人miR-1908在制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明基于基因工程領(lǐng)域，公開了人miR-1908在制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案為人miR-1908在制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的研究結(jié)果表明在人脂肪細(xì)胞中過表達(dá)miR-1908可以明顯促進(jìn)脂肪細(xì)胞的增殖速度和細(xì)胞個數(shù)，可用于制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖的藥物。
【專利說明】AmiR-1908在制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及人miR-1908在制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肥胖已成為危害全球人類健康的重要問題之一，受到社會的廣泛關(guān)注。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活方式改變，中國的肥胖人口也急劇增長，且低齡化趨勢十分突出。肥胖相關(guān)的各種并發(fā)癥，如高血壓、糖尿病和心腦血管疾病等，嚴(yán)重威脅著人類健康?！缎掠⒏裉m醫(yī)學(xué)雜志》一項(xiàng)調(diào)查顯示中國糖尿病發(fā)病率已高達(dá)10%，且很大程度與肥胖有關(guān)。肥胖的科學(xué)治療及其并發(fā)癥的防治已成為臨床醫(yī)生面臨的挑戰(zhàn)。目前已知肥胖是機(jī)體在遺傳、環(huán)境、行為因素或三者相互作用下能量代謝失衡的結(jié)果，并且隨著遺傳學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展，遺傳因素在肥胖發(fā)生中的重要性已倍受重視。已有研究結(jié)果指出，肥胖發(fā)生的病因中遺傳因素占40-70%,開展肥胖病因的遺傳學(xué)研究十分重要。
[0003]在前期研究工作中，發(fā)明人采用采用miRNA芯片(miRNA Array)技術(shù)篩選人脂肪
細(xì)胞分化前后的差異表達(dá)miRNA，獲得一條特異高表達(dá)于成熟脂肪細(xì)胞的miRNA-------人
miR-1908，提示其可能與肥胖的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。該miRNA位于人的第11號染色體上FADSl基因的第一個內(nèi)含子內(nèi)，屬于基因內(nèi)(Introgenic)miRNA。但目前沒有關(guān)于人miR-1908在脂肪細(xì)胞中的功能報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是 提供人miR-1908在制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0005]發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)人miR-1908過表達(dá)組的細(xì)胞增殖速度明顯快于空載對照組細(xì)胞，細(xì)胞個數(shù)明顯增加，人miR-1908過表達(dá)組的脂肪細(xì)胞中S期細(xì)胞比例顯著高于空載對照組，表明染色質(zhì)合成期細(xì)胞較多，細(xì)胞增殖速度加快，可見人miR-1908能夠顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖，因此，本發(fā)明提出了人miR-1908在制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的技術(shù)方案。
[0006]本發(fā)明的有益效果:
[0007]本發(fā)明檢測了人miR-1908過表達(dá)對脂肪細(xì)胞增殖功能的影響，顯示過表達(dá)miR-1908能促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖(細(xì)胞個數(shù)增多且增殖速度加快)，可用于制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖的藥物，為研究肥胖的發(fā)生發(fā)展提供了新的研究手段。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1:pGLV-Hl-GFP/Puro載體圖譜、插入位點(diǎn)及人miR-1908過表達(dá)慢病毒載體酶切及測序鑒定結(jié)果。
[0009]圖2:人miR-1908過表達(dá)慢病毒感染人脂肪前體細(xì)胞株的鑒定。
[0010]圖3:人miR-1908過表達(dá)的脂肪細(xì)胞和對照細(xì)胞生長曲線圖。[0011]其中:pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro:miR-1908 過表達(dá)的前體脂肪細(xì)胞，pGLV-Hl-GFP/Puro:空載轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞。
[0012]圖4:人miR-1908的脂肪細(xì)胞和對照細(xì)胞0、24、48小時細(xì)胞各周期分布圖。
[0013]其中:pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro:miR-1908 過表達(dá)的前體脂肪細(xì)胞，pGLV-Hl-GFP/Puro:空載轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞，Gl:染色質(zhì)合成前期，S:染色質(zhì)合成期，G2/M:染色質(zhì)合成后期及分裂期。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
[0015]實(shí)施例1
[0016]1.材料和方法
[0017]1.1 試驗(yàn)材料:人前體脂肪細(xì)胞株(Human Preadipocytes-visceral, HPA_v)購自美國Sciencell公司。本實(shí)驗(yàn)所需的pGLV-Hl-GFP/Puro質(zhì)粒購自上海吉瑪公司，包裝質(zhì)粒 Pcgvp> Rev、Vsvg 購自美國 Allele Biotech&Pharmaceuticals 公司；pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro慢病毒載體有本實(shí)驗(yàn)小組自行構(gòu)建；RNA抽提試劑盒購自德國Qiagen公司，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA檢測試劑盒、TanMan基因表達(dá)mix II購自美國 ABI 公司，TaKaRa LA Taq? DNA Polymerase Hot-Start Version PCR 試劑盒購自日本Takara公司，脂肪細(xì)胞專有培養(yǎng)基7211購自美國Sciencell公司，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購自美國NEB公司，引物有美國Invitrogen公司合成。
[0018]1.2實(shí)驗(yàn)方法:
[0019](一)人miR-1908minigene的擴(kuò)增及人miR-1908慢病毒過表達(dá)載體(pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro)的構(gòu)建
[0020](I).DNA提取:按照以下步驟提取基因組DNA(德國Qiagen公司QIAamp DNAMiniKit)
[0021 ] I)取4ml離心管一只，加入600 μ I核裂解液，冰上冷卻。
[0022]2)加入10_20mg解凍的人脂肪組織，勻漿機(jī)勻漿10秒。將裂解物移至1.5ml離心
管中。65°C孵育30分鐘。
[0023]3)待樣品達(dá)到室溫后，加入200 μ I蛋白沉淀液，潤旋震湯20秒，直于冰上冷卻5分鐘。
[0024]4) 13，OOOXg離心4分鐘，可見白色沉淀。將上清移至一新離心管中。
[0025]5)加入600ul異丙醇，輕輕顛倒混勻溶液，直至白色線狀DNA形成。13，OOOXg離心I分鐘,棄去上清。
[0026]6)加入600ul室溫70%乙醇,輕輕顛倒離心管數(shù)次,13，OOOXg離心I分鐘，小心棄去上清。將離心管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥10-15分鐘。
[0027]7)向離心管中加入50 μ I雙蒸水，65°C孵育I小時，以充分溶解DNA，4°C保存。
[0028](2)人 miR_1908minigene 的擴(kuò)增
[0029](2.1)通過miRBase數(shù)據(jù)庫獲得人miR-1908的前體pre-miRNA_1908的序列；在NCBIblast中比對查找其所在的基因組序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)規(guī)則，采用Primerf軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增包括pre-miR-1908在內(nèi)的序列，并在其上游和下游分別引入BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)，上游引物(含BamHI位點(diǎn)，下劃線區(qū)域)5’ -GCCGGATCCCCACTGTCCCTATCCA-3 ’ ；下游引物(含EcoRI 位點(diǎn)，下劃線區(qū)域)5’ -ACCGAATTCGGCACTTCTGCGTTT-3?,目的基因長度為 537bp。(PCR試劑盒:TaKaRa LA Taq? DNA Polymerase Hot-Start Version, Takara)
【權(quán)利要求】
1.人miR-1908在制備促進(jìn)脂 肪細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P3/00GK103446592SQ201310361927
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月19日
【發(fā)明者】沈嶸, 倪毓輝, 郭錫熔, 季晨博, 楊蕾, 史春梅, 崔縣偉, 付子毅, 苗苗 申請人:南京市婦幼保健院