壓過(guò)的PUFA生物量的孔隙率。結(jié)果如表5所示。
孔量分布顯示在圖5中。作為比較，圖6給出了干燥酵母(FERMIPAN,Gist-brocades)的孔量分布。
線(用左邊的Y軸)顯示累積的孔量，直方圖(用右邊的Y軸)是相對(duì)有差別的孔量的分布。這表明大多數(shù)孔隙出現(xiàn)在10,000-100,000nm孔隙直徑的區(qū)域中。
表5相同PUFA擠壓的干燥的生物量的孔隙率測(cè)量(汞孔隙率方法)的結(jié)果
用錯(cuò)流滲濾抽提方法在環(huán)境溫度(20℃)下借助于己烷在柱中抽提81g的干燥的擠壓的PUFA生物量，以便獲得PUFA油。使十三個(gè)床體積的新鮮己烷(一個(gè)床體積是淹沒(méi)整個(gè)床所需要的己烷的數(shù)量)流過(guò)生物量的床。在己烷蒸發(fā)之后，測(cè)定在流過(guò)的每床體積的己烷中的原油重量。
抽提的條件-生物量床的顆粒內(nèi)部體積是80ml(=1個(gè)床體積)。
-流速為每300秒1個(gè)床體積。
-以一個(gè)床體積在300秒內(nèi)可提取全部油的50％。
-干燥生物量的堆積密度是570kg/m3。
-顆粒直徑是0.0025m。
-抽提溫度為20℃。
-油在己烷中的溶解能力是無(wú)限的。
-生物量的含油量為35.5w/w(％)。
在真空條件下在60℃(水浴溫度)下在實(shí)驗(yàn)室條件下在循環(huán)蒸汽中蒸發(fā)己烷，從而產(chǎn)生PUFA。所描述的PUFA顆粒(干燥的壓出物)是多孔的均勻顆粒，這對(duì)于抽提是理想的。有大的表面積可供油的交換使用。因此，擴(kuò)散對(duì)抽提的限制是小的。
比較實(shí)施例26現(xiàn)在將在下列的表中給出用來(lái)獲得生物量和肉湯(在上述實(shí)施例中描述的)的各種培養(yǎng)條件。
表(續(xù))
表(續(xù))
<p>表(續(xù))
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權(quán)利要求
1．一種把一種或多種化合物與微生物生物量分離的方法，該微生物生物量包含已產(chǎn)生這樣的化合物的微生物，該方法包括a)提供或者獲得干物質(zhì)含量為25至80％的生物量；b)使所說(shuō)生物量粒化成為平均干物質(zhì)含量為25至80％的粒狀顆粒；c)干燥所說(shuō)粒狀顆粒從而形成平均干物質(zhì)含量至少為80％的干燥顆粒；以及d)從得自(c)的干燥顆粒中純化、提取或者分離上述或者每種化合物。
2．按照權(quán)利要求1或者2的方法，其中在(b)中的制粒過(guò)程是通過(guò)擠壓所說(shuō)的生物量實(shí)施的。
3．按照權(quán)利要求2的方法，其中在成粒之前使所說(shuō)生物量得到粉碎或者揉捏。
4．按照上述權(quán)利要求之任一的方法，其中通過(guò)對(duì)發(fā)酵肉湯進(jìn)行固/液分離來(lái)獲得(a)中的生物量。
5．按照權(quán)利要求4的方法，其中使上述固/液分離與機(jī)械脫水相結(jié)合。
6．按照上述權(quán)利要求之任一的方法，其中在(a)中干物質(zhì)含量為25至80％的生物量是通過(guò)以下方法獲得的ⅰ)在所說(shuō)生物量中加入固相物質(zhì)；或者ⅱ)使所說(shuō)生物量脫水。
7．按照上述權(quán)利要求之任一的方法，其中通過(guò)流化床或者輔助流化床干燥或者真空干燥對(duì)(c)中的粒狀生物量進(jìn)行干燥，使其干物質(zhì)含量至少為80％。
8．按照上述權(quán)利要求之任一的方法，其中所說(shuō)生物量包含或者來(lái)源于真菌。
9．按照權(quán)利要求8的方法，其中所說(shuō)真菌屬于毛霉目。
10．按照權(quán)利要求9的方法，其中所說(shuō)真菌屬于被孢霉屬。
11．按照權(quán)利要求8至10之任一的方法，其中所說(shuō)真菌是高山被孢霉。
12．按照權(quán)利要求1至6之任一的方法，其中所說(shuō)生物量包含或者來(lái)源于藻類。
13．按照權(quán)利要求12的方法，其中所說(shuō)藻類是甲藻和/或?qū)儆贑rypthecodinium屬。
14．按照權(quán)利要求12至13之任一的方法，其中所說(shuō)藻類是Crypthecodinium cohnii。
15．按照上述權(quán)利要求之任一的方法，其中所說(shuō)化合物是可有可無(wú)地包含在脂質(zhì)中的多不飽和脂肪酸(PUFA)。
16．按照權(quán)利要求15的方法，其中所說(shuō)多不飽和脂肪酸是C18、C20或者C22ω-3或者C18、C20或者C22ω-6多不飽和脂肪酸。
17．按照權(quán)利要求16的方法，其中所說(shuō)化合物是C20或C22ω-3或者C20或C22ω-6多不飽和脂肪酸。
18．按照上述權(quán)利要求之任一的方法，其中所說(shuō)化合物是花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)。
19．按照權(quán)利要求8的方法，其中所說(shuō)真菌屬于須霉屬、布拉霉屬或者曲霉屬。
20．按照權(quán)利要求1至13之任一的方法，其中所說(shuō)化合物是類胡蘿卜素或者HMG-CoA還原酶抑制劑(例如洛伐他汀、普伐他汀或者compactin)。
21．按照上述權(quán)利要求之任一的方法，其中所說(shuō)微生物是酵母。
22．按照權(quán)利要求21的方法，其中所說(shuō)化合物是四乙?；参锴拾贝?TABS)。
23．按照上述權(quán)利要求之任一的方法，其中所說(shuō)微生物是細(xì)菌。
24．按照權(quán)利要求23的方法，其中所說(shuō)化合物是維生素。
25．按照上述權(quán)利要求之任一的方法，其中所說(shuō)生物量得自酸化作用(如達(dá)到pH＜5)之后的發(fā)酵肉湯。
26．按照權(quán)利要求25的方法，其中所說(shuō)酸化作用(例如達(dá)到pH為大約2)導(dǎo)致化合物的沉淀。
27．一種包含或者來(lái)源于真菌的微生物壓出物。
28．按照權(quán)利要求27的壓出物，其中所說(shuō)真菌屬于被孢霉屬。
29．一種包含生物量的粒狀顆粒的組合物，其中所說(shuō)顆粒具有至少30％但不到70％的平均干物質(zhì)含量并且得自成粒的生物量。
30．一種包含干燥顆粒的組合物，其中所說(shuō)顆粒來(lái)源于微生物生物量并得到干燥，并且具有至少80％的平均干物質(zhì)含量。
31．按照權(quán)利要求30或者31之任一的組合物，其中所說(shuō)粒狀顆?；蛘吒稍镱w粒由擠壓形成。
32．按照權(quán)利要求29至31之任一的組合物，其中所說(shuō)生物量包含真菌。
33．按照權(quán)利要求29至32之任一的組合物，其中所說(shuō)粒狀顆粒的直徑為0.3-10mm，同時(shí)它們的長(zhǎng)度平均為顆粒的直徑的2至6倍。
34．由按照權(quán)利要求1至26之任一的方法分離、提取或者純化的化合物用于制備食品組合物、營(yíng)養(yǎng)添加劑、化妝品和/或藥物組合物的用途。
35．按照權(quán)利要求34的用途，其中所說(shuō)食品組合物包含嬰兒配方。
36．一種用于把一種或多種化合物與生物量的顆粒分離的方法，該方法包括a)提供干物質(zhì)含量至少為80％的干燥顆粒，所說(shuō)顆粒得自包含產(chǎn)生這樣的化合物的微生物的微生物生物量；以及b)從由溶劑提取的干燥顆粒中提取或者分離上述或者每種化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了把所需的化合物與微生物生物量分離的方法,其中包括使微生物生物量(如果必要,預(yù)處理該微生物生物量使之成為25至80%的干物質(zhì)含量)成為粒狀(例如通過(guò)擠壓),然后使之干燥為至少80%的干物質(zhì)含量。將所說(shuō)生物量形成顆粒可使?fàn)柡蟮纳锪?其可以作為干燥的顆粒儲(chǔ)存)干燥過(guò)程十分易于進(jìn)行并且可形成高產(chǎn)率的化合物提取物。
文檔編號(hào)C11B1/02GK1226923SQ97194211
公開(kāi)日1999年8月25日 申請(qǐng)日期1997年3月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月28日
發(fā)明者H·L·比爾, A·沙普, J·M·J·維瑟 申請(qǐng)人:吉斯特-布羅卡迪斯股份有限公司