一種固定化核酸酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種固定化核酸酶及其制備方法。本發(fā)明的固定化核酸酶由核酸酶和固相載體組成，核酸酶通過(guò)共價(jià)鍵與固相載體上的基團(tuán)相連接。本發(fā)明的固定化核酸酶活性大于500U/g，作用的pH范圍為6～8，最適作用溫度為37℃。本發(fā)明還公開(kāi)了一種制備固定化核酸酶的方法。本發(fā)明的固定化核酸酶應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)品的工藝中，在產(chǎn)品分離純化過(guò)程中避免了核酸酶殘留在終產(chǎn)品中，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。
【專利說(shuō)明】一種固定化核酸酶及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核酸酶及其制備方法，尤其涉及一種固定化 核酸酶及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物技術(shù)產(chǎn)品在高效表達(dá)時(shí)宿主細(xì)胞或菌體也大量增殖，這一過(guò)程中往往伴隨著 大量的宿主或菌體核酸的擴(kuò)增，在后續(xù)的分離過(guò)程中大量的核酸釋放會(huì)給目標(biāo)產(chǎn)品的分離 純化增加難度，同時(shí)部分殘留宿主DNA與產(chǎn)品結(jié)合也很難去除。宿主細(xì)胞的DNA同藥物一 起進(jìn)入人體會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)料的副作用，殘留DNA可能造成機(jī)體DNA的插入突變，導(dǎo)致抑癌基 因失活、癌基因被激活等，有可能造成藥物使用者致癌，因此宿主細(xì)胞DNA殘留量是產(chǎn)品質(zhì) 量控制的重要指標(biāo)之一。
[0003] 許多機(jī)構(gòu)都對(duì)重組蛋白類(lèi)藥物的DNA殘留制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，1984年的國(guó)際會(huì)議 上采納了殘余DNA的臨時(shí)限度標(biāo)準(zhǔn)，即來(lái)自連續(xù)傳代細(xì)胞系的生物制品每人份劑量DNA殘 留不能超過(guò)l〇pg。1986年WHO會(huì)議一致認(rèn)為不高于100pg/劑量的細(xì)胞DNA對(duì)于非口服途 徑的產(chǎn)品，其危險(xiǎn)性是可以忽略不計(jì)的。1987年，美國(guó)FDA建議每人份劑量殘余細(xì)胞DNA的 可接受限度為l〇pg。1997年，美國(guó)FDA將生物制品可以允許的殘余DNA限度修改為不超過(guò) 100pg。歐洲藥典通則中對(duì)于殘余DNA的限度規(guī)定為不超過(guò)10ng/劑量，但針對(duì)個(gè)別疫苗 (如甲型肝炎滅活疫苗殘余DNA應(yīng)不超過(guò)100pg/劑量；乙型肝炎疫苗DNA殘留量應(yīng)不超過(guò) l〇pg/劑量）會(huì)有所不同。
[0004] 1990年2月，衛(wèi)生部頒布的《人用重組DNA制品質(zhì)量控制要點(diǎn)》3. 3. 1. 6條款規(guī)定， 必須用敏感的方法測(cè)定來(lái)源于宿主細(xì)胞的殘余DNA含量，這對(duì)于用哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞（轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞系）生產(chǎn)的制品尤為重要。一般認(rèn)為殘余DNA含量小于100pg/劑量是安全的。 《中國(guó)藥典》三部（2005年版）對(duì)CH0細(xì)胞表達(dá)的重組乙型肝炎疫苗提出CH0細(xì)胞殘余DNA 含量不高于l〇pg/劑量。近幾年，我國(guó)采用Vero細(xì)胞生產(chǎn)滅活疫苗逐漸增多，疫苗的種類(lèi) 包括人用狂犬病純化疫苗、腎綜合征出血熱純化疫苗、甲型肝炎滅活疫苗、乙型腦炎純化疫 苗?！吨袊?guó)藥典》（2005年版三部）及（2010年版三部）對(duì)于Vero細(xì)胞培養(yǎng)疫苗一般要求 殘余外源DNA不超過(guò)100pg/劑量。
[0005] 非特異性核酸內(nèi)切酶是一類(lèi)高活性的水解酶，其最大特點(diǎn)是能非特異性地降解 幾乎所有形式的核酸。來(lái)自粘質(zhì)沙雷氏菌非特異性核酸內(nèi)切酶（Serratia marcescens non-specific endonuclease，SMNE，E. C. 3· 1· 30. 2)是其中的典型代表，該酶能降解各種形 式核酸的核酸內(nèi)切酶，包括單鏈，雙鏈，線性和環(huán)狀DNA和RNA以及基因組DNA，對(duì)核酸的序 列沒(méi)有嚴(yán)格要求，并且沒(méi)有蛋白酶活性。該酶在廣泛條件范圍具有很高的核酸降解活性，能 將核酸完全消化成雜交限度以下的2-5個(gè)堿基長(zhǎng)度的5' -單磷酸寡核苷酸。
[0006] 該酶由分子量為30kDa的兩個(gè)亞基組成，作用的pH范圍為6?10,溫度0?42°C， 酶發(fā)揮活性需要1?2mM Mg2+。在離子型及非離子型表面活性劑和ImM PMSF，lmM EDTA，尿 素存在下，核酸酶仍具有活性。大于150mM的單價(jià)陽(yáng)離子，大于100mM的磷酸根，大于lOOmM 硫酸銨和大于lOOmM鹽酸胍抑制酶的活性。
[0007] 核酸酶具有廣闊的應(yīng)用前景，適合從生物制品中去除核酸，其主要應(yīng)用于以下幾 個(gè)方面：
[0008] 1、提高產(chǎn)品質(zhì)量：核酸酶通過(guò)降低生物制品，尤其是病毒類(lèi)產(chǎn)品外源性核酸的含 量，減少過(guò)敏反應(yīng)，提1?制品安全性；
[0009] 2、改善重組蛋白工藝：工程細(xì)胞裂解后加入核酸酶可降低料液的黏度，縮短處理 時(shí)間，提高蛋白產(chǎn)量，離心時(shí)有利于沉淀和上清液的分離，超濾時(shí)有利于各成分的分離，提 1?柱層析純化時(shí)的有效性；
[0010] 3、顆粒（病毒、包涵體等）預(yù)處理：有助于顆粒的純化；
[0011] 4、生物分析樣品的處理：在ELISA、柱層析、二維電泳和印跡分析中，通過(guò)核酸酶 的作用可提高分辨率和回收率。
[0012] 目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的核酸酶產(chǎn)品主要是德國(guó)Merck公司的Benzonase? endonuclease。該產(chǎn)品是將Serratia marcescens核酸酶基因克隆到pNUCl質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌W3310實(shí)現(xiàn)核酸酶基因的分泌表達(dá)，生產(chǎn)工藝保證了產(chǎn)品的純度和活性，使該 產(chǎn)品同自然提取酶相比，最大限度地降低了蛋白酶活性和病毒污染。
[0013] 美國(guó)Acambis公司的ChimeriVaxTM Platform疫苗研究平臺(tái)系統(tǒng)，采用黃熱病毒 載體研究生產(chǎn)登革熱、WN和JE腦炎疫苗，Benzonase核酸酶已經(jīng)用于這些疫苗的開(kāi)發(fā)和生 產(chǎn)。2007年，薛惠斌在腺病毒CNHK200-hEndostatin的質(zhì)量控制及其大規(guī)模擴(kuò)增一純化的 初步研究中應(yīng)用Benzonase提高重組腺病毒的質(zhì)量，重組復(fù)制型溶瘤腺病毒p53產(chǎn)品工藝 中也使用了 benzonase酶，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定了相應(yīng)的殘留量檢測(cè)項(xiàng)目?！禫accine》雜志2007 年發(fā)表了關(guān)于人用羅斯河病毒感染（Ross River virus)疫苗的臨床前試驗(yàn)文章，其中疫苗 制備工藝首先是40升反應(yīng)器中病毒的微載體培養(yǎng)，然后收獲培養(yǎng)上清進(jìn)行過(guò)濾，濾液中加 入Benzonase核酸酶處理，濃度2000U/L，37°C，1小時(shí)以消化殘留的Vero細(xì)胞DNA。后續(xù)病 毒經(jīng)甲醒滅活24小時(shí)后再加入Benzonase核酸酶1000U/L以進(jìn)一步處理殘留的核酸。
[0014] 2009年發(fā)表于《THE JOURNAL OF GENE MEDICINE》的一項(xiàng)關(guān)于腺病毒載體純 化的石開(kāi)究（Purification of adenoviral vectors by combined anion exchange and gel filtration chromatography)中應(yīng)用 Benzonase 的條件為：1200U Benzonase 加到 12. 5ml (98U/ml)粗裂解物，37°C保溫1小時(shí)，然后2-8°C條件3000g離心10分鐘后進(jìn)一步 純化。結(jié)果病毒顆粒的收率有很大改善，在超濾后純化的第一步97%的Benzonase核酸酶 能夠去除。
[0015] 2010年《Gene Therapy》雜志報(bào)道了通過(guò)單純皰疫病毒互補(bǔ)系統(tǒng)生產(chǎn)、純化腺相關(guān) 病毒的工作，其中重組病毒顆粒釋放后采用Benzonase核酸酶（25U/L，MgCl 22mmol/L).處 理，37°C振蕩保溫2?4小時(shí)，這樣便于在后續(xù)的工藝中有效地去除殘留DNA。
[0016] 2011年，Langfield Κ· K.等在《Methods Mol Biol.》雜志發(fā)表了關(guān)于制備麻疫病 毒的文章。麻疹病毒作為具有腫瘤治療前景的溶瘤病毒，正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但溶瘤病毒的 活性依賴于高濃度具有感染性的病毒顆粒。在純化中，病毒培養(yǎng)上清過(guò)濾后采用Benzonase 核酸酶處理來(lái)消化其中的核酸以便于后續(xù)的制備工作。
[0017] 2012年，Bandeira V.等在純化慢病毒顆粒載體（Lentiviral vector)的工藝過(guò) 程中使用了 Benzonase核酸酶，結(jié)果能去除99%的DNA殘留。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng) 站（WWW. fda. gov)公開(kāi)了病毒載體的生產(chǎn)工藝過(guò)程，其中有Benzonase核酸酶的處理步驟， 通過(guò)37°C保溫1小時(shí)，就能有效去除細(xì)胞及質(zhì)粒DNA。宮頸癌疫苗GARDASIL的工藝過(guò)程中 使用Benzonase核酸酶4°C處理病毒顆粒過(guò)夜以幫助消化DNA從而使宿主殘留DNA在后續(xù) 純化過(guò)程中容易去掉，降低終產(chǎn)品中宿主DNA的殘留量。
[0018] Benzonase核酸酶的應(yīng)用使細(xì)胞基質(zhì)DNA被水解成小片段甚至寡核苷酸后在疫苗 的純化過(guò)程中很容易去除，大大降低了殘留DNA的含量，提高了疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量。保證了產(chǎn) 品的安全性。同時(shí)與疫苗顆粒相比，Benzonase核酸酶是小分子蛋白質(zhì)，在去除血清蛋白的 過(guò)程中也很容易去除。然而B(niǎo)enzonase核酸酶的使用是直接加入到疫苗溶液中，終產(chǎn)品可 以控制含量，但無(wú)法完全避免。Benzonase核酸酶是外源性蛋白，極微量的殘留都有可能引 發(fā)個(gè)別接種者出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，導(dǎo)致臨床不測(cè)事件發(fā)生。
[0019] 固定化酶是二十世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，1916年Nelson和Griffin最先發(fā)現(xiàn) 了酶的固定化現(xiàn)象后，科學(xué)家們就開(kāi)始了固定化酶的研究工作，1969年日本一家制藥公司 第一次將固定化的酰化氨基水解酶用來(lái)從混合氨基酸中生產(chǎn)L-氨基酸，開(kāi)辟了固定化酶 工業(yè)化應(yīng)用的新紀(jì)元。
[0020] 固定化酶與游離酶相比，具有不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，主要表現(xiàn)在：首先，酶與產(chǎn)物易于 分開(kāi)，因而可以回收再利用；其次，在一定程度上可以改善酶的操作性能和穩(wěn)定性；第三， 可以多次反復(fù)使用和連續(xù)操作，降低生產(chǎn)成本；第四，酶不混入產(chǎn)物，可以精簡(jiǎn)分離工序等。 酶經(jīng)過(guò)固定化后對(duì)酶的催化性能產(chǎn)生影響，其本身的結(jié)構(gòu)必將受到擾動(dòng)，同時(shí)其參與的催 化反應(yīng)也由均相體系變?yōu)楣桃灰簝上囿w系。通常認(rèn)為酶分子本身以及載體性質(zhì)等各種因素 均能影響固定化酶的催化性能，例如：
[0021] (1)構(gòu)象效應(yīng)。構(gòu)象效應(yīng)是指固定化過(guò)程中，由于酶和載體之間的相互作用導(dǎo)致酶 的活性中心或三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使酶和底物之間的結(jié)合能力或酶催化底物轉(zhuǎn)化的能 力發(fā)生改變。在大多數(shù)情況下，固定化操作會(huì)造成酶活力有不同程度的下降，這在共價(jià)結(jié)合 法制備固定化酶時(shí)表現(xiàn)得尤為突出。
[0022] (2)空間位阻效應(yīng)。空間位阻效應(yīng)主要是由于載體提供的空間太小或者酶在固定 化過(guò)程中空間取向不當(dāng)造成的。當(dāng)存在空間位阻效應(yīng)時(shí)，底物較難與酶的活性中心接觸，從 而導(dǎo)致酶的催化效率降低。
[0023] (3)微環(huán)境擾動(dòng)。微環(huán)境擾動(dòng)是由于載體的余疏水性或電荷性質(zhì)等影響酶的構(gòu)象 及催化能力的一種效應(yīng)，這種效應(yīng)可以通過(guò)改變載體與介質(zhì)的性質(zhì)來(lái)進(jìn)行調(diào)控。
[0024] (4)分配效應(yīng)。分配效應(yīng)主要是由于固定化載體的余疏水性或靜電作用使反應(yīng)底 物、產(chǎn)物以及體系中的其它組分在微觀環(huán)境與宏觀體系間發(fā)生了不等分配，改變了酶催化 體系的組成平衡，從而影響酶的催化速率。
[0025] (5)擴(kuò)散限制效應(yīng)。擴(kuò)散限制效應(yīng)是指底物、產(chǎn)物以及體系中其它組分的運(yùn)動(dòng)速度 受到限制的一種效應(yīng)。擴(kuò)散限制具體可分為兩種類(lèi)型：一種是外擴(kuò)散，是指反應(yīng)體系組分從 宏觀體系到酶顆粒表面過(guò)程中所受到的限制；另一種是內(nèi)擴(kuò)散，是指反應(yīng)體系組分從酶顆 粒表面到顆粒內(nèi)部酶所在位置所受到的限制。外擴(kuò)散限制往往可通過(guò)提高攪拌或混合速率 來(lái)減輕或消除，而內(nèi)擴(kuò)散限制則主要取決于載體的性質(zhì)。
[0026] 影響固定化酶表觀活性的因素主要是酶的結(jié)合量以及載體的結(jié)構(gòu)等。當(dāng)載體上結(jié) 合的酶較少時(shí)，固定化酶的比活力較高，反之則較低。載體結(jié)構(gòu)對(duì)酶的表觀活力有著極其重 要的影響，通常情況下，固定化酶的活力較游離酶低，其原因可能有以下幾個(gè)方面：酶分子 在固定化過(guò)程中，其三維空間構(gòu)象甚至是活性中心區(qū)域發(fā)生改變；固定化后，由于空間位阻 效應(yīng)影響了酶活性中心對(duì)底物的有效定位；包埋固定化酶被高分子材料包裹，增加了底物 與酶接近的難度。有時(shí)，酶在固定化后其活力會(huì)有所提高，其原因可能是固定化過(guò)程使酶被 化學(xué)修飾，或者使酶產(chǎn)生了有利的催化構(gòu)象，或者酶的穩(wěn)定性被改善。
[0027] 大多數(shù)固定化酶的穩(wěn)定性，如熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、對(duì)有機(jī)試劑及酶劑的穩(wěn)定性、 貯存穩(wěn)定性以及操作穩(wěn)定性等會(huì)比游離酶有所提高，這也是固定化酶適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用的最關(guān) 鍵的優(yōu)勢(shì)之一。對(duì)于游離酶而言，隨著溫度的升高，維持酶分子穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用力，如疏水 相互作用，氫鍵，離子相互作用以及范德華力等會(huì)被減弱，導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，進(jìn)而造成 酶的失活。而將酶進(jìn)行固定化后，由于載體的限制作用，酶分子的伸展變形受到阻礙，因此 其穩(wěn)定性得到了提高。
[0028] 溫度對(duì)酶的活力具有雙重影響。一方面，同化學(xué)反應(yīng)一樣，升高溫度可以提高反應(yīng) 速率；另一方面，由于酶本身是蛋白質(zhì)，隨著溫度的升高，酶會(huì)逐漸變性失活。由于大多數(shù)情 況下酶經(jīng)過(guò)固定化后的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，因此其最適反應(yīng)溫度往往會(huì)升高，這在實(shí)際應(yīng)用中 具有重要意義。
[0029] 酶被固定化后，其催化反應(yīng)的最適pH值常常發(fā)生偏移。其原因主要是微環(huán)境，如 酶和載體表面電荷性質(zhì)的影響導(dǎo)致酶的微環(huán)境與主體溶液之間的氫離子濃度產(chǎn)生差異。一 般來(lái)說(shuō)，帶負(fù)電荷的載體如陰離子聚合物所制備的固定化酶，其最適pH要比游離酶偏高， 這是因?yàn)殛庪x子聚合物載體會(huì)吸引溶液中的陽(yáng)離子〔包括Η十）附著于它的表面，結(jié)果使固 定化酶周?chē)臐舛缺韧獠恐黧w溶液高，即偏酸，這樣外部溶液的ΡΗ值必須向堿性方向 偏移才能抵消微環(huán)境的作用，使酶表現(xiàn)出最大活力。反之，使用帶正電荷的載體對(duì)酶進(jìn)行固 定化時(shí)，其固定化酶的最適pH值往往向酸性偏移。
[0030] 酶在固定化過(guò)程中，載體的結(jié)構(gòu)以及酶與載體之間的結(jié)合方式都會(huì)使酶蛋白的高 級(jí)結(jié)構(gòu)或底物一酶之間的親合力發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致酶催化反應(yīng)米氏常數(shù)發(fā)生改變。
[0031] 固定化對(duì)酶的底物選擇性也會(huì)產(chǎn)生影響。例如，酶經(jīng)過(guò)固定化后，由于立體障礙顯 著增加，大分子底物與酶的接觸受到阻礙，使酶的催化活力難以發(fā)揮出來(lái)。如用CM-纖維 素對(duì)糖化酶進(jìn)行共價(jià)結(jié)合固定化后，所得固定化酶對(duì)分子量為8000的直鏈淀粉的催化活 力下降23%，對(duì)分子量為500000的直鏈淀粉活力下降85-87%，但對(duì)小分子底物化合物的 催化活力則幾乎沒(méi)有變化。
[0032] 另外，酶固定化后，其立體選擇性也會(huì)發(fā)生改變。通過(guò)固定化技術(shù)來(lái)提高酶的立體 選擇性在手性化合物的合成領(lǐng)域具有十分重要的意義。
[0033] 固定化酶的制備方法分為載體結(jié)合法、包埋法、交聯(lián)法三種。隨著固定化酶技術(shù)的 發(fā)展，越來(lái)越多的研究者致力于酶固定化的研究
[0034] 共價(jià)鍵結(jié)合法：共價(jià)鍵結(jié)合法是將酶與不溶性載體以共價(jià)鍵結(jié)合的方法，此法研 究較為成熟。最常見(jiàn)的共價(jià)鍵結(jié)合反應(yīng)基團(tuán)包括氨基、羧基或酪氨酸和組氨酸的芳環(huán)。此 法的優(yōu)點(diǎn)是酶與載體結(jié)合牢固，不易脫落，但因反應(yīng)條件較為劇烈，易引起酶蛋白空間構(gòu)象 變化，破壞酶的活性部位，因此往往不能得到比活高的固定化酶。
[0035] 共價(jià)鍵結(jié)合法可分為以下幾種：
[0036] (1)重氮化法：重氮化法的原理為，具有芳香族氨基的水不溶性載體先在稀鹽酸 和亞硝酸鈉中進(jìn)行反應(yīng)，稱為重氮鹽化合物，然后再與酶發(fā)生偶合反應(yīng)，得到固定化酶。酶 蛋白中的游離氨基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基等參與此反應(yīng)。尤其是酪氨酸含量較高 的木瓜蛋白酶、脲酶、葡聚糖氧化酶、堿性磷酸酯酶、β -葡萄糖苷酶等能與多種重氮化載體 連接，獲得活性較高的固定化酶。常用的載體有：多糖類(lèi)的芳族氨基衍生物，氨基酸的共聚 體，聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、乙烯二馬來(lái)酸共聚體，多孔玻璃、陶瓷等。
[0037] (2)烷基化和芳基化法：該法是以鹵素為功能基團(tuán)的載體與酶蛋白的氨基或巰基 發(fā)生烷基化或芳基化反應(yīng)而形成固定化酶。常用的載體為鹵乙酰、三嗪基或鹵異丁烯基衍 生物。
[0038] (3)溴化氰法：溴化氰法原理是多糖類(lèi)載體在堿性條件下用溴化氰活化時(shí)，產(chǎn)生 少量不活波的氨基甲酸衍生物和大量的亞氨基碳酸酯衍生物，后者再與酶共價(jià)結(jié)合為固 定化酶，其中異脲型是主要生成物。它不局限于酶，可以廣泛應(yīng)用于機(jī)體成分的固定化。 天然高分子材料一般無(wú)毒性、傳質(zhì)性能好，常見(jiàn)的有瓊脂、海藻酸鈉、殼聚糖等。1978年， Subramanian等用徑CNBr活化和堿處理的纖維素載體固定青霉素?；?，青霉素?；傅?固定化效率為80?85%。固定化酶裂解60g/L的青霉素 G鉀鹽10次以上，沒(méi)有觀察到活性 損失。合成的高分子材料主要有聚丙烯氰類(lèi)、聚丙烯酰胺、凝膠聚丙烯酸類(lèi)聚合物等。1998 年，韓輝對(duì)青霉素酰化酶在聚丙烯纖維上的固定化進(jìn)行了許多研究，將巨大芽胞桿菌青霉 素?；敢怨矁r(jià)鍵結(jié)合的方式偶聯(lián)于聚丙烯氰纖維載體制成固定化青霉素?；福馇?霉素 G活性高達(dá)2000U/g，重復(fù)使用20次，保留活性80 %，合成頭孢羥氨芐的活性達(dá)153U/ g，重復(fù)50批次，保留活性為83. 9 %。
[0039] (4)載體交聯(lián)法：載體交聯(lián)法的原理為載體與酶蛋白發(fā)生共價(jià)結(jié)合或在雙（多） 功能試劑存在下載體與酶直接發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而形成固定化酶。常用的載體有氨基乙基纖維 素、DEAE-纖維素、瓊脂糖的氨基衍生物、殼聚糖、氨基乙基聚丙烯酰胺等。最常用的雙功能 試劑為戊二醛，此外還可使用甲苯-2,4-二異氰酸酯等。
[0040] (5)其它固定化方法
[0041] 除上述固定化方法外，還可以采用肽鍵結(jié)合法、鈦螯合法、硫醇-二硫化物的互換 反應(yīng)等方法來(lái)進(jìn)行酶的固定化。
[0042] 交聯(lián)法：交聯(lián)法是使用雙功能試劑或多功能試劑與酶分子間進(jìn)行交聯(lián)的固定化方 法。作為交聯(lián)劑的有形成希夫堿的戊二醛，形成肽鍵的異氰酸酯，發(fā)生重氮偶合反應(yīng)的雙重 氮聯(lián)苯胺或N，N，-乙烯雙馬來(lái)亞胺等，其中戊二醛最為常用。交聯(lián)法存在酶與載體結(jié)合牢 固的優(yōu)點(diǎn)，但是由于交聯(lián)反應(yīng)比較劇烈，固定化酶活回收率一般比較低。
[0043] 核酸酶的應(yīng)用使細(xì)胞基質(zhì)DNA被水解成小片段甚至寡核苷酸片段后在疫苗的純 化過(guò)程中很容易去除，大大降低了殘留DNA的含量，提高了疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量。保證了安全 性。同時(shí)與疫苗顆粒相比，核酸酶是小分子蛋白質(zhì)，在去除血清蛋白的過(guò)程中也很容易去 除。然而核酸酶的使用是直接加入到疫苗溶液中，終產(chǎn)品可以控制含量，但無(wú)法完全避免。 核酸酶是外源性蛋白，極微量的殘留都有可能引發(fā)個(gè)別接種者出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，導(dǎo)致臨床不 測(cè)事件發(fā)生。
[0044] 因此非常有必要開(kāi)發(fā)一種既能有效分解核酸，降低產(chǎn)品中細(xì)胞DNA的殘留量，又 能避免核酸酶殘留在終產(chǎn)物中的固定化核酸酶產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0045] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0046] -種固定化核酸酶，由核酸酶和固相載體組成，固定化核酸酶由核酸酶通過(guò)共價(jià) 鍵與固相載體上的基團(tuán)相連接而成。
[0047] 本發(fā)明米用的核酸酶是具有水解各種核酸分子，如DNA、RNA、染色體DNA、病毒核 酸的多功能核酸酶，特別是粘質(zhì)沙雷氏菌非特異性核酸內(nèi)切酶，尤其是適合于大量制備的 重組粘質(zhì)沙雷氏菌非特異性核酸內(nèi)切酶。
[0048] 本發(fā)明的固定化核酸酶，采用的固相載體包括有機(jī)高分子，如纖維素、瓊脂糖、離 子交換樹(shù)脂；天然高分子，如海藻酸、角叉菜膠、膠原、幾丁質(zhì)、殼聚糖；合成高分子，如聚丙 烯酰胺、聚酰胺、聚氨酯；無(wú)機(jī)載體。優(yōu)選的是交聯(lián)瓊脂糖凝膠，如瓊脂糖Sephar〇Se4B，瓊 脂糖 SepharoseCL-6B。
[0049] 本發(fā)明的固定化核酸酶的粒徑為10?200μπι，核酸酶與載體的結(jié)合比例為0. 1? 20mg/lg凝膠，優(yōu)選的5?15mg/lg凝膠，特別優(yōu)選的8?12mg/lg凝膠。
[0050] 本發(fā)明的固定化核酸酶的活性大于500U/g，作用的pH范圍為6?8,最適作用溫 度為37°C。
[0051] 本發(fā)明一種固定化核酸酶的方法，首先取帶有活潑基團(tuán)的載體，用活化劑活化載 體，將核酸酶氨基與活化載體相連接得到固定化核酸酶。
[0052] 本發(fā)明固定化核酸酶的制備方法，核酸酶與載體結(jié)合反應(yīng)的比例為5?50mg/lg 載體，優(yōu)選的是10?20mg/lg載體，特別優(yōu)選的是10?15mg/lg載體。。
[0053] 本發(fā)明固定化核酸酶的制備方法，載體的活化采用溴化氰。
[0054] 本發(fā)明固定化核酸酶的制備方法，載體的活化采用環(huán)氧氯丙烷。
[0055] 本發(fā)明固定化核酸酶的制備方法，核酸酶與載體結(jié)合的溫度為4°C?30°C，優(yōu)選 的是4°C?25°C，特別優(yōu)選的是4°C?8°C。
[0056] 本發(fā)明固定化核酸酶的制備方法，核酸酶與載體結(jié)合的時(shí)間為12?36小時(shí)，優(yōu)選 的為16?24小時(shí)。 具體實(shí)施例
[0057] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但是并非限定本發(fā)明。
[0058] 實(shí)施例一核酸酶與瓊脂糖Sepharose_4B的結(jié)合
[0059] 取適量的Sepharose_4B凝膠，于G3砂芯漏斗內(nèi)抽去保護(hù)液，抽濾用真空泵，稱濕 重50g凝膠Sepharose-4B，用500ml，0. 5mol/L NaCL溶液淋洗，除去凝膠內(nèi)的保護(hù)劑，用蒸 餾水洗凈。
[0060] 在通風(fēng)廚內(nèi)，戴上橡皮手套，小心稱取15g BrCN，加入15ml乙腈將其溶解。
[0061] 將50g凝膠轉(zhuǎn)移到一個(gè)500ml的燒杯中，加入75ml0. 2mol/L，ρΗ10· 0的 Na2C03-NaHC03緩沖液，然后將燒杯放置冰浴中，用攪拌器緩慢攪拌。取一支滴管向燒杯內(nèi) 滴加 BrCN溶液使它與S印harose-4B凝膠反應(yīng)，同時(shí)取另一支滴管向燒杯內(nèi)滴加6mol/L NaOH，使反應(yīng)液中的pH維持在10. 0左右，用pH計(jì)測(cè)定，將BrCN加完后繼續(xù)反應(yīng)5分鐘。此 時(shí)反應(yīng)液中的pH不再下降，維持在10. 0,停止反應(yīng)。
[0062] 將活化反應(yīng)物迅速轉(zhuǎn)移到G3砂芯漏斗內(nèi)抽濾，抽濾瓶?jī)?nèi)預(yù)先加入一定量的固 體硫酸亞鐵，以破壞濾液中未反應(yīng)的BrCN，用1000ml預(yù)冷的蒸餾水淋洗，最后浸泡在 100ml0. lmol/L，pH9. 5 的 Na2C03-NaHC03 緩沖液中準(zhǔn)備偶聯(lián)。
[0063] 將核酸酶溶液濃縮到10mg/ml以上，對(duì)0· lmol/L，ρΗ9· 5的Na2C03-NaHC03緩沖液 充分透析，測(cè)定蛋白濃度l〇mg/ml。
[0064] 將已經(jīng)活化處理好的Sepharose_4B凝膠轉(zhuǎn)移到一個(gè)250ml的錐形瓶?jī)?nèi)，加入50ml 核酸酶溶液，混勻，在4°C的振蕩偶聯(lián)20?24小時(shí)，終止偶聯(lián)。
[0065] 將偶聯(lián)物轉(zhuǎn)移到G3砂芯漏斗內(nèi)，用500ml，0. 5mol/LNaCL溶液抽濾，淋洗，以除去 未被偶聯(lián)的核酸酶，取一個(gè)干凈的抽濾瓶收集濾液，測(cè)定蛋白濃度〇. 〇2mg/ml，根據(jù)體積計(jì) 算未偶聯(lián)的核酸酶量，計(jì)算偶聯(lián)效率98%，核酸酶結(jié)合量9. 8mg/g凝膠。凝膠用500ml蒸餾 水洗，用150ml0. lmol/L甲酸-0· 5mol/L氯化鉀，ρΗ2· 5甲酸混合液洗，最后用蒸饋水洗至 約ρΗ6. 5即可。
[0066] 將凝膠轉(zhuǎn)移到250ml小燒杯內(nèi)，用150ml0. 5mol/L氯化鉀-0· 05mol/L氯化 鈣-0. lmol/LTris-CL，pH7. 8緩沖液浸泡20分鐘后置4°C冰箱備用。
[0067] 實(shí)施例二核酸酶與瓊脂糖SepharoseCL_6B的結(jié)合
[0068] 取保存于20%乙醇中的Sepharose CL-6B介質(zhì)50mL，用過(guò)量蒸饋水反復(fù)洗漆除去 乙醇后，置于G3燒結(jié)玻璃漏斗中真空抽干5min;稱取10g抽濾后的介質(zhì)，依次用20^,50% 和70%的二甲基亞砜（Dimethyl Sulf〇xide，DMS0)水溶液清洗，每次清洗后真空抽于清洗 液；向處理后的介質(zhì)中加入6. 5ml2mol/L Na0H、l，5ml環(huán)氧氯丙燒￠0^151111561% 1，4_二 氧六環(huán)。介質(zhì)的懸浮液于恒溫空氣浴搖床上在170r/min下振蕩反應(yīng)2h，反應(yīng)溫度為45°C . 反應(yīng)完后用大量去離子水沖洗，直至清洗液中無(wú)環(huán)氧基檢出。清洗液中環(huán)氧基采用硫代硫 酸鹽測(cè)定，以酚酞為指示劑，如清洗液變紅，說(shuō)明有氫氧根離子生成，清洗液中存在游離的 環(huán)氧基，需要再加去離子水沖洗至溶液不變色為止。用20ml0. lmol/L，pH9. 5碳酸鈉緩沖液 淋洗后備用。
[0069] 將已經(jīng)活化處理好的Sepharose-CL_6B10g凝膠轉(zhuǎn)移到一個(gè)250ml的錐形瓶?jī)?nèi)，力口 入已對(duì)0. lmol/L，pH9. 5的Na2C03-NaHC03緩沖液充分透析，濃度為8. 5mg/ml的核酸酶溶液 12ml，混勻，在室溫振蕩偶聯(lián)16?24小時(shí)，終止偶聯(lián)。
[0070] 將偶聯(lián)物轉(zhuǎn)移到G3砂芯漏斗內(nèi)，用200ml，0. 5mol/L NaCL溶液抽濾，淋洗，以除 去未被偶聯(lián)的核酸酶，取一個(gè)干凈的抽濾瓶收集濾液，測(cè)定蛋白濃度為〇. 〇6mg/ml，根據(jù)體 積計(jì)算未偶聯(lián)的核酸酶量，計(jì)算偶聯(lián)效率88. 23%。核酸酶結(jié)合量為9mg/g凝膠。凝膠用 500ml蒸饋水洗，用lOOmlO. lmol/L甲酸-0· 5mol/L氯化鉀，ρΗ2· 5甲酸混合液洗，最后用蒸 餾水洗至約ΡΗ6. 5即可。
[0071] 將凝膠轉(zhuǎn)移到100ml小燒杯內(nèi)，用50ml0. 5mol/L氯化鉀-0· 05mol/L氯化 鈣-0. lmol/LTris-CL，pH7. 8緩沖液浸泡20分鐘后置4°C冰箱備用。
[0072] 實(shí)施例三環(huán)氧基修飾密度的定量分析
[0073] 瓊脂糖凝膠的環(huán)氧基修飾密度采用硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定，經(jīng)去離子水清洗后 的活化介質(zhì)置于G3漏斗中真空抽干5min，隨后稱取0. 5g置于磨口錐形瓶中并加入約 3mLl. 3mol/L硫代硫酸鈉和酚酞指示劑1?2滴，錐形瓶封口后于室溫下振蕩反應(yīng)30min. 反應(yīng)后的溶液用〇. lmol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至溶液由紅色變?yōu)闊o(wú)色為止.根據(jù)消耗的 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，計(jì)算環(huán)氧基修飾密度：S = MMVcrVD/W/p = 91. 2
[0074] 其中：S為環(huán)氧基修飾密度（mol/mL);
[0075] Μ 為 HC1 濃度（mol/L);
[0076] V0, VI為滴定前、后HC1的體積（mL);
[0077] P 為介質(zhì)密度（1. 02g/mL)。
[0078] 實(shí)施例四纖維素載體固定化核酸酶
[0079] 在室溫用10ml0. 5mol/L的NaOH浸泡微晶纖維3h，然后用去離子水漂洗至中性，吸 干載體水分后再用丙酮進(jìn)一步干燥。加入吡啶，并在25°C、250r/min恒溫水浴振蕩器中作 用3h，之后向載體吡啶混合物中加入甲苯磺酰氯（lg甲苯磺酰氯溶解于2ml丙酮），繼續(xù)在 25°C、100r/min恒溫水浴振蕩器中作用3h，接著用丙酮清洗，最后用5mmol/L的HCL洗去多 余的甲苯磺酰氯和吡啶。處理后的載體保存于5mmol/L的HCL放4°C冰箱備用。
[0080] l〇g活化載體用水清洗3次，緩沖液洗滌，將載體加入20ml核酸酶溶液中，酶濃度 6. 7mg/ml (pH4. 5乙酸緩沖液），于100r/min，18?的恒溫水浴振蕩器中固定12?24h，緩沖 液洗滌3次，共收集100ml，測(cè)定蛋白濃度為0. 17mg/ml，酶的回收率為12. 7%。核酸酶結(jié)合 量11. 7mg/g纖維素。
[0081] 實(shí)施例五殼聚糖載體固定化核酸酶
[0082] 30g殼聚糖溶解在600mL0. 25mol/L的乙酸溶液中，室溫下劇烈攪拌4h，粘稠 狀液體通過(guò)三層棉布過(guò)濾除去不溶性雜質(zhì)，然后逐漸滴加 lmm〇l/L Na0H2L，堿性條件下 (pH8. 0?10. 0)使殼聚糖沉淀，混合液在去離子水中透析3d，離心分離使絕大部分的殼聚 糖沉淀下來(lái)，雙蒸水洗脫，真空冷凍干燥，在研缽中將其粉碎成粉末狀，備用。
[0083] 取50ml核酸酶溶液，加入10g處理好的脫乙酰殼聚糖中，磁力攪拌30min，滴加一 定濃度的戊二醛溶液60mL，恒溫?cái)嚢枰欢〞r(shí)間，與4°C冰箱中交聯(lián)12h，最后用相應(yīng)pH值的 緩沖溶液淋洗，抽干，即得固定化核酸酶。
[0084] 實(shí)施例六固定化核酸酶的活性分析
[0085] 核酸酶能夠?qū)NA消化分解為3?8b的寡核苷酸鏈。采用分光光度法進(jìn)行酶活 性測(cè)定。配制以下活性測(cè)定試劑：
[0086] 溶液A:稱取3.0gTris溶解于450ml蒸餾水中，用LOmol/LHCL調(diào)pH為8.0， 定容至 500ml，即為 50mM Tris-HCL ρΗ8·0 的溶液。取 100ml50mM Tris-HCL ρΗ8·0,加入 20mgMgCl2,10mg BSA，完全溶解后4°C冰箱備用。
[0087] 溶液B : lOmg魚(yú)精DNA用10ml溶液A溶解，魚(yú)精DNA的濃度為lmg/ml。并經(jīng)超聲 處理。
[0088] 溶液C :0· 8ml高氯酸加蒸餾水至20ml。
[0089] 取溶液B25ml，置于37°C水浴中，加入固定化核酸酶50mg，振蕩保溫15、30、45、60 分鐘，分別取樣〇. 5ml，加入已含有0. 5ml高氯酸溶液的小管中，混勻后置冰浴30-60分鐘， 然后4°C離心（10, 000rpm,5分鐘），轉(zhuǎn)移上清液lml置于新的小管中，以空白管上清液調(diào) 零，測(cè)定0D260nm的吸收值。
[0090] 活性單位定義為37°C，30分鐘，魚(yú)精DNA吸光值A(chǔ)260增加1. 0所需的酶量為一個(gè) 活性單位（相當(dāng)于完全消化37 μ g魚(yú)精DNA的酶量）。
[0091]

【權(quán)利要求】
1. 一種固定化核酸酶，其特征在于：由核酸酶和固相載體組成，固定化核酸酶由核酸 酶通過(guò)共價(jià)鍵與固相載體上的基團(tuán)相連接而成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化核酸酶，其特征在于：核酸酶是重組的粘質(zhì)沙雷氏菌 非特異性核酸內(nèi)切酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化核酸酶，其特征在于：固相載體包括有機(jī)高分子，如纖 維素、瓊脂糖、離子交換樹(shù)脂；天然高分子，如海藻酸、角叉菜膠、膠原、幾丁質(zhì)、殼聚糖；合 成高分子，如聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚氨酯；無(wú)機(jī)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化核酸酶，其特征在于：固定化核酸酶的粒徑為10? 200 μ m，核酸酶與載體的結(jié)合比例為0. 1?20mg/lg載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化核酸酶，其特征在于：固定化核酸酶的活性大于500U/ g，作用的pH范圍為6?8,最適作用溫度為37°C。
6. -種制備權(quán)利要求1?5任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的固定化核酸酶的方法，其特征在于： 首先取帶有活潑基團(tuán)的載體，用活化劑活化載體，將核酸酶氨基與活化載體相連接得到固 定化核酸酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化核酸酶的制備方法，其特征在于：核酸酶與載體結(jié)合 反應(yīng)的比例為5?50mg/lg載體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化核酸酶的制備方法，其特征在于：載體的活化采用溴 化氰或者環(huán)氧氯丙烷。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化核酸酶的制備方法，其特征在于：核酸酶與載體結(jié)合 的溫度為4°C?30°C。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化核酸酶的制備方法，其特征在于：核酸酶與載體結(jié)合 的時(shí)間為12?36小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N11/12GK104232613SQ201310231034
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月7日
【發(fā)明者】劉國(guó)安, 徐輝, 方芳 申請(qǐng)人:杭州俊豐生物工程有限公司