專利名稱：新的可聚合脂肪酸、磷脂和由此制備的聚合脂質(zhì)體的制作方法
1．導(dǎo)言本發(fā)明涉及用于制備可聚合脂質(zhì)體的新的可聚合脂肪酸和磷脂，這些可聚合脂質(zhì)體用于疫苗、過(guò)敏素、診斷劑和治療劑的口服和／或粘膜傳遞。本發(fā)明尤其涉及具有一個(gè)可聚合基團(tuán)、一個(gè)表面活性劑基團(tuán)和一個(gè)官能團(tuán)的可聚合脂肪酸如化合物十八碳二烯酰基(octadecadienoyl)-聚乙二醇-琥珀酸(ODPEGSu)化合物和由此制備的可聚合脂質(zhì)體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及偶聯(lián)到導(dǎo)向配體的可聚合脂肪酸和摻入它們的可聚合脂質(zhì)體，這種導(dǎo)向配體對(duì)人類和哺乳動(dòng)物腸中的M細(xì)胞以及鼻咽腔中的類似細(xì)胞具有親合力，如可粘結(jié)到M細(xì)胞上的外源凝集素或蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還涉及負(fù)電荷可聚合類脂，尤其是可聚合主鏈上具有磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)或磷脂酰絲氨酸(PS)基團(tuán)的可聚合脂質(zhì)體的衍生物和由此制備的脂質(zhì)體。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體用作或用于藥用組合物中的用途，這些藥用組合物用于各種診斷劑或治療劑包括藥物、過(guò)敏素和疫苗的口服給藥。本發(fā)明的脂質(zhì)體增強(qiáng)了在胃腸(G-I)道中的穩(wěn)定性并增強(qiáng)將脂質(zhì)體導(dǎo)向到特定細(xì)胞上從而提高對(duì)包封治療劑吸收過(guò)程的適應(yīng)性。
2．發(fā)明背景2．1．藥物傳遞藥物傳遞依據(jù)所要傳遞的試劑和給藥途徑采取不同的方式。最方便的體內(nèi)給藥方式是通過(guò)口服給藥。然而，許多藥物，尤其蛋白質(zhì)和肽類，在通過(guò)胃腸(G-I)道時(shí)吸收差而且不穩(wěn)定。這些藥物的給藥通常是通過(guò)胃腸外注射來(lái)進(jìn)行。
盡管口服疫苗更方便，但疫苗通常通過(guò)注射給藥。死疫苗或肽類疫苗尤其如此，因?yàn)樗鼈冊(cè)谖改c道中吸收差而且不穩(wěn)定。系統(tǒng)免疫的一個(gè)問(wèn)題是它不能有效誘導(dǎo)作為入侵的微生物的第一道防御屏障而顯得重要的粘膜免疫反應(yīng)，尤其IgA的產(chǎn)生。由于這個(gè)原因，如果能夠克服吸收差和不穩(wěn)定問(wèn)題，提供口服疫苗是有利的。
藥物傳遞的控釋體系通常用來(lái)設(shè)計(jì)對(duì)身體特定部位的給藥。在腸胃道中重要的是藥物在可能產(chǎn)生局部作用或穿過(guò)進(jìn)入血管前不被消除。
許多年來(lái)，腸溶衣制劑被廣泛用于保護(hù)口服給藥以及延緩釋放。曾經(jīng)提出過(guò)幾種微球體制劑用作口服藥物的傳遞途徑。例如，Enzytech在PCT／US90／06433中公開(kāi)了使用疏水性蛋白質(zhì)如玉米醇溶蛋白來(lái)形成微粒；Steiner等在美國(guó)專利第4976968號(hào)中公開(kāi)了使用“類蛋白質(zhì)”來(lái)形成微粒；UAB Research Foundation和Southern ResearchInstitute在歐洲專利申請(qǐng)書(shū)第0333523號(hào)中公開(kāi)了使用合成聚合物如聚乳酸(polylactic acid)-乙醇酸(glycolic acid)來(lái)形成微球。
直徑小于10微米的顆粒如EPA 0333523中的微顆?？杀惶厥獠课?如位于腸尤其回腸中的派爾斑和其它腸道粘膜淋巴聚集體)的細(xì)胞吸收進(jìn)入淋巴循環(huán)。在微粒體系中包埋藥物或抗原可以阻止藥物或抗原被酸和酶降解，還使得藥物或抗原可采用口服給藥，它們通過(guò)特殊的吸收系統(tǒng)來(lái)吸收而包埋材料以持續(xù)的方式釋放或由吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理。當(dāng)包埋材料為藥物時(shí)，在首過(guò)作用(通過(guò)肝臟代謝)的消除方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。
2．2．脂質(zhì)體曾經(jīng)有人如Patel和Ryman在FEBS Letters 62(1)，60-63頁(yè)(1976)提出使用常規(guī)的脂質(zhì)體作為藥物傳遞系統(tǒng)。脂質(zhì)體的直徑通常小于10微米，并且如果穩(wěn)定地通過(guò)了胃腸道，它們可以通過(guò)派爾斑來(lái)吸收(Aramaki，Y．，H．Tomizawa，T．Hara，K．Yachi，H．Kikuchi和S．Tsuchiya，1993，體外脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和它們?cè)诳诜o藥后通過(guò)小鼠派爾斑M(jìn)細(xì)胞的吸收，Pharm．Res．第10期1338頁(yè)，1331頁(yè)；Childers，N．，F(xiàn)．R．Donya，N．F．Magoo和S．M．Michalek 1990由小鼠派爾斑M(jìn)細(xì)胞吸收的脂質(zhì)體亞結(jié)構(gòu)的研究用于純化抗原傳遞的口服疫苗體系局部免疫38-16頁(yè))。脂質(zhì)體還有一些特性使得在用于口服藥物或抗原傳遞的顆粒系統(tǒng)中具有優(yōu)勢(shì)。脂質(zhì)體的磷脂雙層膜分離并對(duì)內(nèi)部水性核的包埋材料與外部進(jìn)行隔離。水溶性物質(zhì)和水不溶性物質(zhì)可以分別包埋在同一脂質(zhì)體的不同區(qū)室即含水的芯材和雙層膜中?？梢韵@些物質(zhì)之間的化學(xué)和物理作用，因?yàn)檫@些物質(zhì)位于不同的區(qū)室。此外，脂質(zhì)體容易制備。然而，脂質(zhì)體物理和化學(xué)不穩(wěn)定，包埋材料很快泄漏而囊結(jié)構(gòu)降解。如不增強(qiáng)脂質(zhì)體，它們不能很好地用于口服藥物或抗原的傳遞。這樣，盡管早期提出過(guò)將常規(guī)的脂質(zhì)體用于口服藥物的傳遞，但它們的應(yīng)用仍不能被接受。
曾經(jīng)有人嘗試用幾種方法來(lái)增強(qiáng)脂質(zhì)體。一些方法涉及將膽固醇嵌入雙層膜內(nèi)或用具有高熔點(diǎn)的磷脂形成脂質(zhì)體或用賦形劑如單糖或多糖物理穩(wěn)定預(yù)先形成的脂質(zhì)體。通常這些方法被認(rèn)為并不能充分地使脂質(zhì)體用于口服傳遞，因?yàn)樵诳诜鬟f中脂質(zhì)體暴露于胃中酸性pH下以及腸中的膽汁鹽和磷脂酶下。這些條件通常溶解特異的脂質(zhì)體雙層膜，而內(nèi)容物釋放出來(lái)并被降解。
2．3．聚合脂質(zhì)體聚合脂質(zhì)體被認(rèn)為是一種能在體外穩(wěn)定脂質(zhì)體并減少包封藥物降解、凝集和泄漏問(wèn)題的有效方法。曾經(jīng)有人嘗試開(kāi)發(fā)聚合脂質(zhì)體來(lái)改進(jìn)包封藥物的口服傳遞(Chen等，WO9503035)。還對(duì)聚合脂質(zhì)體在胃腸道中的存活能力進(jìn)行了研究(Chen等，1995，Proceed．Internat．Symp．Control．Rel．Bioact．Mater．22；Chen等，1995，Proc．3rd U．S．Japan Symposium on Drug Delivery Systems；Brey，R．N．，1997，Proc．4thU．S．Japan Symposium on Drug delivery)。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，許多化合物可以形成聚合脂質(zhì)體。例如，美國(guó)專利第4248829號(hào)公開(kāi)了含有可聚合二炔酰基鏈的磷脂通過(guò)紫外光進(jìn)行分子間或分子內(nèi)的交聯(lián)。
美國(guó)專利第4485045號(hào)公開(kāi)了含有不飽和低級(jí)脂族酰氧基較長(zhǎng)鏈的鏈烷酰氧基部分的可聚合磷脂酰膽堿衍生物。磷脂酰膽堿衍生物的可聚合位置為酰氧基取代基末端的乙烯基。
美國(guó)專利第4808480號(hào)公開(kāi)了含有用于形成可聚合磷脂的二硫鍵的雜環(huán)化合物。磷脂以甘油?；┒巳〈Y(jié)合雜環(huán)二硫化物，并在雜環(huán)取代基上進(jìn)行開(kāi)環(huán)聚合。
美國(guó)專利第4594193號(hào)公開(kāi)了含有硫醇基的可聚合類脂化合物。這些類脂通過(guò)形成分子間二硫連鍵來(lái)聚合。
美國(guó)專利第5160740號(hào)公開(kāi)了使可聚合的2，4-二烯磷脂、膽固醇和可聚合的2，4-二烯脂肪酸聚合來(lái)形成聚合的大分子內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。據(jù)報(bào)導(dǎo)這種網(wǎng)能穩(wěn)定存在于表面活性劑溶液中并能包封血紅蛋白。
美國(guó)專利第5466467號(hào)公開(kāi)了含有可聚合?；湶糠趾徒饘?螯合物的磷脂酰膽堿衍生物。磷脂含有在極性首基上以共價(jià)鍵結(jié)合到膽堿上的亞氨基二乙酸。由單體單元形成的交聯(lián)磷脂膜可用來(lái)通過(guò)金屬橋在脂質(zhì)體表面固定酶和蛋白質(zhì)。
此外，美國(guó)專利第5366881號(hào)公開(kāi)了含有不同可聚合基團(tuán)的磷脂酰膽堿衍生物，這些基團(tuán)位于?；湹牟煌恢脧亩淖兡さ牧鲃?dòng)性能。此外，非聚合的磷脂與可聚合磷脂的混合物還提供了能條件釋放包封材料的雙層脂質(zhì)體。
在由Regen所著的脂質(zhì)體從生物物理學(xué)到治療學(xué)(Ostro，ed．，1987)，Marcel Dekker，N．Y．中描述了許多其它的可聚合磷脂。在磷脂的?；溁驑O性首基中包含的其它可聚合部分在Singh，A．和J．M．Schnur所著的“可聚合磷脂”，在磷脂手冊(cè)(Gregor Cevc編輯，MarcelDekker，New York)中進(jìn)行了描述。此外，還描述了各種其它可聚合磷脂和脂肪酸，它們?cè)邗；溄Y(jié)構(gòu)中含有異丁烯酸、苯乙烯、丁二炔和(azidoformaloxy)基。
盡管通常聚合脂質(zhì)體比它們沒(méi)有聚合的相應(yīng)部分要穩(wěn)定，但不清楚的是至今獲得的改進(jìn)穩(wěn)定性是否足以使脂質(zhì)體自身能傳遞口服給藥的有效劑量。最近的研究調(diào)查了修飾聚合脂質(zhì)體的可能性，使其含有一個(gè)分子或配體，能選擇性地導(dǎo)向哺乳動(dòng)物腸中的M細(xì)胞或其它吸收性細(xì)胞(Chen等，1996，Pharmaceutical Research第13期1378-1383頁(yè))。結(jié)合導(dǎo)向配體被認(rèn)為能提高修飾過(guò)的聚合脂質(zhì)體在M細(xì)胞表面的粘附效率，并因此提高包封于脂質(zhì)體中藥物的吸收效率。M細(xì)胞是特殊的上皮細(xì)胞，分布在與卵泡相關(guān)的上皮組織(FAE)中，而FAE重疊在哺乳動(dòng)物小腸的派爾斑上。使用對(duì)M細(xì)胞、腸細(xì)胞和其它細(xì)胞表面受體特異性的導(dǎo)向配體需要新的化學(xué)來(lái)有效結(jié)合這些聚合脂質(zhì)體的穩(wěn)定性或安全性沒(méi)有受損的配體。
曾經(jīng)有各種方法描述將生物活性的配體共價(jià)偶聯(lián)到常規(guī)脂質(zhì)體表面。美國(guó)專利第5171578號(hào)公開(kāi)了通過(guò)修飾的磷脂酰乙醇胺將糖蛋白鏈霉抗生物素化學(xué)連接到脂質(zhì)體表面。由于這些表面修飾的脂質(zhì)體對(duì)生物素有選擇性的結(jié)合親合力，因而可被用來(lái)將生物素化的蛋白質(zhì)直接結(jié)合到其表面上。
美國(guó)專利第5204096中描述了通過(guò)用碳化二亞胺激活肽，然后偶聯(lián)到暴露于脂質(zhì)體表面的活性羧基上而將肽共價(jià)偶聯(lián)到脂質(zhì)體表面。在這個(gè)例子中，表面羧基由氨基烷如類脂雙層中的硬脂酰胺或二氨基烷提供。
美國(guó)專利第5258499號(hào)公開(kāi)了脂質(zhì)體細(xì)胞因子配合物的制備，其中受體結(jié)合的白介素-2的共價(jià)偶聯(lián)過(guò)程涉及用作為連接劑的琥珀酰亞胺基-4-(P-馬來(lái)酰亞胺苯基)-丁酸酯處理細(xì)胞因子，然后連接到活化的脂質(zhì)體表面。在這個(gè)例子中，活化的脂質(zhì)體表面由用琥珀酰亞胺基-S-乙?；虼宜狨バ揎椀牧字Ｒ掖及方M成。
Zalipsky等(Zalipsky，S．，Mullah，N．，Harding，J．A．，Gittelman，J．，Guo，L．和DeFrees，S．A．，1997，Bioconjug．Chem．第8期111-118)描述了用于修飾脂質(zhì)體表面的類脂錨(lipid anchor)的合成，包括作為類脂錨的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，作為連接部分的分子量為2000的雜二官能團(tuán)的聚乙二醇(PEG)和生物細(xì)胞粘附配體[YIGSR peptide orSialyl Lewis(X)oligosaccharide(SLX)]。Allen等(Allen，T．M．，Brandeis．E．，Hansen，C．B．Kao，G．Y．Zalipsky，S．1995．Biochim Biophys Acta．第1237期99-108頁(yè))描述了空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的表面的衍生。合成聚乙二醇(PEG)-類脂的衍生物吡啶硫代丙酰氨基-PEG-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PDP-PEG-DSPE)并摻入到脂質(zhì)體中。硫化PDP基團(tuán)導(dǎo)致了在脂質(zhì)體表面具有反應(yīng)活性的巰基基團(tuán)的形成，它與馬來(lái)酰亞胺活化的抗體反應(yīng)產(chǎn)生抗體之間的共價(jià)連接。Kirpotin等(Kirpotin，D．，Park，J．M．，Hong，K．，Zalipsky，S．，Li，W．L，Carter，P．，Benz，C．C．，Papahadiopoulos，D．1997．生物化學(xué)第36期66-75頁(yè))描述了通過(guò)PEG-修飾的二硬脂酰磷脂?；字Ｒ掖及饭曹椀饺酥亟MMab的Fab片斷上的脂質(zhì)體的形成，這種Mab通過(guò)馬來(lái)酰亞胺封端的、與膜錨合的、在PEG鏈的遠(yuǎn)端共價(jià)連接兩類間隔基來(lái)抑制乳腺癌標(biāo)記物HER2／neu的細(xì)胞外區(qū)域。
2．4．導(dǎo)向脂質(zhì)體的外源凝集素曾經(jīng)有人提出過(guò)將外源凝集素作為有前景的部分用于導(dǎo)向配體。外源凝集素是一大類蛋白質(zhì)，通常為植物源的糖蛋白，與特定的糖類特異性地結(jié)合。像任何導(dǎo)向配體一樣，外源凝集素可以共鍵結(jié)合脂質(zhì)體的類脂，或通過(guò)短距離的分子間作用力和簡(jiǎn)單空間纏結(jié)的組合非共價(jià)連接脂質(zhì)體。表面結(jié)合的外源凝集素能有助于將帶有包封藥物或抗原的脂質(zhì)體選擇性導(dǎo)向到表達(dá)在細(xì)胞受體上的反配體的糖或其它表面糖蛋白上。為有效導(dǎo)向特定的細(xì)胞，外源凝集素必須連接到脂質(zhì)體上以使外源凝集素的位點(diǎn)特異性部分暴露出來(lái)并用來(lái)與結(jié)合細(xì)胞。此外，導(dǎo)向外源凝集素必須以一種方式摻入脂質(zhì)體中，這種方式不會(huì)使脂質(zhì)體變得不穩(wěn)定或者使導(dǎo)向配體從脂質(zhì)體表面物理釋放出來(lái)。已經(jīng)鑒定了大量對(duì)腸的吸收細(xì)胞和M細(xì)胞有選擇性的外源凝集素(Gianasca，P．J．，K．T．Gianasca，P．Falk，J．I．Gordon，和M．R．Neutra 1994，Gastrointen．Liver Physiol．30G 1108-1121頁(yè)；Clark，M．A．，M．A．Jepson，和B．H．Hirst 1995．外源凝集素結(jié)合試驗(yàn)確定和區(qū)分小鼠小腸和盲腸的M-細(xì)胞，Histochem Cell Biol．第104期104-161頁(yè))。最近的工作已經(jīng)表明對(duì)腸M細(xì)胞和腸細(xì)胞具有選擇性的外源凝集素可以摻入脂質(zhì)體的雙層中，并隨后進(jìn)行聚合(Chen等，1996，藥學(xué)研究，第13期，1378-83頁(yè))。這些外源凝集素修飾的聚合脂質(zhì)體顯示出將脂質(zhì)體導(dǎo)向到胃腸道派爾斑上效率的提高。然而，在這些研究中使用的外源凝集素修飾的錨定類脂對(duì)聚合脂質(zhì)體雙層內(nèi)的穩(wěn)定性來(lái)說(shuō)在結(jié)構(gòu)上并不是最佳的且形成引起不穩(wěn)定的非聚合類脂的碎片。
盡管脂質(zhì)體技術(shù)和藥物傳遞技術(shù)的進(jìn)展，但仍然需要穩(wěn)定和有效的聚合脂質(zhì)體和新的能摻入可聚合脂質(zhì)體中從而提高穩(wěn)定性、結(jié)合選擇性和藥物傳遞有效性的可聚合化合物。此外，還需要新的方法來(lái)生產(chǎn)摻入導(dǎo)向分子或配體的可聚合脂質(zhì)體，以及包封藥物的可聚合脂質(zhì)體。
3．發(fā)明概述本發(fā)明包括新的用于制備可聚合脂質(zhì)體的化合物和由此制得的可聚合脂質(zhì)體。這些新化合物可用于產(chǎn)生性能改進(jìn)的可聚合脂質(zhì)體，包括改進(jìn)在胃腸道中的穩(wěn)定性、增強(qiáng)導(dǎo)向特異性細(xì)胞的能力和有效傳遞通過(guò)口服或粘膜服用的治療劑、診斷劑和其它制劑。本發(fā)明尤其適用于口服疫苗的傳遞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含了新的可聚合脂肪酸，它包括可聚合基團(tuán)如2，4-十八碳二烯?；?2，4OD)，表面活性劑基團(tuán)如聚乙二醇(PEG)和酸官能團(tuán)如琥珀酸(Su)以及這些基團(tuán)之間穩(wěn)定的化學(xué)鍵。可聚合基團(tuán)可含有各種可聚合部分如雙鍵、三鍵或硫醇基。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可聚合脂肪酸的化學(xué)式為CH3-(CH2)12-CH=CH-CH=CH-C(O)-(OCH2CH2)n-O-C(O)-CH2CH2CO2H其中n為單體單元的平均數(shù)，由所使用的聚乙烯試劑的平均分子量確定。分子量為約200到約2000g／mol。
本發(fā)明還涉及可聚合脂肪酸，它們連接配體如外源凝集素、能導(dǎo)向腸中的M細(xì)胞和吸收型腸細(xì)胞以及鼻咽腔表面的類似細(xì)胞的分子。
本發(fā)明還涉及聚合脂質(zhì)體，它以連接導(dǎo)向配體如外源凝集素或以非衍生物的形式結(jié)合可聚合脂肪酸。這些聚合脂質(zhì)體尤其通過(guò)聚合可聚合類脂和可聚合脂肪酸或連接導(dǎo)向配體的可聚合脂肪酸以及任選的其它非聚合磷脂和／或膽固醇的混合物得到。
本發(fā)明還涉及含有帶負(fù)電荷的親水性基團(tuán)的可聚合類脂，這些基團(tuán)如磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)或磷脂酰絲氨酸(PS)。這些可聚合類脂可以以甘油基主鏈如1，2-二(2，4-十八碳二烯?；?或其它可聚合類脂主鏈為基礎(chǔ)。
3．1．定義此處所用術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”定義為通過(guò)類脂雙層包覆的含水區(qū)室。(Stryer，生物化學(xué)，第二版，W．H．Freeman & Co．，213頁(yè)(1981))。這些脂質(zhì)體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的薄膜水合技術(shù)和隨后幾步凍融循環(huán)來(lái)制備。脂質(zhì)體懸浮液也可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來(lái)制備，例如這些方法公開(kāi)在美國(guó)專利第4522811號(hào)，其全文結(jié)合在此作為參考。
此處所用術(shù)語(yǔ)“聚合脂質(zhì)體”定義為脂質(zhì)體，其中部分、大多數(shù)或全部磷脂組成通過(guò)分子間和／或分子內(nèi)作用力相互共價(jià)結(jié)合。這些磷脂可以在磷脂雙層(葉狀體)的一層內(nèi)結(jié)合在一起和／或在兩層間結(jié)合在一起。
此處所用術(shù)語(yǔ)“常規(guī)脂質(zhì)體”是指未聚合的脂質(zhì)體。
聚合脂質(zhì)體的聚合程度為30-100％；即形成可獲得的高達(dá)100％的結(jié)合。聚合脂質(zhì)體的大小約為15nm-10μm。當(dāng)待傳遞材料為疏水性并被磷脂層吸引時(shí)，聚合脂質(zhì)體可裝載高達(dá)100％的待傳遞材料。通常當(dāng)這種材料為親水性時(shí)，約5-40％的材料被包封。
此處所用術(shù)語(yǔ)“包埋率(trap ratio)”定義為內(nèi)部水相體積與使用的總的水相體積之比。
此處所用術(shù)語(yǔ)“自由基引發(fā)劑”定義為引發(fā)自由基聚合的化學(xué)物質(zhì)。
此處所用術(shù)語(yǔ)“反相蒸發(fā)技術(shù)”定義為用有機(jī)溶劑溶解類脂，加入緩沖溶液，并在減壓下蒸發(fā)有機(jī)溶劑的方法，在Szoka，F(xiàn)．Jr．和Papahadjopoulos，D．Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75卷，No．9，4194-4198頁(yè)(1978)中進(jìn)行了描述。
此處所用術(shù)語(yǔ)“凍融技術(shù)”或“F-T”定義為在低溫流體如液氮中冷凍懸浮液，接著在約30℃的水浴中融化該懸浮液。
此處所用術(shù)語(yǔ)“粘膜”或“粘膜組織”是指上皮組織如腸的固有膜、消化道中的平滑肌層、鼻咽上皮組織、肺上皮組織、眼上皮組織或陰道上皮組織。通常這些組織通過(guò)一層粘膜，即mucin和厚達(dá)200μm蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物而受到保護(hù)，它作為針對(duì)微生物病原體的機(jī)械屏障并作為分泌性效應(yīng)物如分泌型免疫球蛋白的一種環(huán)境。此處所用的粘膜傳遞是指包括通過(guò)支氣管、牙齦、舌、頰、鼻、口、陰道和腸粘膜組織的傳遞。
此處所用術(shù)語(yǔ)“緩沖溶液”定義為水溶液或含有低于25％可混溶有機(jī)溶劑的水溶液，其中，加入緩沖劑來(lái)控制溶液的pH值。合適緩沖劑的實(shí)例包括但不限于PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)、TRIS(三-(羥甲基)氨基甲烷)、HEPES(羥乙基哌啶乙烷磺酸)和TES(2-[-(三羥甲基)甲基]氨基-1-乙基磺酸)。
此處所用術(shù)語(yǔ)“葉狀體”定義為在形成雙層脂質(zhì)體中的單層磷脂。
4．本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及一種口服或粘膜給藥的傳遞系統(tǒng)，它將藥物傳遞到腸道和其它上皮表面的粘膜組織，其中采用聚合脂質(zhì)體作為藥物載體。更具體地，本發(fā)明涉及新的可聚合脂肪酸、新的可聚合磷脂和由此制得的脂質(zhì)體。這些可聚合脂肪酸和磷脂用于制備在胃腸道中十分穩(wěn)定的脂質(zhì)體。此外，這些可聚合脂肪酸和磷脂可用來(lái)將導(dǎo)向分子共價(jià)連接到脂質(zhì)體上，如導(dǎo)向腸中派爾斑的M細(xì)胞、吸收性腸細(xì)胞和其它粘膜表面的其它相似細(xì)胞的外源凝集素。可聚合脂肪酸被用于改進(jìn)對(duì)聚合脂質(zhì)體的制備和裝載。用這些新脂肪酸或磷脂制備的聚合脂質(zhì)體尤其用于將疫苗和抗原傳遞導(dǎo)向M細(xì)胞。以下描述新的脂肪酸或磷脂，如何制備它們和如何利用它們來(lái)制備穩(wěn)定的聚合脂質(zhì)體。
4．1．可聚合脂肪酸在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含新的可聚合脂肪酸，它既可增強(qiáng)與其結(jié)合的聚合脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，還可提供官能酸連接基從而方便、高效和有效地將導(dǎo)向配體與聚合脂質(zhì)體相連?？删酆现舅岚ㄒ欢藶榭删酆匣鶊F(tuán)、另一端為酸官能團(tuán)，和在可聚合基團(tuán)和官能團(tuán)之間的表面活性劑基團(tuán)以形成脂肪酸的中間部分，以及這些基團(tuán)間任選化學(xué)穩(wěn)定的連接部分。官能團(tuán)優(yōu)選酸官能團(tuán)。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中這些新的脂肪酸的結(jié)構(gòu)式為R4-X-PEG-Y-B其中可聚合基團(tuán)R4為能夠進(jìn)行聚合的至少含有一個(gè)可聚合官能團(tuán)的親油性鏈(脂肪酸鏈)；X或Y獨(dú)立為官能連鍵如酯鍵、醚鍵、酰胺鍵或氨基甲酸酯；B為酸官能團(tuán)、-NH2或醛；而PEG為優(yōu)選的表面活性劑基團(tuán)，其分子量的變化如下所述。
這些新脂肪酸的結(jié)構(gòu)使它們?cè)谟糜谂c可聚合脂質(zhì)體連接時(shí)具有獨(dú)特的官能度和特別的用途?？删酆匣鶊F(tuán)使新的脂肪酸分子與可聚合脂質(zhì)體中的可聚合磷脂進(jìn)行共聚，這樣這些分子共價(jià)連接到聚合脂質(zhì)體上，而不是以較不穩(wěn)定的方式如通過(guò)插層反應(yīng)或空間纏結(jié)進(jìn)行連接。酸官能團(tuán)提供了一個(gè)方便的反應(yīng)部位，它可用已知技術(shù)衍生來(lái)連接任何能夠與酸或衍生酸部分結(jié)合的導(dǎo)向配體。表面活性劑基團(tuán)在可聚合基團(tuán)和官能酸基之間，而且包含具有疏水區(qū)和親水區(qū)的聚合鏈。
表面活性劑基團(tuán)有幾個(gè)功能性目的。根據(jù)脂質(zhì)體的所需性能，表面活性劑基團(tuán)的聚合鏈可長(zhǎng)可短，并且可以改變鏈的親水／疏水相對(duì)值。聚合鏈不應(yīng)太長(zhǎng)以免影響親油性部分參與類脂堆積的能力。例如，具有優(yōu)異親水性的長(zhǎng)鏈表面活性劑基團(tuán)可以從脂質(zhì)體延伸到周圍溶液中，提供給脂質(zhì)體大量的親水性“毛發(fā)”來(lái)保護(hù)脂質(zhì)體并有效“掩護(hù)”脂質(zhì)體通過(guò)胃腸道。親水性較差的短鏈表面活性劑基團(tuán)與脂質(zhì)體靠得近，并卷曲和纏繞從而在脂質(zhì)體表面附近產(chǎn)生大量的親水性卷曲和纏繞。應(yīng)該理解是通過(guò)改變聚合物的鏈長(zhǎng)和親水性可以獲得幾種構(gòu)型。當(dāng)脂肪酸連接到導(dǎo)向配體并偶聯(lián)到聚合脂質(zhì)體中時(shí)，表面活性劑基團(tuán)的聚合物鏈還充當(dāng)脂質(zhì)體和導(dǎo)向基團(tuán)之間的”間隔基”，使導(dǎo)向基團(tuán)如所需地靠近或遠(yuǎn)離脂質(zhì)體。
可聚合基團(tuán)為能夠連接表面活性劑基團(tuán)并與可聚合磷脂共聚的任何基團(tuán)。許多可聚合基團(tuán)都是適用的，并且應(yīng)該理解，可聚合基團(tuán)的特異選擇取決于可聚合磷脂和所選的表面活性劑基團(tuán)。例如，可以方便地使用單-、雙-或多-不飽和脂族羧酸，其可以通過(guò)雙鍵或三鍵或兩種鍵與可聚合磷脂聚合，并通過(guò)酸部分連接到羥基封端的表面活性劑基團(tuán)上?？删酆匣鶊F(tuán)的具體實(shí)例包括但不局限于不飽和脂族酸基團(tuán)如CH3(CH2)mCH=CH-CH=CHCOOH，其中亞甲基數(shù)(m)為4-12。雙鍵或可聚合官能度可在鏈上的任何位置，只要它們提供的環(huán)境適于聚合和堆積。在一個(gè)分子中可有一或多個(gè)這樣的官能度。
表面活性劑基團(tuán)包括具有親水區(qū)和疏水區(qū)的一個(gè)聚合鏈，能夠偶聯(lián)到可聚合基團(tuán)和酸官能團(tuán)。例如，聚醚如聚乙二醇、聚丙二醇和它們的共聚物都是合適的表面活性劑基團(tuán)。也可以使用聚乳酸。表面活性劑基團(tuán)優(yōu)選聚乙二醇，因?yàn)樗芊€(wěn)定地連接下面討論的優(yōu)選enoic可聚合基團(tuán)和優(yōu)選二酸官能團(tuán)。
官能團(tuán)可以是能夠連接表面活性劑基團(tuán)的酸。優(yōu)選二酸，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀走B接到優(yōu)選的聚醚表面活性劑基團(tuán)上。特別優(yōu)選飽和的脂族二酸，其化學(xué)式如下
HO-C(O)-(CH2)b-C(O)-OH其中b為0(即草酸)到12間的一個(gè)整數(shù)，優(yōu)選為0-4。含有2-14個(gè)碳原子的不飽和二酸也是適用的。為方便連接表面活性劑基團(tuán)，特別優(yōu)選使用二酸的酸酐形式，如琥珀酸(琥珀酸酐)?；蛘吖倌軋F(tuán)可以是胺、酰胺或二胺。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可聚合基團(tuán)為2，4-二烯?；?dienoyl)，表面活性劑為聚乙二醇基團(tuán)(PEG)，官能團(tuán)為短鏈二酸基團(tuán)。在這個(gè)實(shí)施方案中，脂肪酸的化學(xué)式如下CH3-(CH2)a-CH=CH-CH=CH-C(O)-(OCH2CH2)n-O-C(O)-(CH2)b-CO2H其中a為0到18間的一個(gè)整數(shù)，優(yōu)選4-12，b為0到12間的一個(gè)整數(shù)，優(yōu)選0-4，而n的值取決于用于合成脂肪酸的聚乙二醇試劑的平均分子量；n可為約4(PEG-200)-約45(PEG-2000)。應(yīng)該理解，n為平均值，通常不為整數(shù)，它表征某個(gè)特定平均分子量的可供商品聚乙二醇中不同鏈長(zhǎng)的混合物。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，可聚合基團(tuán)為2，4-十八碳二烯酰基(2，4OD)，表面活性劑為聚乙二醇基團(tuán)(PEG)，酸官能團(tuán)為琥珀酸基團(tuán)(Su)。在這個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸的化學(xué)式如下CH3-(CH2)12-CH=CH-CH=CH-C(O)-(OCH2CH2)n-O-C(O)-CH2-CH2-CO2H其中n約為8．7，對(duì)應(yīng)PEG-400中n的平均值。任何所需分子量的聚乙二醇可以結(jié)合到2，4-ODPEGSu脂肪酸中。然而，為與下面描述的導(dǎo)向配體一同使用，聚乙二醇的平均分子量?jī)?yōu)選為約200-約2000，最優(yōu)選為約400-約1900。制備這些優(yōu)選的ODPEGSu可聚合脂肪酸可首先使2，4-十八碳二烯酸與所需分子量的聚乙二醇反應(yīng)生成2，4-ODPEG，然后使ODPEG產(chǎn)物與琥珀酸酐衍生生成ODPEGSu。詳細(xì)的合成參見(jiàn)以下的實(shí)例。
4．2．定向可聚合脂肪酸本發(fā)明的新可聚合脂肪酸可以容易地衍生得到，并與能導(dǎo)向胃腸道中的特定細(xì)胞的配體共價(jià)連接。脂肪酸首先連接導(dǎo)向配體，然后與可聚合脂質(zhì)體共聚，形成與所需的導(dǎo)向配體共價(jià)連結(jié)的穩(wěn)定的聚合脂質(zhì)體。采用已知技術(shù)，該聚合反應(yīng)可在所需的治療劑如疫苗或抗原，或能夠在聚合后裝載治療劑的聚合脂質(zhì)體的存在下進(jìn)行。得到的穩(wěn)定的導(dǎo)向脂質(zhì)體可以用于有效并有選擇性地將治療劑傳遞到胃腸道中的M細(xì)胞。這樣本發(fā)明的定向脂肪酸特別用于治療劑如疫苗的口服傳遞。
本發(fā)明包括以上描述的新脂肪酸，它進(jìn)一步衍生(如果需要的話)并連接能夠?qū)蛭改c道特定細(xì)胞的配體或分子。我們認(rèn)為用這些導(dǎo)向配體制備的脂質(zhì)體能選擇性地粘結(jié)到這些靶細(xì)胞上，因而增加了傳遞包封藥物的有效性。例如，定向的配體可以是對(duì)人類和哺乳動(dòng)物腸中M細(xì)胞具有親和力的外源凝集素。優(yōu)選配體為外源凝集素如EEA(Euonymus Europaeus)、熒光標(biāo)記的EEA、FITC-EEA(熒光素異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyante)-EEA)、UEA-I(Ulex EuropaeusAgglutinin I)和WGA(Wheat Germ Agglutinin)。許多其它配體可以有效地用于粘膜應(yīng)用；例如，二型構(gòu)架單克隆抗體(Mab)，(Estrada，A．，M．R．McDermott，B．J．Underdown，和D．P．Snider．1995．具有與抗-MHC二型抗體共軛抗原的小鼠腸道免疫．Vaccine．第13期，901-907頁(yè))、ICAM-1或選擇性粘結(jié)于M細(xì)胞上的其它蛋白質(zhì)或肽類配體包括堿性磷酸酶、細(xì)菌表面蛋白質(zhì)(Jones，B．D．，N．Ghouri和S．Falkow．1994．通過(guò)滲透和破壞派爾斑的特定上皮M細(xì)胞使鼠傷寒沙門(mén)氏菌引發(fā)小鼠感染J．Exp．Med．第180期，15-23頁(yè))或病毒蛋白質(zhì)(Amerongen，H．，G．A．R．Wilson，B．N．Fields，和M．R．Neutra．1994．用于粘附腸M細(xì)胞所需的蛋白水解處理呼腸病毒的方法，J．Virol．第68期，8428-8432頁(yè))或?qū)φ衬さ刂匪丶?xì)胞粘附分子-1有親和力(Madcam-1)的配體或抗體(Sampaio，S．O．，X．Li，M．Takeuchi，C．Mei，U．Francke，E．C．Butcher，和M．J．Briskin，1995．粘膜地址素細(xì)胞粘附細(xì)胞粘附分子-1的組織、調(diào)節(jié)系列及可選的剪接轉(zhuǎn)錄物，J．Immunol．155期2477-2486頁(yè))。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，導(dǎo)向配體為外源凝集素如EEA，而脂肪酸為二烯酰基-聚乙二醇-二酸衍生物，如ODPEGSu。將外源凝集素共價(jià)連接到脂肪酸如ODPEGSu的偶聯(lián)反應(yīng)可以采用本領(lǐng)域的已知技術(shù)如chen等在1996，Pharmaceutical Research第13期1378-1383頁(yè)中所描述的來(lái)實(shí)施。2，4-ODPEGSu與EEA的連接將在下面的實(shí)例中進(jìn)行闡述。
用于可聚合脂質(zhì)體的導(dǎo)向配體的量取決于特定的靶。通常，導(dǎo)向配體與可聚合材料之比約為每個(gè)脂質(zhì)體10-100分子(約1／10000-1／1000(w／w))。
4．3．使用可聚合脂肪酸的聚合脂質(zhì)體本發(fā)明新的可聚合脂肪酸可用來(lái)構(gòu)成口服給藥傳遞系統(tǒng)將藥物傳遞到腸中的粘膜組織。這樣本發(fā)明包括結(jié)合這些新的脂肪酸的聚合脂質(zhì)體以及利用聚合脂質(zhì)體作為藥物載體。這些脂肪酸可以使用它們非衍生物的形式來(lái)提高聚合脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，或者如上所述，連接導(dǎo)向胃腸道特定細(xì)胞的配體?？赏ㄟ^(guò)采用常規(guī)的脂質(zhì)體聚合技術(shù)如輻照、氧化還原引發(fā)、自由基引發(fā)等，聚合可聚合類脂和可聚合脂肪酸或連接聚合物的可聚合脂肪酸或本發(fā)明的可聚合導(dǎo)向脂肪酸的混合物得到聚合脂質(zhì)體。
用于與可聚合脂肪酸和本發(fā)明的定向可聚合脂肪酸接合的可聚合類脂不限于任何特別的類脂?？梢允褂每梢跃酆系牟⒛苄纬删酆现|(zhì)體的任何類脂。在文獻(xiàn)中描述了大量的可聚合類脂；參見(jiàn)如Regen在“脂質(zhì)體從生物物理學(xué)到治療學(xué)”(Ostro編輯．，1987)Marcel Dekker，N．Y．，和Singh和Schnur，可聚合磷脂，在“磷脂手冊(cè)”，1993，MarcelDekker，New York中所述，其全文結(jié)合在此以作參考。優(yōu)選的可聚合類脂包括二烯，它們含有磷脂，首基不帶電荷如甘油、肌醇或絲氨酸或首基帶電荷如膽堿或乙醇胺。特別優(yōu)選1，2-二(2，4-十八碳二烯酰基)-3-磷脂酰膽堿(DODPC)。
可聚合脂肪酸和導(dǎo)向聚合脂肪酸可以是此處所述的任何一種。沒(méi)有受到任何特別理論的束縛，可以認(rèn)為2，4-ODPEGSu脂肪酸與可聚合類脂共聚，而且結(jié)合到脂質(zhì)體中的2，4-ODPEGSu親水尾端從脂質(zhì)體表面延伸進(jìn)入周圍的水相中。這樣PEG鏈通過(guò)形成位阻穩(wěn)定的脂質(zhì)體提高了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，其中通過(guò)擠壓，脂質(zhì)體多少受到一些保護(hù)并與共聚的ODPEGSu鏈纏結(jié)在一起。更高分子量的聚乙二醇(即平均分子量約大于2000)會(huì)破壞脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，而較低分子量的PEG(即平均分子量約為200-2000)對(duì)穩(wěn)定有加合作用。這樣得到的聚合脂質(zhì)體在胃腸道的穩(wěn)定性得到增強(qiáng)并能通過(guò)粘膜層，此外當(dāng)使用定向可聚合脂肪酸時(shí)還可導(dǎo)向腸中特定的細(xì)胞上。
當(dāng)使用定向脂肪酸時(shí)，表面活性劑基團(tuán)的聚合鏈還充當(dāng)脂質(zhì)體與連接到脂肪酸上的導(dǎo)向配體之間的間隔基。相應(yīng)地，應(yīng)選擇聚乙二醇的分子量來(lái)獲得理想的間距，而又能夠使脂肪酸與類脂共聚。因此較低分子量的聚乙二醇被認(rèn)為更合適；即它們的平均分子量約為200-2000，優(yōu)選約200-1500，最優(yōu)選約400。
此外，本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體可附加含有非聚合的化合物，只要有充足數(shù)量的可聚合類脂和可聚合脂肪酸或定向可聚合脂肪酸來(lái)得到足夠穩(wěn)定的聚合脂質(zhì)體。例如，也可使用在本領(lǐng)域熟知的并用于常規(guī)脂質(zhì)體制備的非聚合脂肪酸或非聚合磷脂。此外，膽固醇也可用來(lái)增強(qiáng)穩(wěn)定性。一種優(yōu)選的非聚合化合物是膽固醇，它可以高達(dá)50％的摩爾比包含在可聚合組分中。
本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體可以用于許多化合物的傳遞，包括疫苗、抗原、過(guò)敏素和其它治療劑或診斷劑。它們特別用于疫苗和抗原釋放手段的口服和／或粘膜傳遞。例如，本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體可用來(lái)運(yùn)載許多抗原包括但不限于白喉類毒素、流感血凝素、來(lái)自Lyme氏疏螺旋體病病原的ospA抗原和HTLV包膜蛋白抗原。可以包封在本發(fā)明的脂質(zhì)體中多種抗原的實(shí)例有脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、狂犬病、牛痘、E-B病毒、肝炎、HTLV、皰疹病毒和人類免疫缺陷病毒。它們也可用于許多治療劑的口服傳遞，包括但并不限于化學(xué)治療劑、抗生素、胰島素、細(xì)胞因子、干擾素、荷爾蒙、降鈣素、荷爾蒙、生育藥物、抗病毒劑(ddI，AZT，ddc，阿昔洛韋等)、抗菌劑、抗真菌劑、DNA和RNA核苷酸。
4．4．負(fù)電荷可聚合類脂為了在建立口服藥物傳遞體系中具有更大的適應(yīng)性和用途，本發(fā)明還包括新的帶負(fù)電荷基的可聚合磷脂。將負(fù)電荷基團(tuán)結(jié)合到聚合脂質(zhì)體中大大拓寬了脂質(zhì)體的用途，因?yàn)樗诶弥|(zhì)體所需性能的同時(shí)，還利用了電荷來(lái)提高和改進(jìn)脂質(zhì)體包埋治療劑的能力。得到的負(fù)電荷的可聚合脂質(zhì)體有更好的包埋率，因此在傳遞包埋的治療劑時(shí)特別有效。
本發(fā)明的負(fù)電荷可聚合類脂包括在可聚合主鏈上含有磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)或磷脂酰絲氨酸(PS)基團(tuán)的可聚合類脂。這些可聚合類脂可采用常規(guī)技術(shù)生成結(jié)合負(fù)電荷PI、PG或PS基團(tuán)的可聚合脂質(zhì)體。由于能與二價(jià)陽(yáng)離子相互作用，人們認(rèn)為這些負(fù)電荷可聚合磷脂可以在水懸浮液中交換構(gòu)型。在金屬離子如Ca2+或Mg2+的存在下，可以形成凝筒膠狀或共螯合結(jié)構(gòu)；這些結(jié)構(gòu)由緊密堆積的兩層膜組成，其中水被擠壓出內(nèi)部空間。在待包封的藥物或蛋白質(zhì)的存在下，通過(guò)離心，隨后任選的冷凍干燥，并暴露于二價(jià)金屬離子螯合劑如EGTA或EDTA中得到這種結(jié)構(gòu)，可得到裝載程度高而且再現(xiàn)性好的典型構(gòu)型的球狀雙層脂質(zhì)體。
負(fù)電荷可聚合類脂的結(jié)構(gòu)如下 其中在R、R’或R”中至少一個(gè)獨(dú)立地為磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油或磷脂酰絲氨酸并且剩余兩個(gè)中的至少一個(gè)為可聚合基團(tuán)，由含有二烯酸、二炔酸、異丁烯酸酯側(cè)基、丙烯酸酯或硫醇或含有酸的二硫化物的?；溄M成。例如，負(fù)電荷可聚合類脂也可為下列結(jié)構(gòu) 其中X為甘油、肌醇或絲氨酸；而R1和R2獨(dú)立為可聚合基團(tuán)，它們選自二烯基、二炔基、異丁烯酸根基團(tuán)和硫醇基?？删酆匣鶊F(tuán)優(yōu)選含有一或多個(gè)上述可聚合部分的烴鏈。烴鏈可以為C4-C30并且如果需要可以更高。盡管任何可聚合主鏈可以與這些負(fù)電荷可聚合類脂一同使用，但特別優(yōu)選主鏈為2，4-DODPC。這樣，優(yōu)選負(fù)電荷可聚合類脂為 其中R為磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油或磷脂酰絲氨酸。
根據(jù)Confurius和Zwaal在Biochimin Biophsica Acta，488期36-42頁(yè)(1977)中描述的方法可合成這些新的負(fù)電荷可聚合類脂，其中，可通過(guò)在被保護(hù)甘油、肌醇和絲氨酸的存在下，由磷脂酶D催化磷脂酰交換反應(yīng)，然后經(jīng)去保護(hù)步驟來(lái)合成可聚合的PG、PI或PS。例如，將DODPC溶于二乙醚(蒸餾P2O5脫除痕量的乙醇)中，濃度為20mg／ml。首先冷凍干燥10％(w／v)的L-絲氨酸水溶液來(lái)脫除痕量的甲醇，然后在45℃下以不同濃度(高至飽和(46％，w／v))溶于含有100mM CaCl2的100mM乙酸鹽緩沖液(pH為5．6)中。在45℃下將磷脂酶D加入絲氨酸溶液使其最終濃度為1IU／ml。加入相同體積的DODPC乙醚溶液，為避免蒸發(fā)，馬上密封培養(yǎng)瓶。在45℃攪拌下進(jìn)行溫育來(lái)完成兩相的混合。通常，另外分別在30分鐘和60分鐘后加入與初始加入量相同的兩份磷脂酶D。加入100mM EDTA(相當(dāng)于兩倍體積的乙酸鹽緩沖液)，再過(guò)90分鐘停止溫育。在室溫通過(guò)氮?dú)饬髡舭l(fā)乙醚而將水層與4．3體積的氯仿／甲醇(5．8v／v)相混和并攪拌30分鐘。單相混合物通過(guò)玻璃過(guò)濾劑G-2進(jìn)行過(guò)濾而濾液用1體積的水和3．7體積的氯仿攪拌10分鐘。離心(10分鐘，3000×g)后收集較低的氯仿層并與等體積的無(wú)水乙醇混合，隨后在減壓下蒸發(fā)干燥。將殘?jiān)苡诼确?。?7℃下進(jìn)行相似的溫育，其中為建立DODPS收率最高的最佳條件使用乙醇胺、甘油、甲醇或乙醇代替絲氨酸。
與金屬離子如Ca2+螯合的負(fù)電荷可聚合磷脂，通過(guò)接觸螯合劑可形成無(wú)水脂質(zhì)體并轉(zhuǎn)化為球狀雙層脂質(zhì)體。此外，負(fù)電荷的可聚合磷脂可與新的脂肪酸和如上所述定向脂肪酸混合，并可在二價(jià)陽(yáng)離子的存在下形成無(wú)水復(fù)合結(jié)構(gòu)。在螯合劑的存在下將無(wú)水脂質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)部為含水空間的球狀脂質(zhì)體，此后得到的脂質(zhì)體以上面所述的不帶電荷脂質(zhì)體的相同方式，通過(guò)聚合引發(fā)劑進(jìn)行交聯(lián)使其穩(wěn)定。
這樣，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括的聚合脂質(zhì)體含有(a)一或多種如上所述的脂肪酸，它們可以任選被合適的聚合物間隔基、活化的連接劑以及一或多種外源凝集素導(dǎo)向的分子所取代；(b)此處所述的一或多種負(fù)電荷可聚合類脂；(c)一或多種非聚合脂肪酸或磷脂；以及(d)任選的膽固醇。聚合脂質(zhì)體優(yōu)選含有約0-15％的脂肪酸、約0-100％負(fù)電荷可聚合類脂和約0-50％的非聚合脂肪酸、磷脂或膽固醇；例如，DODPC／DODPG／定向脂肪酸／膽固醇／DSPC。
4．5．制劑／組合物本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體和定向聚合脂質(zhì)體用作藥物傳遞系統(tǒng)，特別是口服藥物傳遞系統(tǒng)的載體。本發(fā)明因此還包括使用這些聚合脂質(zhì)體的治療制劑和組合物。下面描述了可包封在本發(fā)明的脂質(zhì)體中從而形成治療劑組合物的代表性材料、包封這些材料的方法以及對(duì)病人給予治療劑組合物的給藥方式。
4．5．1．待包封材料本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體可用于疫苗、抗原、過(guò)敏素、診斷劑、治療劑和藥物的口服和／或粘膜傳遞。本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體可用來(lái)運(yùn)載許多抗原包括但不局限于白喉類毒素、流感血凝素、來(lái)自Lyme氏疏螺旋體病病原的ospA抗原和HTLV包膜蛋白抗原。許多種抗原的實(shí)例有脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、狂犬病、牛痘、E-B病毒、肝炎、HTLV、皰疹病毒和人類免疫缺陷病毒，它們可以包封在本發(fā)明的脂質(zhì)體中。
本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體可用于許多治療劑的口服和／或粘膜傳遞，它們包括但不局限于抗癌劑、抗生素、抗真菌劑、抗微生物劑、疫苗、胰島素、細(xì)胞因子、干擾素、荷爾蒙、降鈣素、生育藥物、抗病毒劑(ddI，AZT，ddc，阿昔洛韋等)、抗菌劑、DNA和RNA核苷酸，以用于基因治療。
此處所用術(shù)語(yǔ)“生物活性物質(zhì)”是指真核和原核細(xì)胞、病毒、載體、蛋白質(zhì)、肽、核酸、多糖和糖、類脂、糖蛋白和它們的組合物、合成的有機(jī)和無(wú)機(jī)藥物，當(dāng)給藥于動(dòng)物時(shí)，它們能產(chǎn)生生物效應(yīng)。作為一個(gè)簡(jiǎn)單參考，該術(shù)語(yǔ)還可用來(lái)包括可檢測(cè)化合物如不透射線化合物包括空氣和鋇、磁性化合物、熒光化合物和放射性化合物?；钚晕镔|(zhì)可以溶于或不溶于水。生物活性物質(zhì)的實(shí)例包括抗血管生成因子、抗體、抗原、生長(zhǎng)因子、荷爾蒙、酶和藥物如類固醇、抗癌藥或抗生素以及用作殺蟲(chóng)劑或昆蟲(chóng)驅(qū)逐劑的材料、肥料和維生素、或其它的需要控制釋放的具有生物活性的材料。
在一個(gè)診斷實(shí)施方案中，聚合脂質(zhì)體結(jié)合一藥學(xué)上可接受的γ-發(fā)射部分，包括但不局限于銦和锝、磁性顆粒、不透射線材料如空氣或鋇和熒光性化合物。
4．5．2．生物活性材料的包封在形成時(shí)材料通常結(jié)合到脂質(zhì)體上，然后超聲處理含有脂質(zhì)體的材料溶液，隨后通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體薄膜的再水化進(jìn)行聚合。
下面為制備聚合脂質(zhì)體的通用方法，其中，在聚合單體可聚合脂質(zhì)體前，包埋生物活性物質(zhì)。首先，可通過(guò)如上所述可聚合磷脂和脂肪酸混合物的薄膜水合來(lái)制備單體脂質(zhì)體。為形成薄膜，將單體磷脂和任選的可聚合脂肪酸或定向可聚合脂肪酸溶解于合適的有機(jī)溶劑如氯仿中，然后干燥該溶液從而形成磷脂薄膜?；蛘邔⒖删酆狭字?、脂肪酸和導(dǎo)向試劑的混合物溶于叔丁醇中。該混合物經(jīng)冷凍干燥產(chǎn)生容易再水合的粉末狀物質(zhì)，用于生成和包埋藥物或蛋白質(zhì)有效負(fù)載的脂質(zhì)體。加入含有待包埋物質(zhì)的溶液。在這個(gè)階段，優(yōu)選建立一個(gè)惰性氛圍。然后將類脂膜水合，在溫度約為30-50℃，通常40℃下輕輕搖晃并用超聲處理溶液5分鐘到2小時(shí)，優(yōu)選約5分鐘。一旦類脂膜水合，可以通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體溶液進(jìn)行一或多次凍融循環(huán)來(lái)提高脂質(zhì)體的包埋率。當(dāng)結(jié)合材料為親水性時(shí)尤其適用。此后，在溫度為25-40℃下，在自由基引發(fā)劑如二亞硫酸鈉和過(guò)硫酸鉀的存在下引發(fā)聚合，直至聚合基本完成。聚合度的理想值為30-100％。
未包埋的生物活性物質(zhì)可通過(guò)幾種方法除去，包括反復(fù)離心、傾析、凝膠過(guò)濾和滲析。然后將聚合脂質(zhì)體懸浮于緩沖液中。緩沖液的pH優(yōu)選為4．5-9．5，更優(yōu)選為生理pH。
優(yōu)選這種包埋生物活性物質(zhì)的方法，因?yàn)樗簧婕笆褂糜袡C(jī)溶劑。使用有機(jī)溶劑可能使生物活性物質(zhì)變性。此外，溫度條件溫和，典型地溫度不超過(guò)40℃。
材料可以包埋在脂質(zhì)體中，和／或一或多個(gè)磷脂雙層的類脂層中。通常這將取決于待結(jié)合材料的疏水／親水比值和制備方法。
4．5．3．給予病人聚合脂質(zhì)體的方式本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體通過(guò)一些途徑給藥，其中通過(guò)粘膜優(yōu)化吸收，例如口、舌下、頰下、直腸、陰道和鼻內(nèi)為優(yōu)選給藥途徑。然而，也可使用局部、透皮和胃腸外給藥。最優(yōu)選途徑為口服。此外，聚合脂質(zhì)體尤其適用于通過(guò)粘膜組織或上皮的傳遞。本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體可以片劑、膠囊、扁囊劑、gelcaps、溶液、懸浮液等形式口服給藥，此外，也可以為霜?jiǎng)?、軟膏、栓劑等。?dāng)劑量單位形式采用膠囊而且脂質(zhì)體含有抗原時(shí)，除了以上的各類材料外，還可含有液體載體或輔料。如果為局部給藥，脂質(zhì)體典型地以軟膏或透皮膏貼劑給藥。如果鼻內(nèi)給藥，脂質(zhì)體典型地以氣溶膠形式、噴劑、霧化劑或滴鼻劑的形式給藥。適用的制劑可在雷明頓藥物科學(xué)，第16版和第18版，Mack Publishing，Easton，PA(1980和1990)和藥物劑型介紹，第4版，Lea & Febiger，費(fèi)城(1985)中找到，結(jié)合在此以作參考。
本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體適用于哺乳類動(dòng)物，包括人，以及其它動(dòng)物和鳥(niǎo)類。例如，可以用本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體來(lái)處理和接種家養(yǎng)動(dòng)物如狗和貓，以及家禽、牛、羊、豬等。
本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體已經(jīng)用于疫苗的制備。制備含有作為活性組分的免疫原性多肽的疫苗已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉。
4．5．4．疫苗制劑制備合適的疫苗包括液體溶液或懸浮液；也可制備固體形式如膠囊和片劑、注射用液體?；钚悦庖咴M分通常與藥學(xué)上可接受的并與活性組分相容的賦形劑相混合。合適的賦形劑如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等和它們的組合。此外，如有需要，制備疫苗還可包括最小用量的輔料物質(zhì)如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖劑和／或能提高疫苗效率的輔料。
輔料的實(shí)例可以是有效，包括但并不局限于氫氧化鋁、胞壁酰二肽，包括N-乙酰基-胞壁?；?L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁?；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺、N-乙酰胞壁?；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥磷酰氧基)-乙胺、皂草苷、皂草苷衍生物和部分、QuilA、聚合物輔料，包括但不局限于環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物，單磷酰類脂A、類脂A的衍生物、霍亂毒素或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素、霍亂毒素和不穩(wěn)定毒素的無(wú)毒突變物。
輔料的效率可通過(guò)測(cè)量抗體或細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)作用來(lái)計(jì)算，即測(cè)定針對(duì)含有抗原決定基的免疫原多肽的細(xì)胞免疫力，由給予疫苗中的這種多肽所產(chǎn)生的抗體，疫苗中也含有各種輔料。
多肽可以中性或鹽的形式配制成疫苗。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(用多肽的自由氨基形成)和那些與無(wú)機(jī)酸如鹽酸或磷酸或有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸、馬來(lái)酸等作用生成的鹽。與游離羧基反應(yīng)生成的鹽還可源于無(wú)機(jī)堿，如鈉、鉀、銨、鈣、或鐵的氫氧化物和有機(jī)堿如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
本發(fā)明的疫苗可以是多價(jià)或一價(jià)。多價(jià)疫苗由病毒重組體制成，這些病毒直接表達(dá)多于一種的抗原。
許多方法可以用來(lái)導(dǎo)入本發(fā)明的疫苗制劑；這些包括但并不局限于口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、直腸和通過(guò)破皮(劃痕透過(guò)皮膚的頂層，如使用二分叉針)。
疫苗給藥的患者可以是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選為人，但也可以是非人哺乳動(dòng)物，包括但不局限于牛、馬、綿羊、豬、家禽(如雞)、山羊、貓、狗、倉(cāng)鼠、小鼠和大鼠。
本發(fā)明的疫苗制劑包含有效免疫量的抗原蛋白和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。制備的疫苗包含有效免疫量的一或多種抗原和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。藥學(xué)上可接受的載體為本領(lǐng)域所熟知，包括但不局限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、無(wú)菌等滲緩沖水溶液和它們的組合。這種可接受載體的一個(gè)實(shí)例為生理平衡培養(yǎng)基，它含有一或多種穩(wěn)定劑如穩(wěn)定的水解蛋白質(zhì)、乳糖等。載體優(yōu)選無(wú)菌。制劑應(yīng)適合給藥方式。
組合物如需要的話，還可含有最小用量的潤(rùn)濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或粉劑?？诜苿┛梢院袠?biāo)準(zhǔn)載體如藥用級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
通常，這些組分可以分別或混合在一起以單一劑型提供，如以凍干粉末或無(wú)水濃縮物存在于密封的容器如安瓿瓶或香囊(sachet)中，這意味著一定量的活性劑。如當(dāng)組合物通過(guò)注射給藥時(shí)，提供一安瓿的無(wú)菌稀釋劑以便在給藥前將各組分混合。
采用制劑的疫苗制備的精確劑量還取決于給藥的途徑、患者的病征，并取決于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)得到的醫(yī)生的判斷和患者的情況。采用疫苗制劑向宿主給藥時(shí)，有效免疫量應(yīng)足以使宿主對(duì)抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法使用純化抗原作為疫苗的制備。例如，純化蛋白質(zhì)應(yīng)調(diào)至合適的濃度，與合適的疫苗輔料一起調(diào)配并包封在聚合脂質(zhì)體中。合適的輔料包括但并不局限于礦物膠如氫氧化鋁，表面活性劑如溶血卵磷脂或多聚醇(pluronic polyols)，聚陰離子，肽，油乳液，明礬和MDP。免疫原也可結(jié)合到脂質(zhì)體中，或結(jié)合到多糖和／或用于疫苗配方的其它聚合物上。在重組抗原為半抗原即它是一個(gè)抗原性分子的情況下，它能選擇性地與同源抗體作用，但不是免疫原，因?yàn)樗荒苷T導(dǎo)免疫反應(yīng)，半抗原可以共價(jià)結(jié)合到載體或免疫原分子上；例如，大蛋白質(zhì)如血清白蛋白將免疫原性傳至與之連接的半抗原。半抗原載體可以配制用作疫苗。
本發(fā)明疫苗的有效劑量(免疫量)還可由源于動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線外推得到。
本發(fā)明因此提供了一種接種動(dòng)物、或處理或預(yù)防動(dòng)物的各種疾病或紊亂的方法，包括給予動(dòng)物有效免疫劑量的疫苗，該疫苗包封在本發(fā)明的聚合脂質(zhì)體中，通過(guò)下列的實(shí)例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的某些實(shí)施方案，但并不局限于此。
5． 實(shí)施例1(A)合成2，4-ODPEG2，4-ODPEG的合成如下。在惰性氣體(氬氣)下將50mg 2，4-十八碳二烯酸(2，4-OD)溶于5ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并連續(xù)攪拌。加入1．78g聚乙二醇(平均分子量為400)和217mg二甲氨基吡啶(DMAP)。然后加入410mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDCI)，該溶液在室溫下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)期間用鋁箔包住反應(yīng)容器以防止UV降解。通過(guò)加入幾毫升冰水驟冷反應(yīng)從而破壞剩余的EDCI。然后在真空下蒸掉DMF和水。
這樣得到化合物的提純分為兩步。首先，用蒸餾水(500ml)在Spectraphor滲析管(MWCO 500)進(jìn)行滲析提純。滲析過(guò)程總共重復(fù)四次。在真空下蒸發(fā)溶液然后通過(guò)反相色譜作進(jìn)一步提純。首先用水清洗該柱(RP18)，隨后用4∶1乙醇∶水的洗脫液洗脫含有ODPEG的部分。收集起來(lái)的部分在真空下蒸發(fā)，可得到收率為53％的2，4-ODPEG。產(chǎn)物2，4-ODPEG用薄層色譜(TLC)和紫外(UV)吸收光譜進(jìn)行分析(λmax＝255nm)。
合成2，4-ODPEG在氬氣下將110mg 2，4-十八碳二烯酸(2，4-OD)(NOF Corp．，Japan)、61mg二甲氨基吡啶(DMAP，Aldrich)和0．84g聚乙二醇(平均分子量為400，Aldrich)溶于7ml蒸餾過(guò)的二氯甲烷中并連續(xù)攪拌。然后加入72mg 1-乙基3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDCI)(Aldrich)(如有必要可以冷卻)，該溶液在室溫下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)期間用鋁箔包住反應(yīng)容器。隨后通過(guò)加入幾毫升水驟冷反應(yīng)。在減壓下除去有機(jī)溶劑。
這樣得到化合物的提純分為兩步。首先，用蒸餾水(500ml×4)在Spectra／Por滲析管(MWCO 500)進(jìn)行滲析提純。內(nèi)溶液經(jīng)冷凍干燥，得到的白色固體通過(guò)反相柱色譜作進(jìn)一步提純。該柱(RP-18，EMScience)用水洗脫，隨后用4∶1的乙醇∶水洗脫液洗脫。隨后濃縮收集到的部分再冷凍干燥，得到207mg(80％收率)的吸濕白色固體產(chǎn)物，其λmax＝266nm。
(C)合成2，4-ODPEGSu通過(guò)2，4-ODPEG與琥珀酸酐反應(yīng)制得2，4-ODPEG的琥珀酸衍生物(2，4-ODPEGSu)。首先，將41mg 2，4-ODPEG和25mg琥珀酸酐(Aldrich)溶于2ml二氯甲烷。加入8．3mg DMAP，在室溫下攪拌該反應(yīng)物，用氮?dú)膺M(jìn)行保護(hù)并用鋁箔緊密包封反應(yīng)容器，反應(yīng)24小時(shí)。通過(guò)加入幾毫升冰水驟冷該反應(yīng)，隨后在真空下蒸發(fā)至干。得到的產(chǎn)物首先通過(guò)如上所述的滲析和反相色譜，隨后通過(guò)第二次滲析步驟(MWCO 1000)進(jìn)行提純。產(chǎn)物在-20℃下冷凍干燥。在這個(gè)實(shí)施例中由2，4-ODPEG得到的2，4-ODPEGSu的收率為定量，因此在這個(gè)實(shí)施例中合成可聚合脂肪酸的總收率約為53％。
6．實(shí)施例2EEA與2，4-ODPEGSu的偶聯(lián)根據(jù)下面的方法將可聚合脂肪酸接合到外源凝集素上，并計(jì)算外源凝集素修飾的程度。
6．1．材料和方法EEA與2，4-ODPEGSu的偶聯(lián)通過(guò)下面方法將EEA偶聯(lián)到2，4-ODPEGSu上。將0．5mg 2，4-ODPEGSu溶于0．6ml、pH為5．4的MES緩沖劑(2-(N-嗎啉代)乙烷-磺酸鈉)(Aldrich)中。加入3mg N-辛基葡糖苷、5mg EDCI和11．5mg N-羥基磺基琥珀酰亞胺(NHS)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行5分鐘，并連續(xù)攪拌。然后，加入存在于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的1．46mg EEA和0．5ml的1摩爾HEPES緩沖劑。調(diào)節(jié)溶液pH至7．6，并在4℃下攪拌溶液過(guò)夜。產(chǎn)物在Spectra Por滲析管(MWCO-2000)中用0．2mM PBS(300ml×5)進(jìn)行總共用時(shí)30小時(shí)的滲析。將純化的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至管瓶并在4℃下保存直至進(jìn)一步使用。其它外源凝集素可以通過(guò)下面的相似方法連接到2，4-OSPEGSu上。
外源凝集素修飾的程度外源凝集素修飾程度的計(jì)算如下。制備5種貯備液溶液A0．1M在0．1M NaOH中的Na2B4O7溶液B0．1M NaH2PO4溶液C0．1M Na2SO3(在48小時(shí)內(nèi)制備)溶液D10ml溶液B+0．15ml溶液C
溶液E在5ml蒸餾水中的50ml TNBS其中，TNBS為2，4，6-三硝基-苯磺酸(SIGMA)，用溶液A稀釋0．685ml的2，4-ODPEGSu-EEA溶液(蛋白質(zhì)濃度為0．292mg／ml)至最終體積為1ml。往其中加入100μl的溶液E并劇烈攪拌。得到的溶液在40℃下溫育45分鐘，隨后通過(guò)加入1ml溶液D來(lái)終止反應(yīng)。通過(guò)在1ml的溶液A和1ml的溶液D中混合100μl的溶液E來(lái)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后通過(guò)在420nm時(shí)溶液的吸收來(lái)計(jì)算外源凝集素修飾的程度。在該實(shí)施例中的修飾程度為51％。
7．實(shí)施例3結(jié)合膜蛋白質(zhì)的可聚合脂質(zhì)體將DODPC溶于辛基葡糖苷，并將所需的肽溶于PBS。隨后將肽溶液加入滲析膜(MWCO=10000)內(nèi)部的類脂中并用PBS(2ml對(duì)1升)滲析約4小時(shí)，并兩次更換PBS。在滲析膜上自發(fā)生成脂質(zhì)體。這樣生成的脂質(zhì)體可用氧化還原偶聯(lián)引發(fā)劑(如NaHSO3和K2S2O8)來(lái)聚合。
8． 實(shí)施例4 聚合脂質(zhì)體含有可聚合類脂的類脂混合物經(jīng)凍干形成粉末材料，隨后用溶液再水化，該溶液含有所需的在脂質(zhì)體中待包封或結(jié)合到類脂雙層的肽或抗原。再水化的溫度高于該類脂混合物的熔點(diǎn)。然后將得到的脂質(zhì)體在45℃下進(jìn)行約5分鐘的超聲處理，將脂質(zhì)體的尺寸減少到約200nm的范圍。隨后該脂質(zhì)體的聚合采用任何熟知的技術(shù)。通過(guò)以約100000×g速度離心制備的脂質(zhì)體，游離肽可從脂質(zhì)體分離出來(lái)?；蛘?，聚合脂質(zhì)體可通過(guò)超濾柱來(lái)提純和濃縮含有肽的脂質(zhì)體。
優(yōu)選方法使用溶于叔丁醇的2，4-DODPC和外源凝集素修飾的2，4-ODPEGSu的混合物作為可聚合類脂混合物。在將所需肽或抗原的溶液進(jìn)行再水化后，脂質(zhì)體進(jìn)行超聲處理并使用二亞硫酸鈉(580μM)過(guò)硫酸鉀(127μM)氧化還原偶聯(lián)引發(fā)劑進(jìn)行聚合。
9．實(shí)施例5測(cè)量對(duì)包封于聚合脂質(zhì)體中的生物活性物質(zhì)的吸收可對(duì)大鼠口服給予含有125I-BSA的聚合脂質(zhì)體。然后可檢測(cè)血液對(duì)125I-BSA的吸收作用。含有單體脂質(zhì)體的125I-BSA和125I-BSA溶液用作對(duì)照。聚合脂質(zhì)體的制備如上所述。
每一個(gè)制劑，包括對(duì)照的125I-BSA溶液，都用ball-tipped針對(duì)胃內(nèi)給藥并且在適當(dāng)時(shí)間間隔后從尾靜脈抽取血液樣本。為區(qū)分在脂質(zhì)體中125I-BSA、游離的125I-BSA和125I-BSA的放射性標(biāo)記降解產(chǎn)物的運(yùn)輸，血液樣本分為三個(gè)部分1)細(xì)胞碎片部分，2)三氯乙酸(TCA)可沉淀部分和3)TCA非沉淀部分。
用水?dāng)噭虼笫蟮募S便并離心分離出固體。然后對(duì)比整個(gè)勻漿和沉淀固體的放射性。在用聚合脂質(zhì)體對(duì)大鼠給藥的例子中，比較單體脂質(zhì)體給予大鼠的量，可觀察到固體總放射量不同，這表明在胃腸道中聚合脂質(zhì)體相對(duì)穩(wěn)定。
由于在靜脈注射后血液中的可沉淀部分的消除要慢一些，所以動(dòng)物給藥材料在聚合脂質(zhì)體中時(shí)，與給藥材料在常規(guī)脂質(zhì)體中相比，TCA的非沉淀部分要少一些，與材料在溶液中給藥相比，減少十分明顯。
本發(fā)明并不局限于此處所述具體實(shí)施方案的范圍。的確，從前述可知，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，對(duì)本發(fā)明此處所述的各種改進(jìn)都是顯而易見(jiàn)的。這些改進(jìn)都在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
此處所引用的各種出版物，其公開(kāi)的全文結(jié)合在此作為參考。
權(quán)利要求
1．下式的可聚合化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽R4-X-PEG-Y-B其中R4為含有至少一個(gè)可聚合部分的親油性鏈；X和Y單獨(dú)或全部不存在或單獨(dú)或全部以化學(xué)穩(wěn)定鍵或連接部分存在；B為-O-C(O)-(CH2)pCO2H、C(O)NHR6、C(O)NH2或醛，其中p為0-12的整數(shù)而R6為C1-C5烷基；PEG為平均分子量約200-2000g／mol的聚乙二醇基團(tuán)。
2．權(quán)利要求1的可聚合化合物，其中所述R4為含有一或多個(gè)雙鍵、三鍵或硫醇基或其組合的親油性鏈。
3．權(quán)利要求1的可聚合化合物，其中所述的X和Y獨(dú)立選自醚鍵、酰胺鍵或酯鍵。
4．權(quán)利要求1的可聚合化合物，其中所述的B為羧酸基或NH2基。
5．權(quán)利要求1的可聚合化合物，其中所述的親油基為含有12-30個(gè)碳原子的烷基。
6．權(quán)利要求1的可聚合化合物，它進(jìn)一步包含共價(jià)連接到所述B部分的引導(dǎo)配體(targeting ligand)。
7．權(quán)利要求6的可聚合化合物，其中所述的引導(dǎo)配體為外源凝集素。
8．權(quán)利要求7的可聚合化合物，其中所述的外源凝集素為EEA、FITC-EEA、UEA-I或WGA。
9．包含約1-50％的權(quán)利要求1或6的可聚合脂肪酸的聚合脂質(zhì)體。
10．權(quán)利要求9中的聚合脂質(zhì)體進(jìn)一步包含疫苗、抗原或生物活性藥物和任選的膽固醇。
11．下式的可聚合脂肪酸CH3-(CH2)12-CH=CH-CH=CH-C(O)-(OCH2CH2)n-O-C(O)-CH2-CH2-CO2H，其中n為-OCH2CH2-單元的平均數(shù)，其值約為4-45，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
12．權(quán)利要求11的脂肪酸，其中n為-OCH2CH2-單元的平均數(shù)，其值約為6-12。
13．根據(jù)權(quán)利要求11的可聚合脂肪酸進(jìn)一步含有共價(jià)結(jié)合于所述可聚合脂肪酸的引導(dǎo)配體。
14．權(quán)利要求13的可聚合脂肪酸，其中所述引導(dǎo)配體為外源凝集素。
15．權(quán)利要求14的可聚合脂肪酸，其中所述外源凝集素為UEA、WGA、EEA或FITC-EEA。
16．含有一或多種可聚合類脂和下式的可聚合脂肪酸的聚合脂質(zhì)體CH3-(CH2)12-CH=CH-CH=CH-C(O)-(OCH2CH2)n-O-C(O)-CH2-CH2-CO2H，其中n為-OCH2CH2-單元的平均數(shù)，其值約為6-12。
17．含有一或多種可聚合類脂和共價(jià)結(jié)合于引導(dǎo)配體的可聚合脂肪酸的聚合脂質(zhì)體，所述可聚合脂肪酸的化學(xué)式為CH3-(CH2)12-CH=CH-CH=CH-C(O)-(OCH2CH2)n-O-C(O)-CH2-CH2-CO2H，其中n為-OCH2CH2-單元的平均數(shù)，其值約為6-12。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的聚合脂質(zhì)體，其中引導(dǎo)配體為外源凝集素。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的聚合脂質(zhì)體，其中外源凝集素為EEA、FITC-EEA、UEA或WGA。
20．根據(jù)權(quán)利要求16或17的聚合脂質(zhì)體，其中可聚合類脂為可聚合磷脂。
21．根據(jù)權(quán)利要求16或17的聚合脂質(zhì)體進(jìn)一步含有非聚合化合物。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的聚合脂質(zhì)體，其中非聚合化合物為膽固醇。
23．根據(jù)權(quán)利要求16或17的聚合脂質(zhì)體進(jìn)一步含有疫苗、抗原或生物活性藥物。
24．具有以下結(jié)構(gòu)的可聚合磷脂 其中，R、R’和R”中至少一個(gè)為可聚合基團(tuán)并且剩余基團(tuán)中至少一個(gè)選自磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酰絲氨酸。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的可聚合磷脂，其中R、R’和R”中至少一個(gè)為2，4-十八碳二烯?；?br> 26．用于口服藥物傳遞的聚合脂質(zhì)體，其包含(a)權(quán)利要求1的可聚合脂肪酸；和(b)權(quán)利要求24的可聚合磷脂。
27．權(quán)利要求26的聚合脂質(zhì)體進(jìn)一步包含膽固醇。
28．權(quán)利要求26的聚合脂質(zhì)體進(jìn)一步包含權(quán)利要求11的可聚合脂肪酸。
29．權(quán)利要求28的可聚合脂質(zhì)體進(jìn)一步包含膽固醇。
30．用于口服藥物傳遞的聚合脂質(zhì)體包含(a)權(quán)利要求11的可聚合脂肪酸；和(b)權(quán)利要求24的可聚合磷脂。
31．權(quán)利要求30的聚合脂質(zhì)體進(jìn)一步包含膽固醇。
32．權(quán)利要求30的聚合脂質(zhì)體進(jìn)一步包含外源凝集素。
33．權(quán)利要求26或30的聚合脂質(zhì)體進(jìn)一步包含疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種口服藥物傳遞體系,它利用新的聚合脂質(zhì)體將生物活性物質(zhì)傳遞到腸道的粘膜組織。公開(kāi)了新的可聚合脂肪酸,它具有一個(gè)可聚合基團(tuán)、一個(gè)表面活性劑基團(tuán)和一個(gè)官能團(tuán),并任選連接導(dǎo)向腸中粘膜組織的配體。還公開(kāi)了新的負(fù)電荷可聚合類脂,其可聚合主鏈上含有磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)或磷脂酰絲氨酸(PS)基團(tuán)。
文檔編號(hào)C11C3/00GK1294625SQ98813815
公開(kāi)日2001年5月9日 申請(qǐng)日期1998年12月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月31日
發(fā)明者R·N·布雷, L·梁 申請(qǐng)人:奧拉索梅爾技術(shù)公司