專利名稱：用于誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖的方法以及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及療法(治療)領(lǐng)域，并且尤其涉及用于誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化和肝再生的方法。
現(xiàn)有技術(shù) 以下是被認(rèn)為對于描述本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)狀態(tài)相關(guān)的技術(shù)的清單。本文中有時(shí)將通過在括號內(nèi)指出它們的編號(來自以下清單)來對這些參考文獻(xiàn)進(jìn)行致謝。
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背景技術(shù)：
除腦以外，肝是僅有的重要器官，對其沒有藥理、機(jī)械、或體外方式來支持衰退的器官，如針對肺、腎以及心臟所發(fā)現(xiàn)的。肝還是獨(dú)特的，因?yàn)樗莾H有的哺乳動物器官，在切除或損傷以后其可以再生它的生物功能實(shí)質(zhì)質(zhì)量(薄壁組織質(zhì)量)，而不是借助于生物上無功能的瘢痕組織加以愈合。
在過去的10年中肝切除術(shù)已變得安全，這是由于術(shù)前診斷、手術(shù)技術(shù)以及術(shù)后護(hù)理的改善。術(shù)后死亡率直接與術(shù)前肝功能和切除的肝體積有關(guān)。在具有正常肝實(shí)質(zhì)的患者中，殘余肝臟的功能快速恢復(fù)，因?yàn)楦渭?xì)胞會增殖以恢復(fù)體積的損失。然而，在存在實(shí)質(zhì)性肝病的條件下，如在患有肝硬化、嚴(yán)重肝脂肪變性或結(jié)腸直腸肝轉(zhuǎn)移、在肝切除術(shù)以前由于新輔助化學(xué)療法而導(dǎo)致虛弱的患者中，肝細(xì)胞增殖會受損，這使患者暴露于肝功能障礙和有關(guān)的并發(fā)癥，以肝切除術(shù)后肝衰竭為終結(jié)，其具有高死亡率(60-90％)。
在再生肝方面，已鑒定了多種途徑，包括細(xì)胞因子途徑，其很大程度上負(fù)責(zé)肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期(從G0過渡到G1)，一種稱作引發(fā)的過程；以及生長因子途徑，其負(fù)責(zé)細(xì)胞周期進(jìn)展(G1期到S期)。
此外，肝的局部缺血-再灌注損傷是另一種已知的、外科手術(shù)的臨床意義的表現(xiàn)，如肝移植和部分肝切除(1)。在局部缺血再灌注損傷以后，存在肝損傷的兩個(gè)不同時(shí)期。初期(再灌注以后＜2h)的特征在于氧化應(yīng)激，其中活性氧物質(zhì)(ROS)的生產(chǎn)和釋放似乎直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。后期(再灌注以后6-48h)是由征集的中性白細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞)所介導(dǎo)的炎性障礙。活化的肝巨噬細(xì)胞(枯否細(xì)胞，Kupffer cell)與中性白細(xì)胞的產(chǎn)物之間的相互關(guān)系，如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1、一氧化氮(NO)以及白三烯，與肝局部缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制有關(guān)(2)。TNF-α的生物效應(yīng)從誘導(dǎo)細(xì)胞死亡延伸到促進(jìn)細(xì)胞再生。
確實(shí)，最近的研究已表明，在部分肝IR損傷的鼠科動物模型中，在隨后的局部缺血再灌注的2h內(nèi)，局部缺血預(yù)處理可以伴隨肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期(11)。
腺苷，通過其與選擇性G蛋白相關(guān)的膜受體的結(jié)合，命名為A1、A2A、A2B以及A3，在局部缺血以后能細(xì)胞外積累，并且已知能提供細(xì)胞保護(hù)。尤其是，已發(fā)現(xiàn)A3AR涉及介導(dǎo)心臟神經(jīng)和化療保護(hù)(3-7)。
已提出A3腺苷受體，一種Gi蛋白相關(guān)的細(xì)胞表面受體，作為對抗癌癥和炎癥的標(biāo)靶。該受體在各種腫瘤細(xì)胞類型中被高度表達(dá)，而在相鄰的正常組織中則呈現(xiàn)低表達(dá)。體內(nèi)研究已表明，A3AR激動劑會抑制結(jié)腸、前列腺和胰腺癌以及黑色素瘤和肝細(xì)胞癌的發(fā)展。
A3AR激動劑還表明可以作為抗炎劑，其中通過在不同實(shí)驗(yàn)性自身免疫性模型中改善炎癥過程，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化以及克羅恩氏病。
此外，A3AR激動劑已經(jīng)顯示出對腫瘤和正常細(xì)胞生長具有不同的效應(yīng)。雖然A3AR的激活會抑制各種腫瘤細(xì)胞系的生長，但它會刺激正常細(xì)胞如骨髓細(xì)胞的增殖(8-10)。
目前，在這種重要器官的急性或慢性損傷以后，沒有藥物干預(yù)被證明減弱肝細(xì)胞損傷或增加肝的組織再生。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于由在大鼠中用Cl-IB-MECA(一種特異性和選擇性A3AR激動劑)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)所獲得的以下發(fā)現(xiàn) -在部分肝切除術(shù)以后，用Cl-IB-MECA進(jìn)行的治療會誘導(dǎo)肝細(xì)胞的增殖； -在部分肝切除術(shù)以后，用Cl-IB-MECA進(jìn)行的治療會降低肝酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的血清水平； -在部分肝切除術(shù)以后，用Cl-IB-MECA進(jìn)行的治療會增加經(jīng)歷有絲分裂的肝細(xì)胞的數(shù)目； -用Cl-IB-MECA進(jìn)行的治療會增加增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽性細(xì)胞的數(shù)目(與細(xì)胞增殖的程度有關(guān)的表達(dá))； -用Cl-IB-MECA進(jìn)行的治療會增加肝重量。
基于以上發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)得出以下結(jié)論A3AR激動劑可以用于誘導(dǎo)肝細(xì)胞的增殖和肝再生。
因此，根據(jù)第一個(gè)方面，提供了一種刺激肝細(xì)胞增殖的方法，包括使肝細(xì)胞與有效量的A3AR激動劑接觸以刺激肝細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明的披露內(nèi)容進(jìn)一步提供了一種A3AR激動劑，其用于刺激肝細(xì)胞增殖的方法中。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的披露內(nèi)容提供了一種用于治療患有肝損傷(例如由疾病，如肝硬化引起的，由手術(shù)治療引起的，例如起因于肝切除術(shù)和其它)患者的方法中的A3AR激動劑。
本發(fā)明的披露內(nèi)容還提供了A3AR激動劑在用于制備治療患者體內(nèi)的肝損傷的藥物中的應(yīng)用。
另外，本發(fā)明的披露內(nèi)容提供了一種用于刺激肝細(xì)胞增殖的藥物組合物，包括有效刺激肝細(xì)胞增殖的量的A3AR激動劑。本發(fā)明的披露內(nèi)容還提供了一種用于治療肝損傷的藥物組合物，包括有效刺激肝細(xì)胞增殖的量的A3AR激動劑。
在一種實(shí)施方式中，A3AR激動劑是2-氯-N6-(3-碘芐基)-腺苷-5’-N-甲基-糖醛酰胺(uronamide)(Cl-IB-MECA)，而在另一種實(shí)施方式中，A3AR激動劑是N6-(3-碘芐基)-腺苷-5’-N-甲基-糖醛酰胺(IB-MECA)。然而，這些目前優(yōu)選的A3AR激動劑決不是排他性的并且還可以使用其它這樣的A3AR激動劑，如下文進(jìn)一步詳述的。
在本發(fā)明披露內(nèi)容的上下文內(nèi)，通過使用A3AR激動劑，可以治療各種病癥，其中肝或肝細(xì)胞在肝損傷、肝切除術(shù)、疾病引起的或感染引起的肝損傷以后受到損傷。



為了理解本發(fā)明以及明了如何實(shí)際上實(shí)施本發(fā)明，現(xiàn)在將僅通過非限制性實(shí)例并參照附圖來描述實(shí)施方式，其中 圖1是示出了在部分肝切除術(shù)以后在經(jīng)歷肝再生的大鼠的肝中Cl-IB-MECA(治療)對肝細(xì)胞增殖的影響的條形圖； 圖2A和圖2B是條形圖，其示出了在部分肝切除術(shù)以后2、4和48小時(shí)，與對照大鼠相比，在用Cl-IB-MECA治療的大鼠中，肝酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨移酶(ALT)(圖2A)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)(圖2B)的血清水平。
圖3是示出了與未治療大鼠(天然的(未實(shí)驗(yàn)的))或用載體治療的大鼠(載體)相比，在經(jīng)歷部分肝切除術(shù)并用Cl-IB-MECA治療的大鼠中肝酶AST和ALT的血清水平的條形圖。
圖4是示出了與用載體治療的大鼠(載體)相比，在經(jīng)歷部分肝切除術(shù)并用CI-IB-MECA治療的大鼠中肝細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)的條形圖。
圖5A-5B是示出了在部分肝切除術(shù)以后48小時(shí)在僅用載體治療(圖5A，載體)或用Cl-IB-MECA治療(圖5B)以后肝細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)染色的顯微圖像。
圖6是示出了在Cl-IB-MECA治療大鼠中或在僅用載體治療大鼠中(載體)，在部分肝切除術(shù)以后24和48小時(shí)的肝重量(再生％)的條形圖。

具體實(shí)施例方式 在以下詳細(xì)描述中參照用于刺激肝細(xì)胞增殖和肝再生的方法描述了本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，除所述方法之外，在本發(fā)明內(nèi)還包括A3AR激動劑，用于刺激肝細(xì)胞增殖和肝再生的方法；A3AR激動劑在用于制備給予需要刺激肝細(xì)胞增殖和肝再生的受治療者的藥物組合物中的應(yīng)用；以及藥物組合物，用于刺激肝細(xì)胞增殖和肝再生，其包括有效量的A3AR激動劑和藥用載體。
除非上下文另有明確指明，否則如在本說明書和權(quán)利要求中所使用的，“一個(gè)”、“一種”以及“該”的形式包括單數(shù)和復(fù)數(shù)指稱。例如，術(shù)語“一種A3AR激動劑”包括一種或多種激動劑。
另外，如在本文中所使用的，術(shù)語“包括”旨在意味著所述方法或組合物包括所列舉的要素，但并不排除其它要素。類似地，“基本上由...組成”用來定義方法和組合物，其包括所列舉的要素但排除可以對肝細(xì)胞增殖和肝再生的刺激具有重要意義的其它要素。例如，基本上由A3AR激動劑組成的組合物將不包括或僅包括可忽略量(將對組合物的抗炎作用具有微不足道的影響的量)的其它活性組分，其具有肝細(xì)胞增殖和肝再生活性。此外，基本上由活性劑(如本文所定義的)組成的組合物將不排除來自分離和純化方法的微量污染物、藥用載體、賦形劑、防腐劑等。“由...組成”將意味著排除多于一種微量元素的其他元素。由這些過渡術(shù)語中的每一種限定的實(shí)施方式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
另外，所有數(shù)值，例如，濃度或劑量或它們的范圍，是近似值，其與所陳述的值變化(+)或(-)達(dá)20％，有時(shí)達(dá)10％。應(yīng)當(dāng)理解，即使并不總是明確說明，但是所有數(shù)值指定應(yīng)讀作好象在前面加有術(shù)語“約”。還應(yīng)當(dāng)理解，雖然并不總是明確說明，但是本文描述的試劑僅是示例性的并且其等效物在本領(lǐng)域是已知的。
如在以下示例性實(shí)施方式中所詳細(xì)說明的，本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)A3AR激動劑可以用來增強(qiáng)肝再生。
因此，A3AR激動劑可以用于刺激肝細(xì)胞和促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的體外和體內(nèi)方法。按照本文披露的方法，可以使肝細(xì)胞接觸一定量的A3AR激動劑，其有效誘導(dǎo)肝細(xì)胞的增殖。
這樣的方法和應(yīng)用包括(通過一種實(shí)施方式)體外將A3AR激動劑加入到肝細(xì)胞中。因此，披露了體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法和應(yīng)用，例如，用于隨后的移植，用于體外生成人工肝組織等。這樣的方法和應(yīng)用涉及向包含肝細(xì)胞群體的體外生物樣品提供生物有效量的A3AR激動劑。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選的方法、A3AR激動劑、應(yīng)用以及藥物組合物是那些方法、A3AR激動劑、應(yīng)用以及藥物組合物，其中A3AR激動劑用來體內(nèi)誘導(dǎo)肝細(xì)胞的增殖，在治療性治療的框架內(nèi)，其用來誘導(dǎo)肝細(xì)胞的增殖以抵消上述和下述種類的肝損傷。因此本文提供了誘導(dǎo)肝生長、刺激肝再生以及一般地治療患有各種形式的肝損傷和疾病的受治療者的方法、A3AR激動劑、以及應(yīng)用。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“肝損傷”用來指任何類型的肝創(chuàng)傷(損傷)，其包括慢性和急性創(chuàng)傷以及在肝細(xì)胞或組織中存在的病理變化。肝損傷的臨床癥狀可以包括但不限于活細(xì)胞變性，肝的血管炎，在肝中存在的點(diǎn)狀壞死或局灶性壞死，在肝中的炎性細(xì)胞浸潤或成纖維細(xì)胞增殖，以及起因于嚴(yán)重肝損傷的門管區(qū)、或肝腫大、以及肝硬變、肝細(xì)胞癌等。該損傷可以起因于疾病(即疾病引起的)和/或毒性肝細(xì)胞毒化學(xué)物質(zhì)引起的肝損傷。已知一些藥物可以引起肝損傷，并導(dǎo)致肝細(xì)胞溶解和壞死。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，將A3AR激動劑以有效地在動物或人患者中促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肝生長、刺激肝再生和/或一般地治療或預(yù)防肝損傷、疾病和/或紊亂的量給予受治療者。如在本說明書中所使用的，術(shù)語“有效量”或“有效的...的量”是指當(dāng)給予動物或人患者時(shí)，能有效地促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肝生長、刺激肝再生和/或治療或預(yù)防肝損傷的量。有效量優(yōu)選為產(chǎn)生一定濃度的A3AR激動劑的量，其中它選擇性地激活A(yù)3AR而沒有激活任何其它腺苷受體。例如，在IB-MECA和Cl-IB-MECA的情況下，這樣的優(yōu)選量是將產(chǎn)生小于約200、150、125或甚至小于約100nM的濃度(在IB-MECA的情況下)以及小于約400、300、250、或甚至小于約200nM的濃度(在Cl-IB-MECA的情況下)的量。在體外實(shí)施方式(其中肝細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)是在體外進(jìn)行的)中所得到的濃度可以通過分析簡單地加以計(jì)算或確定。在體內(nèi)給予以實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞體內(nèi)增殖的情況下，例如在治療肝損傷的范圍內(nèi)，可以通過藥物動力學(xué)(PK)研究來確定有效量，其中通過在給予A3AR激動劑以后的規(guī)定的時(shí)間間隔(通過在上述時(shí)間抽血)測量A3AR激動劑的血液或血漿濃度。在PK研究中，A3AR激動劑在血液或血漿中的最大濃度應(yīng)優(yōu)選低于這樣的濃度，其中將激活另一種腺苷受體。
在本披露內(nèi)容的范圍中，肝細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)表示肝細(xì)胞分裂的促進(jìn)或刺激，并且有時(shí)表示肝細(xì)胞死亡的抑制。
A3AR激動劑優(yōu)選配制成用于全身給藥，包括口服、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥。還設(shè)想更加局部化地遞送至肝，包括所有形式的肝內(nèi)給予。
如本文披露的，通過A3AR激動劑，可以治療與肝損傷有關(guān)的各種疾病、紊亂以及病癥。其包括與暴露于酒精、肝毒性藥物以及它們的組合有關(guān)的肝損傷。示例性的損傷劑是抗驚厥藥、苯妥英、卡馬西平(氨甲酰氮

)和苯巴比妥，以及娛樂性藥物(消遣性藥物)，如稱作“Ecstasy”(3，4-亞甲基二氧基甲基苯丙胺)的那些。
按照本披露內(nèi)容，還可以治療由其它療法引起的副作用，其包括與暴露于抗結(jié)核病藥和化療藥物有關(guān)的肝損傷，當(dāng)以較大劑量給予時(shí)，鎮(zhèn)痛藥對乙酰氨基酚(即，撲熱息痛，其化學(xué)名稱是4-(N-乙酰氨基)苯酚)是一種肝損傷物質(zhì)，其可以誘導(dǎo)人肝的壞死。例如，長期給予抗生素，如利福平、吡嗪酰胺、和異煙肼，以及長期給予雌激素等(在絕經(jīng)期)，也可以引起嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死，從而導(dǎo)致肝損傷，如急性或慢性肝炎、黃疸、以及肝纖維化等。
還可以治療與可生長發(fā)育的肝組織的減少有關(guān)的肝損傷，如在切除癌以后發(fā)生的肝損傷。
利用本發(fā)明還可以抵抗起因于或與傳染性媒介(傳染原，傳染劑，infectious agents)有關(guān)的肝損傷。這包括與細(xì)菌感染、寄生物感染、真菌感染以及病毒感染有關(guān)的肝損傷。例如，肝損傷來自曲霉屬真菌感染、血吸蟲寄生感染以及各種病毒感染，如腺病毒感染、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、腺相關(guān)病毒(AAV)感染、肝炎病毒A感染、肝炎病毒B感染、肝炎病毒C感染、肝炎病毒E感染、單純皰疹病毒(HSV)感染、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)感染以及副粘病毒感染，其均可以由此加以治療。
在本披露內(nèi)容的范圍內(nèi)，A3AR激動劑還可以用于治療或甚至預(yù)防與過量的對乙酰氨基酚(撲熱息痛)攝入有關(guān)的肝損傷。這可以在長期內(nèi)發(fā)生，導(dǎo)致慢性肝損傷；或在短期內(nèi)或立即發(fā)生，導(dǎo)致急性肝損傷。后一種實(shí)施方式包括在成人和兒童中的故意和意外過劑量。
各種A3AR激動劑在本領(lǐng)域是已知的。然而，本發(fā)明并不限于已知的A3AR激動劑。通常，A3AR激動劑是任何化合物，其能夠特異性地結(jié)合于腺苷A3受體(“A3AR”)，從而完全或部分地激活所述受體以產(chǎn)生治療效果(在這種特定情況下，對肝細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)效應(yīng))。
因此A3AR激動劑是一種化合物，其通過A3AR的結(jié)合和激活來施加它的主要影響。按照一種實(shí)施方式，這將意味著在所有給予的劑量下它基本上僅結(jié)合于并激活A(yù)3R。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，A3AR激動劑與人A3AR具有小于1000nM的結(jié)合親和力(Ki)，期望地小于500nM，有利地小于200nM以及甚至小于100nM，通常小于50nM，優(yōu)選小于20nM，更優(yōu)選小于10nM并且理想地小于5nM。Ki越低，(可以使用的)A3AR激動劑的劑量則越低，其將有效地激活A(yù)3R并從而實(shí)現(xiàn)治療效果。
舉例來說，IB-MECA和Cl-IB-MECA(均為特異性A3AR激動劑)的IC50和Ki列在以下表1和表2中 表1IB-MECA與4種腺苷受體的結(jié)合親和力 表2CI-IB-MECA與4種腺苷受體的結(jié)合親和力 如這些表格清楚地表明的，IB-MECA和Cl-IB-MECA均是A3AR的高度選擇性的激動劑。
應(yīng)當(dāng)指出，某些A3AR激動劑還可以以更低的親合力(即，更高的Ki)與其它受體相互作用并激活它。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，一種化合物將被認(rèn)為是A3AR激動劑(即一種通過結(jié)合和激活A(yù)3AR來施加它的主要影響的化合物)，如果它與A3AR的親和力是至少3倍(即，它與A3AR的Ki是至少3倍更低)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用的A3AR激動劑是一種藥劑，其特異性地和選擇性地結(jié)合和激活A(yù)3AR。因此A3AR激動劑具有這樣的IC50或Ki，其優(yōu)選低于與任何其它腺苷受體的IC50或Ki的至少10、15、20、25、50、75、100、150、250或有時(shí)至少500倍。
A3AR激動劑與人A3AR的親和力以及它與其它人腺苷受體的相對親和力可以通過許多測定(如結(jié)合測定)加以確定。結(jié)合測定的實(shí)例包括提供具有受體的膜或細(xì)胞并測量A3AR激動劑置換結(jié)合的放射性激動劑的能力；利用呈現(xiàn)各自的人腺苷受體的細(xì)胞并在功能測定中測量A3AR激動劑激活或滅活(視情況而定)下游信號事件的能力，如對腺苷酸環(huán)化酶的影響，其是通過cAMP水平的增加或減小加以測量的；等等。顯然，如果增加A3AR激動劑的給予水平，使得它的血液水平達(dá)到接近其它腺苷受體Ki的水平，則在這樣的給予以后除A3AR的激活之外可以發(fā)生這些受體的激活。因此優(yōu)選以一定劑量給予A3AR激動劑，使得將達(dá)到的血液水平將導(dǎo)致基本上僅A3AR的激活。
一些腺苷A3AR激動劑的特性以及它們的制備方法尤其詳細(xì)地描述在US 5,688,774、US 5,773,423、US 5,573,772、US 5,443,836、US 6,048,865、WO 95/02604、WO 99/20284、WO 99/06053、WO97/27173以及WO/2006/031505中，將其均以引用方式結(jié)合于本文。
根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，A3AR激動劑是屬于通式(I)的范圍內(nèi)的嘌呤衍生物
其中R1是C1-C10烷基、C1-C10羥烷基、C1-C10羧基烷基或C1-C10氰烷基(氰基烷基)或以下通式(II)的基團(tuán)
其中 Y是氧、硫原子或CH2； X1是氫、C1-C10烷基、RaRbNC(＝O)-或HORC-，其中Ra和Rb可以是相同或不同的并選自氫、C1-C10烷基、氨基、C1-C10鹵代烷基、C1-C10氨烷基、C1-C10BOC-氨烷基、以及C3-C10環(huán)烷基，或連接在一起以形成包含2至5個(gè)碳原子的雜環(huán)，并且Rc選自C1-C10烷基、氨基、C1-C10鹵代烷基、C1-C10氨烷基、C1-C10BOC-氨烷基、以及C3-C10環(huán)烷基； X2是氫、羥基、C1-C10烷基氨基、C1-C10烷基酰氨基或C1-C10羥烷基； X3和X4各自獨(dú)立地是氫、羥基、氨基、酰氨基(或酰胺基)、疊氮基、鹵素、烷基、烷氧基、羧基、次氮基、硝基、三氟、芳基、烷芳基、硫基(硫代)、硫酯(硫代酸酯)、硫醚、-OCOPh、-OC(＝S)OPh或X3和X4均是氧，其連接至＞C＝S以形成5元環(huán)，或X2和X3形成化學(xué)式(III)的環(huán)
其中R’和R”獨(dú)立地是C1-C10烷基； R2選自氫、鹵素、C1-C10烷基醚、氨基、酰肼基(hydrazido)、C1-C10烷基氨基、C1-C10烷氧基、C1-C10硫烷氧基、吡啶硫基(吡啶基硫基，吡啶基硫)、C2-C10鏈烯基；C2-C10炔基、硫基、以及C1-C10烷硫基；以及 R3是-NR4R5基團(tuán)，其中R4是氫或選自烷基、取代的烷基或芳基-NH-C(Z)-中的基團(tuán)，其中Z是O、S或NRa，以及 當(dāng)R4是氫時(shí)，R5選自R-和S-1-苯乙基、芐基、苯乙基或酰苯胺基團(tuán)，每種所述基團(tuán)是未取代的或在一個(gè)或更多位置被以下取代基取代，其中所述取代基選自C1-C10烷基、氨基、鹵素、C1-C10鹵代烷基、硝基、羥基、乙酰氨基(或乙酰胺基)、C1-C10烷氧基、以及磺酸或其鹽；或R5是苯并二噁烷甲基、糠基(fururyl)、L-丙基丙氨酰-氨芐基、β-丙氨酰氨基-芐基、T-BOC-β-丙氨酰氨芐基、苯氨基、氨基甲?；?、苯氧基或C1-C10環(huán)烷基；或R5是以下化學(xué)式(IV)的基團(tuán)
或者，當(dāng)R4是烷基、取代的烷基、或芳基-NH-C(Z)-時(shí)，則R5選自由取代或未取代的雜芳基-NRa-C(Z)-、雜芳基-C(Z)-、烷芳基-NRa-C(Z)-、烷芳基-C(Z)-、芳基-NR-C(Z)-以及芳基-C(Z)-組成的組； 或者A3AR激動劑是以下通式(V)的黃嘌呤-7-核糖核苷衍生物
其中 X是O或S； R6是RaRbNC(＝O)-或HORC-，其中 Ra和Rb可以是相同或不同的，并且選自氫、C1-C10烷基、氨基、C1-C10鹵代烷基、C1-C10氨烷基、以及C3-C10環(huán)烷基，或連接在一起以形成包含2至5個(gè)碳原子的雜環(huán)；以及 Rc選自C1-C10烷基、氨基、C1-C10鹵代烷基、C1-C10氨烷基、C1-C10BOC-氨烷基以及C3-C10環(huán)烷基； R7和R8可以是相同或不同的，并且選自C1-C10烷基、C1-C10環(huán)烷基、R-或S-1-苯乙基、未取代的芐基或酰苯胺基團(tuán)、以及在一個(gè)或更多位置上被以下取代基取代的芐基基團(tuán)的苯基醚，其中所述取代基選自C1-C10烷基、氨基、鹵素、C1-C10鹵代烷基、硝基、羥基、乙酰氨基、C1-C10烷氧基、以及磺酸； R9選自由鹵素、芐基、苯基、C3-C10環(huán)烷基、以及C1-C10烷氧基組成的組； 或者上述所定義的化合物的合適鹽。
在一種實(shí)施方式中，Y可以與取代基X1或X2形成稠合橋。這種實(shí)施方式披露在WO 2006/031505中，將其全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。在另一種實(shí)施方式中，這樣的化合物可以具有以下通式
其中X1、R2以及R5如上文所定義。
根據(jù)另一種實(shí)施方式，A3AR激動劑是通式(VII)的核苷衍生物
其中X1、R2以及R5如上文所定義。
A3AR激動劑的非限制性組是N6-芐基腺苷-5’-糖醛酰胺衍生物。一些優(yōu)選的N6-芐基腺苷-5’-糖醛酰胺衍生物是N6-2-(4-氨基苯基)乙基腺苷(APNEA)、N6-(4-氨基-3-碘芐基)腺苷-5’-(N-甲基糖醛酰胺(methyluronamide))(AB-MECA)、1-脫氧-1-{6-[({3-碘苯基}甲基)氨基]-9H-嘌呤-9-基}-N-甲基-β-D-核糖呋喃糖醛酰胺(呋喃核糖羰酰胺，ribofuranuronamide)(IB-MECA)以及2-氯-N6-(3-碘芐基)腺苷-5’-N-甲基糖醛酰胺(Cl-IB-MECA)。
根據(jù)另一種實(shí)施方式，A3AR激動劑是N6-芐基-腺苷-5’-烷基糖醛酰胺-N1-氧化物或N6-芐基腺苷-5’-N-二烯丙基-糖醛酰胺-N1氧化物。
應(yīng)當(dāng)明了，A3AR激動劑的有效量取決于各種因素，其包括活性劑與它的相應(yīng)受體的親合力，它在體內(nèi)的分布外形，各種藥理學(xué)參數(shù)如在體內(nèi)的半衰期，取決于不期望的副作用(如果有的話)，取決于諸如待治療的受治療者的體重、年齡、性別、治療歷史、伴隨藥物、以及其它參數(shù)等的因素。通常在臨床研究中測試有效量，目的在于發(fā)現(xiàn)有效的劑量范圍、最大耐受劑量以及最佳劑量。對于精通臨床開發(fā)領(lǐng)域的人員來說，進(jìn)行這樣的臨床研究的方式是熟知的。
有時(shí)還可以基于在動物中顯示有效的量來確定量。眾所周知，給予大鼠的X mg/Kg的量可以通過使用本領(lǐng)域眾所周知的可能的換算方法之一被換算成在另一物種(特別是人類)中的等效量。換算方程的實(shí)例如下 換算I 體表面積依賴性劑量換算大鼠(150g)與男性(70Kg)是1/7大鼠劑量。這意味著，在最近的案例中，在大鼠中0.001-0.4mg/Kg等于約人類中的0.14-56微克/Kg；假設(shè)70Kg的平均體重，這將轉(zhuǎn)變?yōu)榧s0.01至約4mg的絕對劑量。
換算II 以下?lián)Q算因數(shù)小鼠＝3，大鼠＝67。換算因數(shù)乘以動物體重以從mg/Kg換算成mg/m2，用于人劑量當(dāng)量。
按照此方程，對于人類來說，等效于大鼠中的0.001-0.4mg/Kg的量是0.16-64μg/Kg；即對于體重約70Kg的人來說，約0.011至約4.4mg的絕對劑量，類似于在換算I中指出的范圍。
換算III 另一種用于換算的備選方式是通過設(shè)定劑量以產(chǎn)生與在給予動物以后所達(dá)到的相同的血漿水平或AUC。
還可以基于人PK研究來確定活性劑的有效量。例如，如在US專利申請公開第20050101560號和Fishman等人[Fishman P.et al.，Tolerability，pharmacokinetics，and concentration-dependenthemodynamic effects of oral CFlOl，an A3 adenosine receptor agonist，in healthy young men Int J Clin Pharmacol Ther.42534-542，2004，(CFlOl是臨床級，在cGMP指導(dǎo)下制備，IB-MECA)]中所描述的人研究表明，與在小鼠中的僅1.5小時(shí)的半衰期相比，在人血漿中口服給予的IB-MECA的水平從其峰值濃度衰減，其中半衰期為約8-10小時(shí)，在多次每日給予的情況下，有時(shí)需要進(jìn)行劑量累積效應(yīng)的校正(在先前劑量的水平衰減以前給予隨后的劑量)，因此相對于在單劑量中發(fā)生的水平，存在血漿水平的積累?；谒鋈嗽囼?yàn)，每日兩次給予似乎是優(yōu)選的給藥方案。然而這并不排除其它給藥方案。用Cl-IB-MECA進(jìn)行的人研究表明，在人血漿中，口服給予的Cl-IB-MECA的水平從其峰值濃度衰減，其中半衰期為約12-14小時(shí)?；谠撊藬?shù)據(jù)，在人受治療者中的給藥方案可以優(yōu)選是每日一次或兩次，雖然不能排除其它方案。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，藥物組合物通常包括A3AR激動劑與藥用載體以及其它添加劑的組合。載體有時(shí)可以具有改善活性組分遞送或滲透到靶組織中的效應(yīng)，用于改善藥物的穩(wěn)定性，用于減慢清除率，用于賦予緩釋性能，用于減小不期望的副作用等。載體還可以是這樣的物質(zhì)，其穩(wěn)定劑型(例如防腐劑)，用于為劑型提供可食用味道等。載體、穩(wěn)定劑以及佐劑的實(shí)例描述在例如E.W.Martin，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，MacK Pub Co(June，1990)中。
已經(jīng)以說明性的方式描述了本發(fā)明，并且應(yīng)當(dāng)理解，所使用的術(shù)語旨在具有描述而不是限制的詞匯的性質(zhì)。顯然，鑒于上述教導(dǎo)，本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以以不同于在下文中具體描述的方式來實(shí)施本發(fā)明。
非限定性的示例性實(shí)施方式的詳細(xì)描述 材料與方法 動物 在手術(shù)以前禁食雄性威斯塔鼠(275-300g)12h。用氯胺酮(Ketamin)(45mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)來麻醉大鼠。經(jīng)由肋骨下雙側(cè)切口進(jìn)行剖腹術(shù)。鉗夾到總肝的主門蒂10分鐘，其間，進(jìn)行70％的肝切除術(shù)。在局部缺血10分鐘以后(在肝切除術(shù)過程中)，通過去鉗夾來恢復(fù)血流。
材料 由Albany Molecular Research Inc，Albany，NY，USA為Can-FiteBioPharma合成了A3AR激動劑Cl-IB-MECA。在局部缺血結(jié)束時(shí)開始以100μg/kg的濃度給予Cl-IB-MECA，每日三次，時(shí)間為48h。對照大鼠沒有接受Cl-IB-MECA。
方法 大鼠經(jīng)歷剖腹術(shù)并鉗夾到總肝的主門蒂10分鐘，其間，進(jìn)行70％的肝切除術(shù)。在局部缺血后10分鐘，通過去鉗夾來恢復(fù)血流。在灌注開始時(shí)，口服給予Cl-IB-MECA(100μg/Kg)，TID。
結(jié)果 肝細(xì)胞增殖 參照圖1，可以看到，在部分肝切除術(shù)以后，Cl-IB-MECA上調(diào)節(jié)再生肝的肝細(xì)胞增殖，與對照組中的30％相比，在治療組中呈現(xiàn)45.1％水平的再生。
肝酶ALT和AST的血清水平 ALT和AST血清水平的增加表明肝損傷。如從圖2A和圖2B可以看到的，與對照組相比，在測量的每三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(2、4和48小時(shí))，在Cl-IB-MECA治療組中，ALT和AST水平顯著降低。
在進(jìn)一步的測定中，針對僅用載體治療的大鼠、或針對未接受治療的大鼠，比較了Cl-IB-MECA的影響，并且結(jié)果示在圖3中。如圖所示，用Cl-IB-MECA進(jìn)行的治療導(dǎo)致肝酶的血清水平的降低，從而表明Cl-IB-MECA治療可以保護(hù)肝以避免由局部缺血/再灌注操作引起的損傷。
有絲分裂指數(shù) 在部分肝切除術(shù)以后48小時(shí)，收集肝，用10％緩沖的福爾馬林固定并包埋在石蠟中，然后對5μm厚切片進(jìn)行蘇木素和曙紅染色。篩查高功率場(HPF，放大400倍)并對于每個(gè)場計(jì)數(shù)經(jīng)歷有絲分裂的細(xì)胞。圖4示出了計(jì)數(shù)的50HPF的平均值。結(jié)果表示為對照％。如所示出的，與載體治療組相比，Cl-IB-MECA治療顯著增加了有絲分裂指數(shù)(P＝0.035)。
增殖細(xì)胞核抗原表達(dá) 增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是一種核蛋白，其在細(xì)胞周期的G1后期和整個(gè)S期進(jìn)行表達(dá)。PCNA表達(dá)的量與細(xì)胞增殖的程度有關(guān)。在部分肝切除術(shù)以后48小時(shí)，收集肝，用10％緩沖的福爾馬林固定并包埋在石蠟中，并且對5μm厚切片進(jìn)行PCNA染色。在用僅載體或用Cl-IB-MECA治療以后，PCNA的量分別示于圖5A和圖5B中。如所示出的，Cl-IB-MECA治療顯著增加了PCNA陽性肝細(xì)胞的量(圖5B)。
肝再生 在部分肝細(xì)胞以后24和48小時(shí)收集肝并稱量。
利用以下方程來評估剩余肝葉的生長
其中 A是在肝切除術(shù)以前估計(jì)的總肝重量(3.4％的大鼠的總重量)， B是在肝切除術(shù)期間切除的肝重量，以及 C是在研究結(jié)束時(shí)再生肝的重量。
如所示出的，Cl-IB-MECA治療導(dǎo)致肝重量的增加，并且換句話說，加速了肝再生的速率。
因此，得出的結(jié)論是，A3AR激動劑Cl-IB-MECA可有效再生切除的肝并預(yù)防肝切除術(shù)以后的肝損傷。
權(quán)利要求
1.一種刺激肝細(xì)胞增殖的方法，包括以有效刺激肝細(xì)胞增殖的量向肝細(xì)胞提供A3腺苷受體的激動劑(A3AR激動劑)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述A3AR激動劑是屬于通式(I)的范圍的嘌呤衍生物
其中R1是C1-C10烷基、C1-C10羥烷基、C1-C10羧基烷基或C1-C10氰烷基或以下通式(II)的基團(tuán)
其中
Y是氧原子、硫原子或CH2；
X1是氫、C1-C10烷基、RaRbNC(＝O)-或HORc-，其中Ra和Rb可以是相同或不同的，并且選自氫、C1-C10烷基、氨基、C1-C10鹵代烷基、C1-C10氨烷基、C1-C10 BOC-氨烷基、以及C3-C10環(huán)烷基或連接在一起以形成包含2至5個(gè)碳原子的雜環(huán)，并且Rc選自C1-C10烷基、氨基、C1-C10鹵代烷基、C1-C10氨烷基、C1-C10BOC-氨烷基、以及C3-C10環(huán)烷基；
X2是氫、羥基、C1-C10烷基氨基、C1-C10烷基酰氨基或C1-C10羥烷基；
X3和X4各自獨(dú)立地是氫、羥基、氨基、酰氨基、疊氮基、鹵素、烷基、烷氧基、羧基、次氮基、硝基、三氟、芳基、烷芳基、硫基、硫酯、硫醚、-OCOPh、-OC(＝S)OPh或X3和X4均是連接至＞C＝S以形成5元環(huán)的氧，或X2和X3形成化學(xué)式(III)的環(huán)
其中R’和R”獨(dú)立地是C1-C10烷基；
R2選自氫、鹵素、C1-C10烷基醚、氨基、酰肼基、C1-C10烷基氨基、C1-C10烷氧基、C1-C10硫烷氧基、吡啶硫基、C2-C10烯基；C2-C10炔基、硫基、以及C1-C10烷硫基；以及
R3是-NR4R5基團(tuán)，其中R4是氫或選自烷基、取代的烷基或芳基-NH-C(Z)-的基團(tuán)，其中Z是O、S、或NRa，以及
當(dāng)R4是氫時(shí)，R5選自R-和S-1-苯乙基、芐基、苯乙基或酰苯胺基團(tuán)，每種所述基團(tuán)未取代或在一個(gè)或更多位置被以下取代基取代，所述取代基選自C1-C10烷基、氨基、鹵素、C1-C10鹵代烷基、硝基、羥基、乙酰氨基、C1-C10烷氧基、以及磺酸或其鹽；或R5是苯并二噁烷甲基、糠基、L-丙基丙氨酰-氨芐基、β-丙氨酰氨基-芐基、T-BOC-β-丙氨酰氨芐基、苯氨基、氨基甲?；⒈窖趸駽1-C10環(huán)烷基；或R5是以下化學(xué)式(IV)的基團(tuán)
或者，當(dāng)R4是烷基、取代的烷基、或芳基-NH-C(Z)-時(shí)，則R5選自由取代或未取代的雜芳基-NRa-C(Z)-、雜芳基-C(Z)-、烷芳基-NRa-C(Z)-、烷芳基-C(Z)-、芳基-NR-C(Z)-以及芳基-C(Z)-組成的組；
或所述A3AR激動劑是以下通式(V)的黃嘌呤-7-核糖核苷衍生物
其中
X是O或S；
R6是RaRbNC(＝O)-或HORc-，其中
Ra和Rb可以是相同或不同的，并且選自氫、C1-C10烷基、氨基、C1-C10鹵代烷基、C1-C10氨烷基、以及C3-C10環(huán)烷基，或連接在一起以形成包含2至5個(gè)碳原子的雜環(huán)；并且
Rc選自C1-C10烷基、氨基、C1-C10鹵代烷基、C1-C10氨烷基、C1-C10BOC-氨烷基以及C3-C10環(huán)烷基；
R7和R8可以是相同或不同的，并且選自C1-C10烷基、C1-C10環(huán)烷基、R-或S-1-苯乙基、未取代的芐基或酰苯胺基團(tuán)，以及在一個(gè)或更多位置被以下取代基取代的芐基基團(tuán)的苯基醚，所述取代基選自C1-C10烷基、氨基、鹵素、C1-C10鹵代烷基、硝基、羥基、乙酰氨基、C1-C10烷氧基、以及磺酸；
R9選自由鹵素、芐基、苯基、C3-C10環(huán)烷基、以及C1-C10烷氧基組成的組；
或上述定義的化合物的合適鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述A3AR激動劑是N6-芐基腺苷-5’-糖醛酰胺衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述A3AR激動劑選自由N6-2-(4-氨基苯基)乙基腺苷(APNEA)、N6-(4-氨基-3-碘芐基)腺苷-5’-(N-甲基糖醛酰胺)(AB-MECA)、1-脫氧-1-{6-[({3-碘苯基}甲基)氨基]-9H-嘌呤-9-基}-N-甲基-β-D-核糖呋喃糖醛酰胺(IB-MECA)以及2-氯-N6-(3-碘芐基)腺苷-5’-N-甲基糖醛酰胺(Cl-IB-MECA)組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述A3AR激動劑是IB-MECA或Cl-IB-MECA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述A3AR激動劑是Cl-IB-MECA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，用于在肝損傷或疾病引起的損傷以后在肝中誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述肝損傷或疾病引起的損傷起因于肝切除術(shù)，肝硬化，肝惡性腫瘤，暴露于酒精、肝毒性藥物以及它們的組合，傳染性媒介，基因治療的副作用，暴露于抗結(jié)核劑和化學(xué)治療劑，或?qū)σ阴０被?APAP)過劑量。
9.一種A3AR激動劑在用于刺激肝細(xì)胞增殖的方法中的應(yīng)用。
10.一種A3AR激動劑在用于治療具有由于肝切除術(shù)引起的肝損傷的患者的方法中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的A3AR激動劑，選自由N6-2-(4-氨基苯基)乙基腺苷(APNEA)、N6-(4-氨基-3-碘芐基)腺苷-5’-(N-甲基糖醛酰胺)(AB-MECA)、1-脫氧-1-{6-[({3-碘苯基}甲基)氨基]-9H-嘌呤-9-基}-N-甲基-β-D-核糖呋喃糖醛酰胺(IB-MECA)以及2-氯-N6-(3-碘芐基)腺苷-5’-N-甲基糖醛酰胺(Cl-IB-MECA)組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的A3AR激動劑，所述A3AR激動劑是IB-MECA或Cl-IB-MECA。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的A3AR激動劑，所述A3AR激動劑是Cl-IB-MECA。
14.A3AR激動劑在用于制備治療具有由于肝切除術(shù)引起的肝損傷的患者的藥物中的應(yīng)用。
15.一種用于刺激肝細(xì)胞增殖的藥物組合物，包括有效刺激肝細(xì)胞增殖的量的A3AR激動劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其中，所述A3AR激動劑是Cl-IB-MECA。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的藥物組合物，用于在肝損傷或疾病引起的損傷以后在肝中誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中，所述肝損傷或疾病引起的損傷起因于肝切除術(shù)，肝硬化，肝惡性腫瘤，暴露于酒精、肝毒性藥物以及它們的組合，傳染性媒介，基因治療的副作用，暴露于抗結(jié)核劑和化學(xué)治療劑，或?qū)σ阴０被?APAP)過劑量。
全文摘要
本申請?zhí)峁┝擞糜谡T導(dǎo)肝細(xì)胞增殖和肝再生的方法和組合物，肝再生主要依賴于肝細(xì)胞增殖，即使所有其它細(xì)胞類型分化以重建器官特異性小葉結(jié)構(gòu)。本文提供的方法和組合物利用了A3AR激動劑。本文披露的優(yōu)選的A3AR激動劑是Cl-IB-MECA。
文檔編號A61K31/522GK101820883SQ200880111608
公開日2010年9月1日 申請日期2008年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月15日
發(fā)明者普寧娜·菲什曼, 希拉·柯亨 申請人:坎-菲特生物藥物有限公司