專利名稱：一種用于研究醋糟基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的總dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物與生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于研究醋糟無土栽培基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的總DNA提取方法。
背景技術(shù)：
微生物是無土栽培基質(zhì)中非常重要的組成部分，因而對(duì)無土栽培基質(zhì)中微生物的研究是無土栽培基質(zhì)研究領(lǐng)域內(nèi)一個(gè)重要的方向，對(duì)于促進(jìn)無土基質(zhì)栽培的發(fā)展具有十分重要的意義。常用的用于微生物群落研究的方法有培養(yǎng)分離法、磷脂脂肪酸法和BIOLOG板法等，但是上述方法都有各自的缺陷。培養(yǎng)分離法只適合可培養(yǎng)微生物的研究，由于環(huán)境中的微生物99%以上都是不可培養(yǎng)的，因而傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法大大限制了對(duì)微生物資源的研究。磷脂脂肪酸法所依賴的針對(duì)個(gè)別脂肪酸標(biāo)識(shí)物的細(xì)致描述也是源于少數(shù)可被分離的微生物的純培養(yǎng)。因此，在研究無法培養(yǎng)的菌群占絕大多數(shù)的微生物群落時(shí)，磷脂脂肪酸法也存在一定的局限性。另外，由于不同菌種相同脂肪酸的相互疊加，磷脂脂肪酸法也難于在種水平上辯明微生物群落的確切組成。不同的微生物對(duì)同一 C源的利用能力不同，微生物對(duì)不同單一 C源的代謝指紋差異并不能簡(jiǎn)單地歸納為微生物群落數(shù)量和結(jié)構(gòu)的差異，BIOLOG板法也不能準(zhǔn)確的反應(yīng)出環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用16S (18S) rRNA/rDNA序列分析技術(shù)，研究者可以在不對(duì)微生物進(jìn)行純培養(yǎng)的情況下對(duì)環(huán)境中的微生物進(jìn)行全面的研究，包括微生物的分離鑒定、群落結(jié)構(gòu)和功能的分析。而利用分子生物學(xué)的手段對(duì)環(huán)境中的微生物進(jìn)行研究，獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的DNA是應(yīng) 用16S (18S) rRNA/rDNA序列分析技術(shù)進(jìn)行環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)，常用的用于土壤和堆肥DNA提取的方法有液氮研磨法，SDS-反復(fù)凍融法、玻璃珠吸附法等。醋糟基質(zhì)是以制醋過程中產(chǎn)生的殘?jiān)自銥樵?，通過堆制發(fā)酵形成的新型園藝有機(jī)基質(zhì)，作為草炭的替代基質(zhì)，醋糟基質(zhì)在育苗和栽培中已經(jīng)得到廣泛使用，并投入了商品化生產(chǎn)。但目前對(duì)醋糟無土栽培基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化尚不清楚。利用16S (18S)rRNA/rDNA序列分析技術(shù)可解決這方面的問題。醋糟基質(zhì)作為一種堆肥產(chǎn)品，在堆制發(fā)酵的過程中會(huì)產(chǎn)生大量的腐殖酸，這些腐殖酸會(huì)對(duì)DNA的提取及PCR擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響。對(duì)腐殖酸的去除，常用的方法有硫酸鋁捕獲腐殖酸法、氯化銫密度梯度離心法，高效分子量排阻層析，試劑盒純化法。這些純化處理方法增加了復(fù)雜性，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因而尋求一種有效的獲取高質(zhì)量的DNA提取方法是利用分子生物學(xué)手段研究醋糟基質(zhì)栽培過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化所急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)醋糟基質(zhì)含有大量腐殖酸這一特點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)的土壤微生物基因組DNA提取方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過在DNA提取buffer中添加O. 5%的β -巰基乙醇和O. 5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對(duì)醋糟基質(zhì)中的腐殖酸和酚類物質(zhì)進(jìn)行了初步去除。用氯仿異戊醇(24: 1/v: V)抽提蛋白后，用2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對(duì)DNA中的腐殖酸和酚類物質(zhì)再次進(jìn)行去除。從而建立了一種高效、快速的可用于16S (18S) rDNA PCR擴(kuò)增的高質(zhì)量的醋糟基質(zhì)總DNA提取方法。為利用分子生物學(xué)的手段研究醋糟基質(zhì)中微生物的群落結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種用于研究醋糟基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的總DNA提取方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行
(1)先在醋糟基質(zhì)中加入DNA提取緩沖液和蛋白酶K，振搖，使醋糟基質(zhì)中的微生物充分懸浮在DNA提取緩沖液中，優(yōu)選DNA提取緩沖液的配方為10 mM Tris-Hcl (pH 8. O)，100mM Sodium EDTA(pH 8·O)，100 mM Sodium phosphate (pH 8.0)，1. 5 M Nacl，1% CTAB,
0.5% β-巰基乙醇和0.5% PVP，優(yōu)選蛋白酶K用量為蛋白酶K的濃度為20 mg/ ml，加入量為 12. 5 μ I ；
(2)將步驟(I)制得的懸浮液用十二烷基磺酸鈉裂解醋糟基質(zhì)中的微生物，離心后取上清，優(yōu)選十二烷基磺酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% ；
(3)加入與步驟(2)取得的上清液等體積的氯仿-異戊醇混合液抽提蛋白，其中氯仿異戊醇體積比=24:1，離心后取上清；
(4)加入與步驟(3)取得的上清液等體積的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，去除腐殖酸和酚類物質(zhì)，離心后取上清，優(yōu)選聚乙烯聚吡咯烷酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% ；
(5)將裝有步驟(4)中取得 的上清液的離心管上下輕微的搖動(dòng)，直至離心管中可見絮狀物質(zhì)，將離心管置于-20 °C沉淀20 min ；
(6)用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇沉淀DNA后，用去離子無菌水溶解DNA，并用RNA酶去除DNA中的RNA。上述用于研究醋糟無土栽培基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的總DNA提取方法優(yōu)選技術(shù)方案如下
(I)稱取0.5 g醋糟基質(zhì)于10 ml無菌的離心管中，在離心管中加入2. 5 ml提取緩沖液，優(yōu)選配方為10 mM Tris-Hcl pH 8. 0,100 mM Sodium EDTA pH 8. 0,100 mM Sodiumphosphate pH 8. 0，1. 5 M Nac1,1% CTAB,0. 5% β-巰基乙醇，0.5% PVP, 12. 5 μ I 蛋白酶K(20 mg/ ml)。(2)將上述離心管于37°C, 225 rpm的搖床搖30 min。(3)將從搖床取出的離心管中加入250 μ I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的十二烷基磺酸鈉(SDS)，用渦旋儀渦旋10 s后，將離心管于65°C水浴lh，期間每15-20 min搖動(dòng)一次。水浴后將離心管于4°C、10 000 g的離心機(jī)中離心10 min，取上清于新的離心管中。(4)向沉淀中加入1. 25 ml提取緩沖液及125 μ I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的十二烷基磺酸鈉(SDS)，用渦旋儀渦旋10 s,65 °C水浴30 min后，4 V、10 000 g離心10 min，取上清于步驟(3)的新管中。將兩次提取的上清液混合到一起。(5)在混合后的上清液中加入等體積的氯仿異戊醇(24: l/ν: V)，用渦旋儀渦旋30 s充分混勻后，4 0CUO 000 g離心10 min。取上清于新管。(6)重復(fù)步驟(5) I次。
(7)在步驟(6)取得的上清液中加入等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP), 4 °C > 10 000 g離心10 min,取上清于新管。(8)在上清液中加入等體積預(yù)冷的異丙醇，將離心管輕微的上下?lián)u動(dòng)，直至離心管中可見絮狀物質(zhì)，將離心管置于-20 °C沉淀10 min。(9)取出離心管后12 000 g離心10 min，棄上清，在離心管中加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇I ml,洗漆10 min后，12 000 g離心10 min,棄上清,得到DNA沉淀。(10)重復(fù)步驟(9) I次。(11)將沉淀冷凍干燥30 min后，加入120 μ I去離子無菌水和20 μ I核糖核酸酶(RNA酶)溶解DNA沉淀。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明在DNA提取過程中，不需用液氮研磨樣品，不需對(duì)樣品進(jìn)行反復(fù)凍融，縮短了DNA提取時(shí)間。在提取過程中，DNA提取buffer中添加O. 5%的β -巰基乙醇和O. 5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對(duì)醋糟基質(zhì)中的腐殖酸和酚類物質(zhì)進(jìn)行了初步去除。在DNA用氯仿異戊醇(24: 1/ν: V)抽提蛋白后，用2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對(duì)DNA中的腐殖酸和酚類物質(zhì)再次進(jìn)行了去除，從而獲得了高質(zhì)量的，無需再用DNA試劑盒進(jìn)行純化的，可直接用于16S (18S) rRNA/rDNA序列分析的DNA。建立了一套可用于醋糟基質(zhì)中微生物分子生態(tài)學(xué)研究的快速、高質(zhì)的DNA提取方法。



圖1本發(fā)明方法提取醋糟基質(zhì)總DNA電泳圖，其中1-6為醋糟樣品，M為Markerλ DNA/Hind III。圖2以本發(fā)明方法提取醋糟基質(zhì)總DNA為模板進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖，其中 1-24 為醋糟 16S rDNA PCR 擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物，M 為 Marker DL 2000。圖3以本發(fā)明方法提取醋糟基質(zhì)總DNA為模板進(jìn)行18S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖，其中 1-24 為醋糟 18S rDNA PCR 擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物，M 為 Marker DL 2000。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例說明本發(fā)明的具體步驟，但不受實(shí)施例限制。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實(shí)施例并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。實(shí)施例1、醋糟基質(zhì)中總DNA的提取
(I)稱取O. 5 g醋糟基質(zhì)于10 ml無菌的離心管中，在離心管中加入2. 5 ml提取buffer再加12. 5 4 1蛋白酶1((20 mg/ ml)。其中DNA提取buffer的配方為10 mMTris-Hcl(pH 8. O), 100 mM Sodium EDTA( pH 8. O), 100 mM Sodium phosphate (pH 8.0),1.5 M Nacl，1% CTAB，0. 5% β -巰基乙醇，0. 5% PVP。(2)將上述離心管于37°C, 225 rpm的搖床搖30 min。
(3)將從搖床取出的離心管中加入250 μ I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的SDS，用渦旋儀渦旋10 S混勻后，將離心管于65°C水浴lh，期間每15-20 min搖動(dòng)一次。水浴后將離心管于4°C, 10 000 g離心10 min,取上清于新的離心管中。(4)向沉淀中再加入1. 25 ml提取buffer及125 μ I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的SDS。用渦旋儀渦旋10 s混勻，65°C水浴30 min后，4 °C, 10 000 g離心10 min，取上清于步驟
(3)的新管中。將兩次提取的上清液混合到一起。(5)在混合后的上清液中加入等體積的氯仿異戊醇(24: Ι/v: V)，用渦旋儀渦旋30 s充分混勻后，于4°C, 10 000 g離心10 min。取上清于新管。(6)重復(fù)步驟(5) I次。(7)在步驟(6)取得的上清液中加入等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),4 °C, 10 000 g離心10 min,取上清于新管。(8)在上清液中加入等體積預(yù)冷的異丙醇，將離心管輕微的上下?lián)u動(dòng)，直至離心管中出現(xiàn)絮狀物質(zhì)，將離心管置于-20 °C沉淀20 min。(9) 12000 g離心10 min，棄上清，在離心管中加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇I ml，洗漆10 min后，12000 g離心10 min,棄上清,得到DNA沉淀。(10)重復(fù)步驟(9) I次。(11)將沉淀冷凍干燥30 min后，加入120 μ I去離子無菌水和20 μ I核糖核酸酶(RNA酶)溶解沉淀。實(shí)施例2、DNA的電泳檢測(cè)和PCR擴(kuò)增
將實(shí)施例1得到的總DNA，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，所用的分子量標(biāo)記(Marker )為λ DNA/Hind III，電泳緩沖液為I X TAE，所用電壓為10 V/cm，電泳30min后，將瓊脂糖凝膠在凝聚成像系統(tǒng)中拍照，得到DNA的電泳圖(如圖1所示)。DNA條帶
單一，沒有拖尾。用細(xì)菌的16S rDNA和真菌的18S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)。其具體步驟如下
(I)選擇細(xì)菌 16S rDNA 擴(kuò)增的常用引物對(duì) F341 :5’- CCT ACG GGA GGC AGC AG -3’(SEQ ID No. 1)，907R :5，-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3，(SEQ ID No. 2)，作為擴(kuò)增引物。
50μ I PCR 反應(yīng)體系為10 X PCR Buffer (含 mg2+ )溶液 5 μ l,dNTP 10 mM Ιμ ，上游引物10 PM I μ 1，下游引物10 PM I “1，了&9酶5~4 1 O. 5 yl，DNA模板I μ ，無菌/K 40. 5 μ I。PCR 運(yùn)行程序預(yù)變性94 °C，5 min ;變性94 °C,45 s ;退火56 °C,40 S，延伸72 °C,40 s ;共35個(gè)循環(huán)；總延伸72 V, 7 min。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，所用的分子量標(biāo)記(Marker)為DL2000，電泳緩沖液為I X TAE，所用電壓為10 V/cm， 電泳30 min后，將瓊脂糖凝膠在凝聚成像系統(tǒng)中拍照，得到PCR產(chǎn)物電泳圖如圖2所示。(2)選擇真菌 18S rDNA 擴(kuò)增的常用引物對(duì) NSl :5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCTC-3’ (SEQ ID No. 3), FUNG 5' -ATT CCC CGT TAC CCG TTG -3’ (SEQ ID No. 4)，作為擴(kuò)增的引物。50 μ I 的反應(yīng)體系10 X PCR Buffer (含mg2+)溶液5 μ l,dNTP 10 mM 1μ I,上游引物10 ρΜ I μ 1，下游引物10 ρΜ I “1，了&9酶5~4 1 O. 5 yl，DNA模板I μ ，無菌水 40. 5 μ I。PCR 運(yùn)行程序預(yù)變性94 °C，5 min ;變性94 °C, 30 s ;退火57 °C,60S，;延伸72 °C,60 S，共 35 個(gè)循環(huán)；總延伸72 °C, 10 min。將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，所用的分子量標(biāo)記(Marker)為DL2000，電泳緩沖液為1XTAE，所用電壓為10 V/cm,電泳30 min后，將瓊脂糖凝膠在凝聚成像系統(tǒng)中拍照，得到PCR產(chǎn)物電泳圖如圖3所示。從圖2和圖3可見，用16S rDNA和18S rDNA均能成功的從醋糟基質(zhì)中提取的DNA中擴(kuò)增出各自的目的條帶，且條帶明亮、單一，擴(kuò)增特異性強(qiáng)，條帶長(zhǎng)度分別為500多bp和300多bp。這充分說明本發(fā)明非常適合用于從醋糟基質(zhì)中獲得高質(zhì)量的DNA，可供研究者用分子生物學(xué)手段研究醋糟基質(zhì)中的微生物群落 結(jié)構(gòu)。序列表
Organization Applicant
Street :江蘇鎮(zhèn)江市京口區(qū)學(xué)府路301號(hào)
City :鎮(zhèn)江市
State :江蘇省
Country :中國
PostalCode : 212013
PhoneNumber : 0511-88795397
FaxNumber :
EmailAddress :
<110> OrganizationName :江蘇大學(xué)
Application Project
〈120〉Title : 一種用于研究醋糟基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的總DNA提取方法〈130〉A(chǔ)ppFileReference :
<140> CurrentA ppNumber :
<141> CurrentFilingDate :
Sequence
〈210〉SEQ ID No.1〈213 > OrganismName :
<400> PreSequenceString :
CCT ACG GGA GGC AGC AG〈212〉 Type : DNA〈211〉 Length : 17
SequenceName: F341 SequenceDescription :
Sequence
〈210〉SEQ ID No. 2〈213 > OrganismName :
<400> PreSequenceString :
CCGTCAATTCCTTTGAGTTT〈212〉 Type : DNA
權(quán)利要求
1.一種用于研究醋糟基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的總DNA提取方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行(1)先在醋糟基質(zhì)中加入DNA提取緩沖液，并加入蛋白酶K，振搖，使醋糟基質(zhì)中的微生物充分懸浮在DNA提取緩沖液中；(2)將步驟(I)制得的懸浮液用十二烷基磺酸鈉裂解醋糟基質(zhì)中的微生物，離心后取上清；(3)加入與步驟(2)取得的上清液等體積的氯仿-異戊醇混合液抽提蛋白，其中氯仿 異戊醇體積比為24: 1，離心后取上清；(4)加入與步驟(3)取得的上清液等體積的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，去除腐殖酸和酚類物質(zhì)，離心后取上清；(5)將裝有步驟(4)中取得的上清液的離心管上下輕微的搖動(dòng)，直至離心管中可見絮狀物質(zhì)，將離心管置于-20 °C沉淀20 min ；(6)用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇沉淀DNA后，用去離子無菌水溶解DNA，并用RNA酶去除DNA中的RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述DNA提取緩沖液的配方為10 mM Tris-Hcl (pH 8.0),100 mM Sodium EDTA(pH 8.0),100 mM Sodium phosphate (pH8.0)，1. 5 M Nacl，1% CTAB，0. 5% β -巰基乙醇和 0. 5% PVP。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述蛋白酶K的濃度為20mg/ ml, 加入量為12. 5 μ I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方，其特征在于所述十二烷基磺酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述聚乙烯聚吡咯烷酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種用于研究醋糟基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)的總DNA提取方法。本發(fā)明先在醋糟基質(zhì)中加入含有0.5%的β-巰基乙醇和0.5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的DNA提取緩沖液，并加入蛋白酶K，放置37℃搖床搖30min，使基質(zhì)中的微生物充分溶解在DNA提取緩沖液中后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液裂解醋糟基質(zhì)中的微生物細(xì)胞，用氯仿:異戊醇(24:1)抽提去除蛋白，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)去除腐殖酸、酚類物質(zhì)后，用預(yù)冷的異丙醇沉淀，最后得到高質(zhì)量的可直接用于PCR擴(kuò)增的DNA。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103045585SQ20121057128
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者李萍萍, 林英, 趙青松, 杜道林, 王紀(jì)章 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)