天然蠶絲纖維制成的制品的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蠶絲（silk)加工領(lǐng)域，尤其是提供醫(yī)用蠶絲材料。
【背景技術(shù)】
[0002] 蠶絲用于生物醫(yī)學縫線已有幾十年歷史，觀察到了潛在的宿主免疫反應。這可能 是蠶絲在過往的生物醫(yī)學應用中不予考慮的主要原因。引發(fā)免疫反應的主因與絲膠蛋白 (sericin)有關(guān)（綜述：Altman等，Biomaterials24 (2003) ,401-416)。故，從生絲（raw silk)徹底除去絲膠蛋白，是組織工程化和再生醫(yī)學應用中制備絲織物、但避免生物相容性 問題的關(guān)鍵步驟。
[0003] 大多數(shù)情況下，蠶絲是從家蠶（Bombyxmori)幼蟲的蠶苗獲得的。單個蠶苗纖維 由被稱為絲膠蛋白的膠狀蛋白包繞兩個絲素蛋白（fibroin)鏈核心而成，其中由絲膠蛋白 將多個絲素蛋白纖維互相固定。絲素蛋白和絲膠蛋白分別占約75和25%wt.。
[0004] 蠶絲絲素蛋白在形態(tài)上以高度有序的晶態(tài)纖維結(jié)構(gòu)為特征。這種結(jié)構(gòu)使它不溶于 諸如水、乙醇、稀酸和堿等大多數(shù)溶劑。與絲素蛋白相反，球狀的絲膠蛋白易溶于水性溶劑。 紡織業(yè)對于去除絲膠蛋白也有極大興趣，因為蠶絲服裝的光澤會被絲膠掩蓋。因此，不光是 生物材料領(lǐng)域要研宄蠶絲，紡織業(yè)也在尋找最佳的脫膠方法。這導致出現(xiàn)多種脫膠方法，包 括，堿性溶液（不加表面活性劑）、尿素、酒石酸、檸檬酸、或諸如木瓜蛋白酶或內(nèi)肽酶等酶 類。用硼酸加硼酸鹽作為脫膠劑的可能性在紡織工程化領(lǐng)域已有人描述。在這些研宄中， 硼酸鹽緩沖液被單獨用于使未經(jīng)處理的原料蠶絲纖維脫膠（Jiang等MaterialsLetters 60/7(2006),919-925)或與表面活性劑組合使用（JP2 269870A)或作為所謂"洗毛劑 (scouringagent)"用于單根纖維或梭織物（wovenfabric)。在后一種情況中，硼酸鹽緩 沖液被用于擦洗纖維表面，使之易于接受諸如漂白、染色等其它紡織工程化處理、但不必完 全除去絲膠蛋白（JP1 229803A)。這類制品因此仍包含較多絲膠蛋白（例如，超過絲膠蛋 白總量的半數(shù)仍存在于制品中）。絲膠蛋白的不完全去除對于醫(yī)學領(lǐng)域而言是不夠的，因為 殘余的絲膠蛋白會引發(fā)免疫反應。因此，這方面與本申請的領(lǐng)域無關(guān)。
[0005] 由于其應用非常廣泛且功能穩(wěn)定，硼酸鹽緩沖液在傳統(tǒng)上用于多項生物醫(yī)學和生 物技術(shù)應用。在此上下文中，應注意硼酸鹽緩沖液已用在基于酶的脫膠方法中將特定蛋白 酶的pH值保持在最佳工作范圍（CN102605439A(摘要））。這意味著該緩沖液并未將其自 身當做脫膠劑，而是當做給脫膠酶提供最佳PH工作范圍的試劑。同樣地，硼酸也已用于在 使用肥皂的紡織工程化脫膠工藝中控制pH(FR2528076A1)。
[0006] 傳統(tǒng)的脫膠法是將生絲置于有或無表面活性劑的堿性溶液中煮沸，表面活性劑有 助于使絲膠蛋白從纖維結(jié)構(gòu)中脫離出來。值得注意的是，通常是用0.02M碳酸鈉溶液在 KKTC處理30-60min來完成脫膠，尤其是在組織工程化研宄領(lǐng)域。這種堿性脫膠常常以批 量處理，使用的是肥皂或表面活性劑加堿。
[0007] 但是，不同的研宄顯示，絲膠蛋白的去除引起蠶絲纖維磨損，削弱其結(jié)構(gòu)特性，難 以將它們紡織改造（如編織或編辮）成適合組織工程化應用的骨架（LiU等J.Biomed. Mater.Res.BAppl.Biomater. 82 (2007) ,129-138)。因此，在一些研宄中，先構(gòu)建蠶絲骨 架再進行脫膠工藝（Fan等，Biomaterials30 (2009) ,4967-4977;Fan等，Biomaterials 29 (2008)，3324-3337;Chen等，Biomaterials29 (2008)，3683-3692)。但應注意，所有這些 研宄的骨架基礎(chǔ)都是"普通（plain) "網(wǎng)格（Chen等，Biomaterials29 (2008)，3683-3692)， 厚度不超過500ym。而且，他們描述的網(wǎng)都以低水平幾何層級為特征，例如只有簡單的紡織 編織技術(shù)。與高層級紡織工程化改造的骨架相比，單個的蠶絲纖維能很好地暴露于脫膠液， 并可以因此用傳統(tǒng)的碳酸鈉溶液脫膠（見圖IlA和11B)。
[0008] Liu等，2007提議了一種增加無絲膠蛋白型纖維的加工特性、但勞動強度較大的 方案。此研宄描述了一種通過將不含絲膠蛋白的蠶絲纖維與明膠進行化學交聯(lián)、而用明膠 替代絲膠蛋白的方法。
[0009]Altman等（Biomaterials23 (2002)，4131-4141)探尋了 天然香絲絲素蛋白纖 維（紗線）在有動態(tài)機械加載的培養(yǎng)物中作為前交叉韌帶（ACL)組織工程化的3D骨架 的潛力：提取絲膠蛋白后，蠶絲絲素蛋白纖維抒成6束纜繩基體（wire-ropematrices)， 與由并行纖維形成的同等基體相比，具有改進的彈性、但不犧牲拉伸強度。這種基 體與天然ACL中膠原纖維相似的層級結(jié)構(gòu)（hierarchalstructure)，而且力學特性 (mechanicalproperties)與天然人ACL在強度、勁度、屈服點（yieldpoint)、和斷裂處的 百分比延長方面相當。此外，這種纜繩幾何結(jié)構(gòu)增加了用于細胞附著的表面積和胞外基體 (ECM)沉積，弱化了質(zhì)量轉(zhuǎn)移的限制，都是些引起新組織形成的因素。蠶絲絲素蛋白骨架支 持成人骨髓來源的間質(zhì)干細胞（MSCs)進行附著、散播、增殖和分化。
[0010] 盡管蠶絲在組織工程學方面的應用很急迫，而且多個生物醫(yī)學研宄小組和工業(yè)研 宄小組正進行大量的脫膠工藝研宄，仍需要了解具有高層級幾何結(jié)構(gòu)的紡織工程化構(gòu)建物 脫膠有哪些選擇。因此，目前尚缺能從緊密的高層級原料家蠶蠶絲纖維基體，例如打算用于 前交叉韌帶組織工程化的那些，除去絲膠蛋白的脫膠方法。
[0011] 與之截然相反，提供醫(yī)用蠶絲材料的方法幾乎是唯一的：將蠶絲纖維于含水體系 中徹底溶解，然后通過諸如離心（spinning)、電紡絲（electrospinning)、由水性系統(tǒng)或有 機溶劑系統(tǒng)注漿成形（casting)、凝膠化、起泡等等，將該蠶絲溶液再加工為所需形式的材 料（V印ari等，2007,US5, 252, 285A) 〇
[0012] 但這些由絲素蛋白溶液再加工出的蠶絲材料與天然固有蠶絲結(jié)構(gòu)不同，如機械強 度減弱。另一方面，蠶絲纖維已廣泛用作傷口縫合線；但這些纖維在用之前必須脫膠，因為 絲膠蛋白會引起副作用（Kaplan等，Biomaterials24(2003)，401-416)。有關(guān)蠶絲縫線的 最主要生物相容性問題的報道是關(guān)于生絲（virginsilk)，其中的絲膠蛋白仍然覆蓋核心 蠶絲絲素蛋白纖維。哮喘的誘導和IgE水平的上調(diào)可見于用生絲縫合的患者。在Dewair 等（J.AllergyClin.Immunol. 76(1985)，537-542)的研宄中，經(jīng)皮膚測試，特異性IgE的峰 值以及蠶絲反應性患者中的陽性反應程度可見于具有最高絲膠蛋白含量（在所測試的蠶 絲樣品中）的組。而且，原生蠶絲纖維周圍炎癥細胞包括巨噬細胞的活化已得到證實，而在 不含絲膠蛋白或絲素蛋白纖維包裹了明膠的對照組中，未發(fā)現(xiàn)活化。顯然，植入的生物醫(yī)學 物不應引起這類外源機體反應。因此由蠶絲制得的生物材料必須不含絲膠蛋白。但是，由 于脫膠的蠶絲纖維在形成最終生物材料（例如維系帶），尤其三維生物材料的過程中的負 面特性，需要有改進的方法來提供基于蠶絲的生物材料。這些方法應允許穩(wěn)健、可再現(xiàn)且可 靠的制備方法；另一方面，這些制品應基本不含絲膠蛋白，從而允許制得的生物材料能加以 應用，尤其醫(yī)用。因此，本發(fā)明的一個目標是提供這樣的方法，這樣的方法應該也特別適于 醫(yī)學目的，尤其適于療法和外科手術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 因此，本發(fā)明提供了制備三維蠶絲制品的方法，其中天然蠶絲纖維形成三維蠶絲 制品，所形成的蠶絲制品經(jīng)歷脫膠步驟，在該步驟中，用硼酸鹽緩沖液作為脫膠劑，而且所 形成的蠶絲制品優(yōu)選與含水乙醇緩沖液接觸后再進行脫膠步驟。
[0014] 本發(fā)明的方法允許蠶絲有效脫膠，尤其三維制品脫膠?，F(xiàn)有技術(shù)的脫膠制品仍含 有至少1% (w/w)(或甚至至少2% (w/w))的絲膠蛋白，本發(fā)明的制品基本不含絲膠蛋白， 即，絲膠蛋白含量低于0.1 % (w/w)，優(yōu)選低于0.05% (w/w)，尤其低于0.01 % (w/w)(實踐 中也取決于絲膠蛋白檢測方法，有不同的檢測極限）。例如，本發(fā)明的制品在電鏡下看不到 任何絲膠蛋白殘留或在絲膠蛋白染色實驗中看不到絲膠蛋白著色。顯然，絲膠蛋白含量高 的紡織制品（如JP2 269870A或JP1 229803A公開的那些不適于醫(yī)用，因此原則上排 除在本發(fā)明之外（與絲膠蛋白如何（部分）去除無關(guān)）。
[0015] 在本發(fā)明過程中意外發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明的脫膠步驟，可以從天然蠶絲纖維制成的復 合三維蠶絲制品中有效去除絲膠蛋白。這允許由天然蠶絲纖維（其中絲膠蛋白仍是纖維的 一部分）制備三維制品，由于天然蠶絲纖維比脫膠的蠶絲纖維或（從絲素蛋白溶液）再加 工的蠶絲纖維有更好的操作特性（handlingproperties)，這提供了顯著的優(yōu)點和潛能。
[0016] 現(xiàn)有技術(shù)的方法如堿處理或蛋白酶處理等未報道能從蠶絲纖維成功脫膠（Fan 等，2008, 2009 ;Freddi等，2003)，與之相反，本發(fā)明的脫膠方法能獲得基本不含絲膠蛋白 的三維蠶絲制品?，F(xiàn)有技術(shù)的方法未能從高度扭曲的煒線（例如織物等材料中的高度扭曲 煒線）成功除去絲膠蛋白，而本發(fā)明的脫膠方法提供醫(yī)學應用所必需的絲膠蛋白去除。
[0017] 因此，有了本發(fā)明，就有可能先產(chǎn)生復雜三維蠶絲結(jié)構(gòu)再進行脫膠步驟。與應用脫 膠的蠶絲纖維或再加工的蠶絲纖維相比，這能提供