Cd226胞外段蛋白抑制腫瘤細胞增殖的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了CD226胞外段蛋白抑制腫瘤的作用。所述CD226胞外段蛋白是由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列組成的蛋白。本發(fā)明的蛋白能與CD112和CD155分子結(jié)合，一方面可有效封閉CD226與靶細胞的結(jié)合位點，抑制NK細胞的細胞毒活性，可作為NK細胞的抑制劑，用于治療自身免疫性疾病；另一方面，與腫瘤細胞表面的CD112或CD155分子結(jié)合之后，會對腫瘤細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。所以該蛋白可用于免疫功能較低的腫瘤病人中抑制腫瘤的增殖。并且由于該蛋白是人體天然蛋白，其極少引起機體的免疫反應(yīng)。本發(fā)明涉及CD226胞外段蛋白在制備用于抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】CD226胞外段蛋白抑制腫瘤細胞增殖的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要是屬于腫瘤免疫學領(lǐng)域，主要是參與抑制腫瘤細胞生長的蛋白的制備及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及CD226胞外段蛋白抑制腫瘤細胞增殖的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]自然殺傷細胞(NaturalKiller，NK細胞)在天然免疫中發(fā)揮著極為重要的作用，主要包括殺傷腫瘤細胞、殺傷病毒感染的細胞、殺傷胞內(nèi)寄生菌和殺傷真菌。NK細胞主要通過兩種方式直接行使功能；一是通過分泌細胞因子，對靶細胞產(chǎn)生抑制作用。二是通過NK細胞表面受體和配體之間的識別，使NK細胞活化之后對靶細胞進行殺傷。
[0003]NK細胞發(fā)揮功能主要是通過NK細胞表面的各種活化性受體和抑制性受體來實現(xiàn)的。CD226分子是NK細胞表面的活化性受體，在細胞外有兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，與其配體CD 155和CDl 12分子同屬于免疫球蛋白分子超家族，是I型跨膜蛋白。
[0004]在眾多活化性受體中CD226分子具有活化性受體和粘附分子雙重身份，既介導NK細胞與靶細胞的結(jié)合，又通過信號通路向胞內(nèi)傳遞活化性信號(Jun Shirakawa, YinanWang et, al.1nternational Immunology, Vol.18, N0.6, pp.951-957)。在許多腫瘤細胞中CD226分子的配體CD 1 55和CDl 12分子都會上調(diào)表達(Sloan KE, Eustace BK, StewartJK, et al.BMCCancer，2004，4(l):73-78.)。這被認為是有利于NK細胞等免疫細胞對腫瘤的殺傷。但是在腫瘤患者中這種殺傷作用卻并不明顯。腫瘤細胞通過分泌可溶性的⑶155和⑶112分子來對NK細胞、T細胞等淋巴細胞表面的⑶226分子的結(jié)合進行阻斷，從而逃逸免疫系統(tǒng)對其進行識別和清除(Baury B, Masson D, et al.Biochem Biophys ResCommun.2003Sepl2 ；309(I):175-82.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種能與腫瘤細胞表面⑶155 /⑶112分子結(jié)合從而抑制腫瘤細胞生長的CD226胞外段蛋白。
[0006]本發(fā)明提供的⑶226胞外段蛋白，是由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白(我們又將其稱為soluble CD226，簡稱sCD226)。
[0007]該胞外段蛋白是能與⑶155和⑶112分子特異性結(jié)合的配體，可以用人工合成方法直接合成，也可以將蛋白的編碼基因融合或分別插入到表達載體，然后轉(zhuǎn)染宿主細胞，用基因工程方法生產(chǎn)。
[0008]上述的腫瘤指的是各種人來源的CD155或CD112分子陽性的腫瘤，例如，但不限
于，惡性腺瘤、慢性髓原白血病等。
[0009]本發(fā)明提供活性成分是上述CD226胞外段蛋白的抑制腫瘤細胞增殖的藥物。
[0010]上述藥物可包括一種或多種藥學上可接受的載體。
[0011]上述載體可以是稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體和/或潤滑劑。[0012]上述藥物均可以按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)方法制備出以下劑型:注射液和凍干粉針。
[0013]腫瘤細胞表達的可溶性⑶155和⑶112分子可以有效的阻斷NK細胞對其進行殺傷作用，從而使腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)視。實驗證實:本發(fā)明的CD226胞外段蛋白能夠中和可溶性⑶155和⑶112分子，并且同時與腫瘤細胞表面的⑶155和⑶112分子進行結(jié)合，從而對腫瘤細胞的生長產(chǎn)生影響，降低了腫瘤細胞的生長速度。
[0014]本發(fā)明以CD226分子為參考模板制作，能夠抑制腫瘤細胞的生長，同時對免疫系統(tǒng)的細胞影響較小。由 于本發(fā)明的蛋白序列幾乎來源于自身的蛋白，因此極少引起機體的免疫反應(yīng)。使用腫瘤細胞進行增殖試驗，此蛋白能夠?qū)崿F(xiàn)和CD155或CD112單抗相似的作用，同時也避免了抗體分子的副作用。本發(fā)明的蛋白可采用現(xiàn)有的常規(guī)方法制備，技術(shù)成熟。這些都是本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益技術(shù)效果。
[0015]綜上所述，本發(fā)明提供下列各項:
[0016]1、CD226胞外段蛋白在制備用于抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應(yīng)用，其中所述⑶226胞外段蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
[0017]2、根據(jù)第I項所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤細胞是CDl 12或CD155陽性的腫瘤細胞。
[0018]3、根據(jù)第2項所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤細胞選自Hela細胞或K562細胞。
[0019]4、根據(jù)第2項所述的應(yīng)用，其中所述⑶112或⑶155陽性的腫瘤細胞選自惡性腺瘤或慢性髓原白血病的細胞。
[0020]5、一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物，其活性成分是SEQ ID NO:1所示的⑶226胞外
段蛋白。
[0021]6、根據(jù)第5項所述的藥物，其中所述腫瘤細胞是CDl 12或CD155陽性的腫瘤細胞。
[0022]7、根據(jù)第6項所述的藥物，其中所述腫瘤細胞選自Hela細胞或K562細胞。
[0023]8、根據(jù)第6項所述的藥物，其中所述⑶112或⑶155陽性的腫瘤細胞選自惡性腺瘤或慢性髓原白血病的細胞。
[0024]附圖簡述
[0025]圖1，原核重組表達載體pET32a6His-MBP_sCD226的構(gòu)建流程圖。
[0026]A)⑶226蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測。使用Expasy的Smart工具對⑶226蛋白進行三級結(jié)構(gòu)預測；
[0027]B)CD226蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測。使用Expasy的Psipred工具對CD226蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測；
[0028]C)⑶226原核重組表達載體的構(gòu)建流程。
[0029]圖2，⑶226胞外段重組蛋白表達、純化及鑒定。
[0030]A)鎳柱純化原核表達的重組蛋白6His-MBP_sCD226 ；
[0031 ] B) Superdex-200 分子篩純化 6Hi s-MBP_sCD226 ；
[0032]C) SDS page 檢測 TEV 酶切 6His-MBP_sCD226 ；
[0033]D) SDS page檢測鎳柱純化不帶標簽的目的蛋白以及Superdex-200進一步純化目的蛋白；
[0034]E)質(zhì)譜鑒定純化得到的目的蛋白的氨基酸序列，檢測到的肽段用粗體和下劃線表
/Jn ο
[0035]圖3，s⑶226蛋白活性鑒定，s⑶226蛋白可以和⑶112單克隆抗體競爭結(jié)合腫瘤細胞表面的⑶112分子。
[0036]圖4，s⑶226蛋白對⑶112或⑶155陽性腫瘤細胞生長的抑制效應(yīng)。
[0037]A)Hela細胞、K562細胞和CHO-Kl細胞的表型檢測。通過流式檢測幾種細胞系的⑶226配體表達情況；
[0038]B)sCD226蛋白抑制K562和Hela細胞增殖。分別加入BSA，sCD226，sCD226+aCD226mAb和sCD226+IgG蛋白與K562和Hela細胞分別孵育3天的細胞數(shù)；
[0039]C) s⑶226蛋白并不影響CHO-Kl細胞增殖。分別加入BSA和s⑶226蛋白與CHO-Kl細胞孵育3天的細胞數(shù)。
[0040]圖5，s⑶226蛋白抑制腫瘤細胞生長的時間效應(yīng)。[0041]A)CFSE染色后K562增殖檢測。不加任何蛋白情況下，K562經(jīng)CFSE染色后，不同時間點胞內(nèi)CFSE的熒光強度；
[0042]B) SCD226蛋白對K562細胞增殖的影響。加入等量sCD226和BSA之后孵育24h、48h和72h后的實驗組中胞內(nèi)CFSE熒光強度和空白對照的比較。
[0043]圖6，s⑶226抑制腫瘤細胞生長的劑量效應(yīng)。
[0044]圖7，s⑶226抑制腫瘤細胞的遷移。
[0045]A)劃痕實驗檢測SCD226對其配體陽性腫瘤細胞遷移的抑制作用。實驗體系采用含2%新生牛血清的培養(yǎng)基(K562用RPM1-1640培養(yǎng)基，CHO-Kl用DMEM培養(yǎng)基)。分別在蛋白和細胞共孵育Oh和36h時拍照記錄各組劃痕的寬度；
[0046]B) Hela細胞遷移距離計算以及各組遷移距離統(tǒng)計；
[0047]OCHO-Kl細胞遷移距離計算以及各組遷移距離統(tǒng)計。
[0048]圖8，SCD226可以影響腫瘤細胞內(nèi)Rac / Cdc42和Cyclin D信號通路。
[0049]A) Western blot檢測Hela細胞和相應(yīng)蛋白孵育后Rac / Cdc42的總表達量以及Phospho-Racl / cdc42 (Ser71)的表達量；
[0050]B)對A圖中條帶灰度值的統(tǒng)計。統(tǒng)計數(shù)據(jù)來源于三次實驗；
[0051]Offestern blot檢測Hela細胞和相應(yīng)蛋白孵育后Cyclin D的總表達量以及Phospho-Cyclin Dl (Thr286)的表達量；
[0052]
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
D)對C圖中條帶灰度值的統(tǒng)計。統(tǒng)計數(shù)據(jù)來源于三次實驗。
CD226胞外段蛋白的氨基酸序列
SCD226蛋白序列在大腸桿菌中表達的編碼核苷酸序列
TEV酶的氨基酸序列
TEV酶的在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的編碼核苷酸序列
序列說明SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO
【具體實施方式】
[0058]以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0059]下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0060]實施例所用儀器如下:移液器購自法國Gilson公司，離心機購自德國Hettich公司，凈化工作臺購自山東省濟南市空氣凈化消毒設(shè)備廠，CO2培養(yǎng)箱購自美國ThermoFisher 公司，流式細胞儀購自美國 Becton, Dickinson and Company, Superdex-200 分子篩和N1-NTA純化柱購自美國General Electric公司。
[0061]實施例1、本發(fā)明的蛋白的合成及其功能檢測
[0062]一、蛋白的表達和純化
[0063]1、表達載體的設(shè)計
[0064]1)選擇蛋白的片段序列
[0065]⑶226的三維結(jié)構(gòu)尚未解析，使用Expasy網(wǎng)站的Smart工具進行結(jié)構(gòu)預測,得到CD226分子胞外可能有兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，其跨膜區(qū)可能在243位氨基酸殘基到250位氨基酸殘基之間。之后采用Expasy的二級結(jié)構(gòu)預測工具Psipred,預測得出在第249位氨基酸殘基之后是一個alpha螺旋結(jié)構(gòu)，推測是跨膜區(qū)的開始，因此，我們選擇在第248位殘基處截取胞外段。
[0066]2)載體構(gòu)建及標簽選擇
[0067]以人外周血PBMC的cDNA為模板，用引物(正向引物:5’ -CGCGGATCCGAAGAGGTGCTTTGGCATAC-3’ 和反向引物:5’ -CCGCTCGAGTTAAACTCTAGTCTTTGGTC-3’ )將 CD226 分子 19aa至248aa的片段的編碼DNA序列進行擴增，分別構(gòu)建在帶有6His，6His_GST，6His_Trx和6His-MBP融合標簽pET32a載體上(pET32a載體購自美國Novagen公司)，經(jīng)過小量誘導表達裂菌之后，檢測上清中CD226可溶性蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)只有與6His-MBP標簽融合之后能得到可溶性的蛋白表達。所用的載體是帶有N端6Xhis標簽、和N端MBP標簽的pET32a載體。
[0068]3)融合蛋白的酶切和目的蛋白的純化
[0069]原核表達、高壓裂解細菌之后的上清采用N1-NTA純化柱(購自美國GeneralElectric公司)進行純化，得到純度約95%的6His-MBP_s⑶226融合蛋白片段(圖2A)，再用Superdex-200分子篩層析(購自美國GeneralElectric公司)進一步純化(圖2B),得到層析圖譜上單一的樣本峰。采用TEV酶(煙草蝕紋病毒Tobacco etch virus蛋白酶)(可市場購買，如上海索萊寶生物科技有限公司生產(chǎn)的貨號為P2060-1000 ;也可由本實驗室構(gòu)建的TEV酶原核表達體系表達獲得)(TEV蛋白序列和核苷酸序列見SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4)，克隆到表達載體pEGX4T2中，在大腸桿菌BL21DE3表達菌株中通過IPTG誘導表達出可溶性GST-6His-TEV融合蛋白，之后這個蛋白由于在GST和6His之間存在TEV酶切位點而產(chǎn)生自身酶切，從而去除GST標簽。之后用N1-NTA純化高壓裂菌上清得到純度約95%的6His-TEV可溶性蛋白酶對MBP融合標簽進行酶切，以獲得單一的⑶226胞外蛋白。加入要進行酶切的融合蛋白一半質(zhì)量的TEV酶，4°C靜置過夜對融合蛋白進行酶切，融合蛋白被酶切為6His-MBP標簽蛋白和不帶任何標簽的目的蛋白(圖2C)。用N1-NTA純化柱進行陰性選擇純化，將帶有His標簽且未被酶切的融合蛋白、酶切后產(chǎn)生的6His-MBP標簽蛋白和帶有His標簽的TEV酶全部去除。蛋白溶液再經(jīng)過Superdex-200分子篩層析的純化，得到純度約為95%的目的蛋白片段(圖2D)。用二維液相色譜多級質(zhì)譜聯(lián)用儀(2D1C-MS)(購自美國Thermo Fisher公司)鑒定為0)226胞外結(jié)構(gòu)域片段(ectodomain)，簡稱Q3226EQ)蛋白片段，本發(fā)明中又稱SCD226蛋白(圖2E)。
[0070]二、蛋白的功能檢測
[0071]1、s⑶226蛋白與抗⑶112單克隆抗體競爭結(jié)合細胞試驗[0072]實驗材料:K562細胞(慢性髓原白血病細胞)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，編號CCL-243?，PE熒光素偶聯(lián)的小鼠抗-人CD112 (R2.525)購自美國Becton，Dickinson and Company (Cat#:337410), RPM1-1640 培養(yǎng)基購自美國 Thermo Fisher 公司,新生牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司，BSA蛋白購自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0073]實驗儀器:低溫高速離心機購自美國Sigma-Aldrich公司，型號SIGMA1-15K，臺式冷凍離心機購自德國Hettich公司，型號Rotanta46R,流式細胞儀購自美國Becton,Dickinson and Company。
[0074]實驗組的設(shè)置:空白組、同型抗體對照組和抗體實驗組(其中包括加入不同的蛋白量:20μ g，40y g，80y g和160 μ g的sCD226實驗組、以及不同的蛋白量:20μ g，40y g，80 μ g和160 μ g的BSA蛋白的實驗對照組)。
[0075]I)用低溫高速離心機200g離心5min，收集30ml培養(yǎng)液中新鮮培養(yǎng)的K562細胞；
[0076]2)用 Iml PBS (pH = 7.2)溶液重懸細胞；
[0077]3)用臺式冷凍離心機200g離心5min，收集細胞；
[0078]4)用 PBS (pH = 7.2)重復洗滌一次；
[0079]5)計數(shù)細胞，每個實驗組中加入2X IO5個細胞；
[0080]6)加入小鼠血清，4°C避光30min進行封閉；
[0081]7)各組中加入2μ g⑶112單克隆抗體和相應(yīng)的蛋白，4°C避光30min孵育；
[0082]8)臺式冷凍離心機200g離心5min,棄上清；
[0083]9)細胞用Iml PBS (pH = 7.2)重懸，然后繼續(xù)用臺式冷凍離心機200g離心5min對細胞進行洗滌；
[0084]10)重復步驟9，洗滌一次；
[0085]11)洗滌結(jié)束之后每組細胞用300 μ I PBS (pH = 7.2)重懸轉(zhuǎn)入流式細胞儀檢測管，用流式細胞儀進行檢測。
[0086]結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，隨著s⑶226蛋白加入量的增加，K562細胞上結(jié)合的熒光抗體逐漸減少，無關(guān)蛋白BSA的加入并不影響K562細胞表面結(jié)合的熒光抗體的量，提示得到的SCD226具有與CDl 12分子結(jié)合的能力(圖3)。
[0087]三、蛋白抑制腫瘤細胞增殖試驗
[0088]實驗材料:0.22μπι的無菌濾器購自美國Millipore公司，頂DM培養(yǎng)基、RPM1-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基均購自美國Thermo Fisher公司，新生牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司，24孔細胞培養(yǎng)板購自美國Costar公司，K562細胞、CH0-K1細胞和Hela細胞均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，編號分別為CCL-243?、CCL-61?和CCL-2?，上述三種細胞分別與慢性髓細胞性白血病、中國倉鼠卵巢癌和惡性腺瘤相關(guān)。BSA蛋白購自生工生物工程(上海)股份有限公司。純化的小鼠抗-⑶226 (DXll)抗體(a⑶226mAb)和純化的小鼠IgGl同型抗體購自美國Becton,Dickinson and Company,貨號分別為559787和555749。
[0089]實驗組的設(shè)置:每一種細胞均分別設(shè)置五個實驗組:空白對照組只加入PBS溶液，實驗對照組每孔加入50 μ g的BSA, SCD226組每孔加入50 μ g的sCD226蛋白，s⑶226+抗⑶226抗體(aCD226mAb)組每孔加入50 μ gsCD226蛋白的同時也加入50 μ g的⑶226的阻斷性抗體0乂11(&^22611^13)，s⑶226+IgG組每孔在加入50 μ g的s⑶226蛋白的同時也加入50 μ g的小鼠IgG抗體作為同型對照。每組3個復孔。
[0090]I) s⑶226蛋白和BSA蛋白分別用0.22 μ m的無菌濾器過濾除菌；
[0091]2)收集細胞，200g離心5min，棄上清；
[0092]3)根據(jù)ATCC細胞培養(yǎng)要求，分別加入不同的培養(yǎng)基，Hela用RPM1-1640完全培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)、CHO-Kl用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)、K562用MDM完全培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)，進行細胞計數(shù)；
[0093]4)調(diào)整細胞濃度至IO4 / ml，加入24孔板，每孔Iml ；
[0094]5)分別加入相應(yīng)蛋白溶液，空白對照組加等體積PBS (pH = 7.2)；
[0095]6)將培養(yǎng)板放在5% CO2, 37 °C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h ；
[0096]7)分別收集各培養(yǎng)孔中的細胞懸液，進行細胞計數(shù)；
[0097]8)每個試驗重復3次。
[0098]s⑶226蛋白對于Hela細胞和K562細胞的增殖具有抑制作用(圖4A)。而CHO-Kl細胞表面沒有CDl 12或CD155分子，增殖不受影響(圖4B)。無關(guān)蛋白BSA的加入也不影響腫瘤細胞的增殖，SCD226蛋白加入3天后可以使腫瘤細胞數(shù)目顯著減少(表1)。
[0099]表1.各實驗組的細胞計數(shù)數(shù)據(jù)
【權(quán)利要求】
1.CD226胞外段蛋白在制備用于抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應(yīng)用，其中所述CD226胞外段蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤細胞是CDl12或CD155陽性的腫瘤細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤細胞選自Hela細胞或K562細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述CDl12或CD155陽性的腫瘤細胞選自惡性腺瘤或慢性髓原白血病的細胞。
5.一種抑制腫瘤細胞增殖的藥物，其活性成分是SEQ ID N0:1所示的CD226胞外段蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物，其中所述腫瘤細胞是CDl12或CD155陽性的腫瘤細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物，其中所述腫瘤細胞選自Hela細胞或K562細胞。
8.根據(jù)權(quán)利 要求6所述的藥物，其中所述CD112或CD155陽性的腫瘤細胞選自惡性腺瘤或慢性髓原白血病的細胞。
【文檔編號】A61P35/00GK103520705SQ201310431933
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】田志剛, 侯勝科, 孫汭, 鄭曉東, 魏海明 申請人:中國科學技術(shù)大學